基于SECTM1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

基于sectm1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤免疫治疗生物医药技术领域，涉及特异性嵌合抗原受体免 疫细胞，具体涉及一种特异性靶向cd7的一种car，其修饰地免疫应答细胞，及 其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前癌症被认为是世界上各个国家的主要死亡原因及延长人类寿命的主 要障碍。根据世界卫生组织(who)2019年的统计，在183个国家中年龄为70岁之 前的人群中，癌症是第一或第二大死亡原因，严重威胁着人类的健康。到2020 年，全球估计有1930万新发病例和1000万例癌症患者死亡，根据目前癌症的发 病率估计到2040年，全球将会出现2840万例癌症新发病例(包括基底细胞癌除 外的非黑色素瘤皮肤癌)，比2020年增加47％，总体而言，世界范围内癌症的发 病率和死亡率负担正在迅速增长。据2020年全球肿瘤数据统计显示:血液病包 括白血病，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，将会有1,101,958新发病例，占 到肿瘤新发病例的5.7％；594,763死亡病例，占到癌症死亡病例的5.9％，从统 计数据来看，血液病依然严重威胁着人类的健康。
3.随着医学技术的发展，人类的寿命不断延长，在肿瘤的治疗上取得了很大 的进展，现在，手术，化疗，放疗，生物治疗等综合治疗手段的应用，使得癌 症患者的生存期不断延长，生存质量也取得了很大的提升。除了常规治疗手段， 免疫治疗也成为了治疗癌症的临床重要手段，越来越多的免疫治疗药物被批准 用于临床治疗，如针对免疫检查点抑制剂的pd1,pdl1单克隆抗体以及car-t细 胞治疗。嵌合抗原抗体受体(chimeric antigen receptor-t cell,car-t)t细 胞是指经基因修饰后，能以mhc非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活 化扩增的t细胞。其主要结构包括三类，即胞外的scfv识别结构域，此区域用 于对肿瘤细胞上的靶点进行识别结合；铰链区和跨膜结构域，主要来源于cd8 或cd28，将car锚定于细胞膜，且连接胞外识别域与胞内信号；胞内域，是激 活域，其数量和长度差异会影响car-t的抗肿瘤效果，目前常用的是一个激活 域加一个或多个共刺激结构域，cd3ζ是car胞内部分的常见特征，其能启动信 号以驱动t细胞的杀伤作用，而共刺激域主要来源于cd28受体家族或者tnf受体 家族如4-1bb,ox40或cd27，通过增强细胞因子分泌或者促进增殖及持久性也提 高car-t的杀伤效果。正常t细胞依赖于t细胞表面受体(t cell receptor,tcr) 及肿瘤细胞表面的主要组织相容复合物(major histocompatibility complex. mhc)结合的方式识别肿瘤细胞,而car-t细胞以不依赖于mhc的方式只依赖于 car这个结构来识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原(tumor associatedantigen，taa)，具有car对抗原识别的特异性及t细胞的杀伤特性。
4.过去这些年来，随着基因编辑，免疫及其他学科的综合快速发展，car-t 细胞治疗成为治疗血液病一个新的并取得不错疗效的治疗手段。car-t治疗恶 性肿瘤仍然是目前的研究热点，自1986年首次用肿瘤浸润淋巴细胞(tils)治疗 肿瘤，到1993年第一代car的研发，直至2017年fda首次批准car-t用于治疗复 发/难治性急性淋巴细胞白血病，car-t治疗
已经走过数年的历程。目前有三种 car-t被用于治疗肿瘤，包括2017年8月和10月被fda批准的kymriah和yescarta 被用于治疗复发/难治的急性淋巴细胞白血病及特定类型大b细胞淋巴瘤，及 2020年7月批准的tecartus被用于治疗成人套细胞淋巴瘤(mental celllymphoma,mcl)。car-t治疗主要用于血液病如急性淋巴细胞白血病，慢性淋 巴细胞白血病及多发性骨髓瘤的治疗，血液病中最常用且具有临床获益的靶点 是cd19，cd19 car-t细胞在体外进行设计并扩增，随后被注射到患者体内用于 杀伤cd19阳性的细胞。在目前car治疗的研究中，cd19在all,cll,nhl中都取得 了很好的进展，据统计car-t治疗all在成人中cr(completed response)率达 到83-93％，儿童中cr率达到67-90％；在弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)中cr率也达 到了43-54％；cll中达到21-29％，主要是在b细胞恶性肿瘤中取得了很好的疗效。 尽管完全缓解率很高，但仍然有部分患者在靶向cd19的car-t治疗后因为肿瘤 微环境的抑制作用和抗原逃逸现象出现复发。
5.因此，本领域迫切需要开发新的安全有效的治疗肿瘤等疾病的治疗靶点以 及相应的治疗方案。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种以sectm1受体为靶点的嵌合抗原受体免疫细 胞及其制备和应用方法。
7.在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)，其特征在于，所述 的car含有一胞外结合域，并且所述的胞外结合域包括基于seq id no:1所示氨基 酸序列的sectm1或其片段的结构，
8.并且，所述的胞外结合域能够特异性地与sectm1受体以配体受体方式结合。
9.在另一优选例中，所述的胞外结合域具有来源于sectm1的氨基酸序列。
10.在另一优选例中，所述的胞外结合域包括sectm1蛋白或其片段。
11.在另一优选例中，所述的sectm1蛋白片段包括sectm1蛋白的胞外区。
12.在另一优选例中，所述的胞外结合域包括sectm1蛋白或其片段。
13.在另一优选例中，所述的胞外结合域含有sectm1蛋白胞外部分。
14.在另一优选例中，所述胞外结合域包括野生型和突变型结构域。
15.在另一优选例中，所述胞外结合域的氨基酸序列如seq id no:1所示序列 的29-145位所示。
16.在另一优选例中，所述的sectm1蛋白片段包括sectm1蛋白的胞外区，所 述胞外区的氨基酸序列为对应于seq id no:1所示序列的29-145位。在另一 优选例中，所述的sectm1蛋白或其片段与包括cd7在内的sectm1受体具有特 异性结合。
17.在另一优选例中，所述的sectm1受体选自下组：cd7。
18.在另一优选例中，所述的结合分子选自下组：cd7。
19.在另一优选例中，所述的cd7是位于细胞膜上cd7。
20.在另一优选例中，所述的cd7来源于人或非人哺乳动物。
21.在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵 长动物(如猴)；优选为灵长动物。
22.在另一优选例中，所述的car的胞外结合域除了含有针对sectm1受体的第一胞 外
结构域之外，还包括针对额外靶点的第二胞外结构域。
23.在另一优选例中，所述的额外靶点为肿瘤特异性靶点。
24.在另一优选例中，所述的sectm1蛋白或其片段具有如seq id no:1所示 的氨基酸序列，或具有如seq id no:1所示序列的第1至145位或较佳地为 第29至145位的氨基酸序列。
25.在另一优选例中，所述的sectm1蛋白或其片段的氨基酸序列选自下组：
26.(i)如seq id no:1所示序列的第29至145位所示的序列；和
27.(ii)在如seq id no:1所示序列的第29至145位所示序列的基础上， 进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其n端或c端添加1 至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基， 从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如seq id no:1所示序列 的第29至145位所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、 ≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列与(i)所示的序列 具有相同或相似的功能。
28.在另一优选例中，所述car的结构如下式i所示：
29.l-eb-h-tm-c-cd3ζ-rp
ꢀꢀꢀ(i)30.式中，
31.各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；
32.l是无或信号肽序列；
33.eb是胞外结合域,所述胞外结合域特异性地结合于sectm1受体；
34.h是无或铰链区；
35.tm是跨膜结构域；
36.c是无或共刺激信号分子；
37.cd3ζ是源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；
38.rp是无或报告蛋白。
39.在另一优选例中，所述的报告蛋白rp为荧光蛋白(如绿色荧光蛋白、黄色荧 光蛋白、红色荧光蛋白)。
40.在另一优选例中，所述的报告蛋白rp为mkate2红色荧光蛋白。
41.在另一优选例中，所述的红色荧光报告蛋白rp(mkate2)中还包括位于其n 端的自剪切识别位点，优选地为t2a序列。在另一优选例中，所述的mkate2红色 荧光蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
42.在另一优选例中，所述的l是选自下组的蛋白的信号肽：cd8、cd28、gm-csf、 cd4、cd137、sectm1或其组合。
43.在另一优选例中，所述的l是cd8来源的信号肽。
44.在另一优选例中，所述l的氨基酸序列如seq id no:3所示。
45.在另一优选例中，所述的h是选自下组的蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、 或其组合。
46.在另一优选例中，所述的h是cd8来源的铰链区。
47.在另一优选例中，所述h的氨基酸序列如seq id no:4所示。
48.在另一优选例中，所述的tm是为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3 epsilon、
cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、 cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。
49.在另一优选例中，所述的tm是cd28来源的跨膜区。
50.在另一优选例中，所述tm的氨基酸序列如seq id no:5所示。
51.在另一优选例中，所述的c是选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、 cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、 icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2，或其组合。
52.在另一优选例中，所述的c是4-1bb来源的共刺激信号分子。
53.在另一优选例中，所述c的氨基酸序列如seq id no:6所示。
54.在另一优选例中，所述的源于cd3ζ的胞浆信号传导序列的氨基酸序列如seqid no:7所示。
55.在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体car的氨基酸序列如seq id no:8所 示。
56.在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第 一方面所述的嵌合抗原受体。
57.在另一优选例中，所述的核酸分子具有seq id no:9所述的核苷酸序列。
58.在本发明的第三方面，提供了一种载体，其特征在于，所述的载体含有如本 发明第二方面所述的核酸分子。
59.在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺 病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
60.在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
61.在另一优选例中，所述载体选自下组：ptomo慢病毒载体、plenti、plvth、 pljm1、phcmv、plbs.cag、phr、plv等。
62.在另一优选例中，所述的载体是ptomo慢病毒载体。
63.在另一优选例中，所述载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件 wpre、长末端重复序列ltr等。
64.在另一优选例中，所述载体包含如seq id no:9所示的核苷酸序列。
65.在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明 第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子 或表达如本发明第一方面所述的car。
66.在本发明的第五方面，提供了一种工程化免疫细胞，所述的免疫细胞含有如 本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核 酸分子或表达如本发明第一方面所述的car。
67.在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：t细胞、nk细胞、nkt 细胞、巨噬细胞、或其组合。
68.在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞是嵌合抗原受体t细胞(car-t细 胞)或嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)。
69.在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是car-t细胞。
70.在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞为cd7阴性或cd7低表达的。
71.在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞为cd7阴性的t细胞。
72.在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞为具有记忆细胞的表型的car-t 细胞。
73.在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是未经cd7阻断处理的。
74.在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第五方面所述的工程化免疫 细胞的方法，包括以下步骤：将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三 方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。
75.在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有 效性检测的步骤。
76.在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发 明第一方面所述的car、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所 述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工 程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
77.在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
78.在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
79.在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，较佳地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
80.在本发明的第八方面，提供了一种如本发明第一方面所述的car、如本发明第 二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第四方面所述 的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的用途，用于制备预 防和/或治疗sectm1受体异常表达相关的疾病的药物或制剂。
81.在另一优选例中，所述的sectm1受体包括但不限于cd7。
82.在另一优选例中，所述的sectm1受体异常表达相关的疾病包括但不限于肿瘤、 衰老、肥胖、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、感染性疾病等。
83.在另一优选例中，所述的sectm1受体异常表达相关的疾病包括：cd7异常表 达相关的疾病。
84.在另一优选例中，所述的cd7异常表达相关的疾病包括：肿瘤、衰老、心血 管疾病、肥胖等。
85.在另一优选例中，所述的疾病是cd7高表达的恶性肿瘤。
86.在另一优选例中，所述肿瘤包括血液肿瘤。
87.在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性 骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、淋巴瘤，或其组 合。
88.在另一优选例中，所述的血液肿瘤为经过治疗后复发的血液肿瘤。
89.在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、 或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。
90.在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象 施用有效量的如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述 的药物组合物。
91.在另一优选例中，所述疾病为sectm1受体异常表达相关的疾病。
92.在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
93.在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的car免疫细 胞
是来源于所述对象的细胞(自体细胞)。
94.在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的car免疫 细胞是来源于健康个体的细胞(异体细胞)。
95.在另一优选例中，所述的方法可与其他治疗方法联合使用。
96.在另一优选例中，所述的其他治疗方法包括化疗、放疗、靶向治疗等方法。
97.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
98.图1显示了sectm1-car载体构建示意图。
99.其中，a为sectm1序列示意图，其中1-28aa为信号肽、29-145aa为胞外结 构域；b为对照组质粒mock-car及sectm1-car结构示意图，其中信号肽、铰链区、 跨膜区均来源于人cd8分子，4-1bb来自于人cd137,cd3ζ来源于人cd3,mkate2 为荧光标记，用于检测car表达；c为ptomo-sectm1-car载体hindiii酶切鉴定。
100.图2显示了car-t细胞增殖倍数及总数，cd7表达变化检测以及细胞因子释放。 a.t细胞感染后15天后增殖倍数；b.感染3天后细胞因子分泌水平检测；c. 感染15天后细胞总数统计。
101.图3显示了t细胞感染后6天的表型检测。检测cd4,cd8以及记忆表型 cd45ro,ccr7表达情况。其中cd45ro+ccr7-(效应记忆细胞,em),cd45ro+ccr7+(中 央记忆细胞,cm)，cd45ro-ccr7-(终末效应记忆细胞,emra),cd45ro-ccr7+(幼稚 细胞,naive)。
102.图4显示了car转染效率检测结果。
103.其中，a为mock-car及sectm1-car感染t细胞72小时后细胞荧光表达结果， 其中bf为明场，mkate2为car荧光表达；b为流式检测荧光表达结果。
104.图5显示了肿瘤细胞ccrf-cem及正常t细胞cd7表达差异及杀伤差异。a， 靶细胞ccrf-cem及t细胞cd7表达流式检测；b,共孵育后杀伤检测。
105.图6显示了不同肿瘤细胞系cd7表达检测的结果。其中ccrf-cem,molt4是cd7阳性的all肿瘤细胞；kg-1a,kasumi-3是cd7阳性的aml肿瘤细胞；k562是 cd7阴性的对照细胞。
106.图7显示了体外检测sectm1-car对不同肿瘤细胞系的杀伤检测结果。其中 k562为cd7阴性对照细胞系，ccrf-cem,molt4为cd7阳性急性淋系白血病细胞系， kg-1a,kasumi-3为cd7阳性急性髓系白血病细胞系。
107.图8显示了cd7阳性靶细胞以2：1效靶比杀伤后细胞因子ifnγ及tnfα检测。
108.图9显示了过表达cd7对细胞杀伤的影响。其中k562细胞为红白血病细胞系。 a.cd7水平检测，b.杀伤效果检测，c.细胞因子分泌检测。
109.图10、图10(续-1)、图10(续-2)显示了灵长类猴子输注sectm1 cart 细胞后的体征及各项指标检测。a.猴子t细胞感染效率流式检测。b.细胞因子释放 检测。c.细胞计数检测。d.基础生命体征监测。e.血常规。
具体实施方式
110.本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种基于 sectm1构建的嵌合抗原受体免疫细胞。本发明人意外地发现，将sectm1的胞 外域的特定区段(即29-145位氨基酸序列)作为car的胞外结合域，不仅具有 合适的亲和力，并且在car-t细胞的制备过程中虽然cd7高表达的t细胞被杀 死，但cd7阴性或低表达的t细胞(包括car-t细胞)仍可成功扩增制备所需 的car-t细胞，并且所制备的car-t细胞富含记忆t细胞，因此在体内可更长 久地发挥作用。car-t制备过程中的这一现象也应可有效清除在分离病人t细 胞时不可避免地肿瘤细胞污染。在此基础上完成了本发明。
111.术语
112.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本 文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领 域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限 于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本 文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发 明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
113.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所 属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的 数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如 本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。
114.如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况 可以发生但不是必须发生。
115.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以使开放式、半封闭式和 封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”或“由
…
构成”。
[0116]“转导”、“转染”、“转化”或本文用到的术语指的是将外源多核苷酸 传递导至宿主细胞，转录和翻译产生多肽产物的过程，包括利用质粒分子将外 源多核苷酸引入宿主细胞(例如大肠杆菌)。
[0117]“基因表达”或“表达”指的是基因转录，翻译和翻译后修饰产生基因的 rna或蛋白产物的过程。
[0118]“多核苷酸”指的是任意长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核苷酸 (dna)，核糖核苷酸(rna)，其杂合序列和类似物。多核苷酸可包括修饰的核苷 酸，比如甲基化或加帽的核苷酸或核苷酸类似物。本文使用的术语多核苷酸指 可互换的单链和双链分子。除非另有说明，本文描述的任意实施例里的多核苷 酸包括双链的形式和已知的或可预测的构成双链形式的两条互补的单链。
[0119]
保守氨基酸的取代是本领域已知的。在一些实施例中，潜在的取代氨基酸 在以下组的一个或多个内：甘氨酸，丙氨酸；和缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和 脯氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸赖氨酸， 精氨酸和组氨酸；和/或苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸；蛋氨酸和半胱氨酸。此 外，本发明还提供了允许来自不同基团的氨基酸取代的非保守的氨基酸取代。
[0120]
本领域技术人员将容易理解本文所述的所有参数，尺寸，材料和构造的含 义。实际参数，尺寸，材料和/或配置取决于使用本发明说明的特定应用。本 领域技术人员能够理
解，实施例或权利要求仅是通过示例的方式给出的，并且 在等效物或权利要求的范围内，本发明的实施例可涵盖的范围不限于具体描述 和要求的范围。
[0121]
本文的定义和使用的所有定义应被理解为超过词典定义或通过引用并入 的文档中的定义。
[0122]
本文所发明的所有参考文献，专利和专利申请都相对于其所引用的主题通 过引用并入，在某些情况下可能包含整个文档。
[0123]
应当理解，对于本文所述的包括一个以上步骤的任何方法，步骤的顺序不 一定限于这些实施例中描述的顺序。
[0124]
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的， 除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在 整个申请中阐述了其它定义。
[0125]
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受 误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
[0126]
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任 一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊 髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
[0127]
cd7分子
[0128]
cd7分子是一种大小为40kd的i型跨膜糖蛋白，是一种谱系特异性抗原， 正常情况下主要存在于t/nk细胞及其祖细胞上，在外周血中仅有9％的外周单 个核细胞(pbmc)是cd7阴性，其主要功能是在淋巴发育过程中充当t和b淋巴 细胞相互作用的共刺激受体。
[0129]
除了正常t/nk细胞中的表达，cd7还在》95％淋巴系白血病和淋巴瘤及部分 外周血淋巴瘤，还在约30％的aml上表达。
[0130]
上皮细胞分泌的ig超家族分子sectm1是cd7分子的主要配体。sectm1基因位 于cd7基因上游5'端附近，这是唯一一对分子配体受体在基因组位置上毗邻， sectm1基因编码了一个未知功能的蛋白。
[0131]
本发明人意外地发现，将sectm1的胞外域的特定区段(即29-145位氨基酸序 列)作为car的胞外结合域，不仅具有合适的亲和力，并且在car-t细胞的制备 过程中对于car-t的增殖虽然有一定影响，但仍可成功地大量制备所需的car-t 细胞，并且所制备的car-t细胞具有记忆细胞的表型，因此对cd7阳性的靶细胞 (如肿瘤细胞)具有长期的高效杀伤能力且安全性高。
[0132]
基于此，本发明首次将sectm1特定片段通过基因工程方式整合入car载 体中，并修饰了相关免疫细胞，从而实现对sectm1结合蛋白阳性的细胞特异 杀伤，可用于相关疾病的治疗，尤其用于cd7阳性的、治疗后复发的血液肿瘤。
[0133]
本发明嵌合抗原受体(car)
[0134]
嵌合免疫抗原受体(chimeric antigen receptor，car)由胞外抗原识别区 域、跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。
[0135]
car的设计经历了以下过程：第一代car只有一个胞内信号组份cd3ζ或 者fcγri分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的t细胞 增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的t细胞增殖信号和持续的 体内抗肿瘤效应，所以并没有取
得很好地临床疗效。第二代car在原有结构基 础上引入一个共刺激分子，如cd28、4-1bb、ox40、icos，与一代car相比功 能有很大提高，进一步加强car-t细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在 二代car基础上串联一些新的免疫共刺激分子如cd27、cd134，发展成为三代 和四代car。
[0136]
car的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号， 引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先 分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生car的免疫细胞， 随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细 胞以非mhc限制方式识别。
[0137]
car-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这 样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研 究的热潮。
[0138]
具体地，本发明的嵌合抗原受体(car)包括细胞外结构域、跨膜结构域、 和细胞内结构域。
[0139]
胞外结构域包括靶-特异性结合元件。所述的胞外结构域可以是基于抗原
‑ꢀ
抗体的特异性结合的抗体的scfv，也可以是基于配体-受体的特异性结合的天 然序列或其衍生物。
[0140]
在本发明中，所述嵌合抗原受体的胞外结构域是一种可特异性结合本发明 car的cd7靶点的sectm1蛋白或其片段。更加优选地，本发明嵌合抗原受体的 胞外结合域具有如seq id no:1所示序列的第29至145位的氨基酸序列。
[0141]
细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包 括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效 应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
[0142]
在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的胞浆结构域和跨膜结 构域之间，可并入接头。如本文所用，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域 连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括 0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
[0143]
本发明的car当在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识 别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死 亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域 优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地， 抗原结合结构域与cd28信号传导结构域、和cd3ζ信号结构域组合的细胞内结 构域融合。
[0144]
在本发明中，本发明car的胞外结合域还包括基于序列的保守性变异体， 指与seq id no:1的第29至145位的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳 地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨 基酸所替换而形成多肽。
[0145]
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不 超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
[0146]
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、 3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
[0147]
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞 外结构
域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与car中的结构域之一 相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换 进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构 域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
[0148]
本发明的car中的胞内结构域包括4-1bb共刺激结构域和cd3ζ的信号传 导结构域。
[0149]
在本发明的一个实施方式中，所述的car是可以特异性靶向cd7的car。
[0150]
嵌合抗原受体免疫细胞(car-免疫细胞)
[0151]
在本发明中，提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，其包含本发明的具有特异 性靶向sectm1受体(优选地为cd7)的嵌合抗原受体。
[0152]
本发明的嵌合抗原受体免疫细胞可以是car-t细胞，也可以是car-nk细胞， car-巨噬细胞。优选地，本发明的嵌合抗原受体免疫细胞是car-t细胞。
[0153]
如本文所用，术语“car-t细胞”、“car-t”、“本发明car-t细胞”均指 本发明第五方面所述的car-t细胞。
[0154]
car-t细胞较其它基于t细胞的治疗方式存在以下优势：(1)car-t细胞的作 用过程不受mhc的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤标志物，针对某一 种肿瘤标志物的car基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)car既可以利用 肿瘤蛋白质标志物，又可利用糖脂类非蛋白质标志物，扩大了肿瘤标志物的靶点范 围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)car-t细胞具有免疫记忆功 能，可以长期在体内存活。
[0155]
如本文所用，术语“car-nk细胞”、“car-nk”、“本发明car-nk细胞”均 指本发明第五方面所述的car-nk细胞。本发明car-nk细胞可用于sectm1受体(优 选地为cd7)高表达的肿瘤。
[0156]
自然杀伤(nk)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保 护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的nk细胞可能获 得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。
[0157]
与car-t细胞相比，car-nk细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素 和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很 少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现 成的”产品。除此之外，与car-t细胞治疗类似。
[0158]
载体
[0159]
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如 通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因， 或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣 的基因可被合成生产。
[0160]
本发明也提供了包含本发明的核酸分子的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的 载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且 其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒 的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原 性的优点。
[0161]
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并 入
表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节 期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
[0162]
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗 法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、 5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提 供了基因疗法载体。
[0163]
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其 包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体 包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0164]
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领 域中是公知的并在例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratorymanual,cold spring harbor laboratory,new york)和其他病毒学和分子生物学手 册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病 毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制 起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如， wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0165]
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆 转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将 选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至 体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方 式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中， 使用慢病毒载体。
[0166]
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些 位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始 位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另 一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之 间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件 可合作或独立地起作用，以起动转录。
[0167]
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子 序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型 启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可 使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小 鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动 子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、 鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球 蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成 型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用 提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动 子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子 包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0168]
为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择 的标
记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感 染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一 段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的 调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基 因，诸如neo等等。
[0169]
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地， 报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表 达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。 在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的 报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷 酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，ui-tei等，2000febs letters479:79-82)。在 本发明的一个实施方式中，报告基因是编码mkate2红色荧光蛋白的基因。合适的 表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的 报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可 被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
[0170]
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载 体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳 动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转 移入宿主细胞。
[0171]
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰 击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中 是公知的。见例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual, cold spring harbor laboratory,new york)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方 法为磷酸钙转染。
[0172]
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。 病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例 如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒 和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0173]
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、 纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂 质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体 (例如，人造膜囊)。
[0174]
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质 制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核 酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在 脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质 体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质 联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂 质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任 何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的 (collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均 一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂 肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、 醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
[0175]
在本发明的一个优选的实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
[0176]
制剂
[0177]
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体car、本发明第二 方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面的宿主细胞 或本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋 形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优 选地，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，更优地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
[0178]
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐 水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽 或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧 化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
[0179]
治疗性应用
[0180]
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(lv)转导的细胞(例如，t细胞) 进行的治疗性应用。转导的t细胞可靶向肿瘤细胞的标志物cd7，协同激活t细胞， 引起免疫细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
[0181]
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的t细胞-介导的免 疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的car-细胞。
[0182]
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体t细胞(或者异 源供体)，激活并进行基因改造产生car-t细胞，随后注入同一病人体内。这种方 式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被t细胞以无mhc限制方式识别。此外，一种 car-t就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复 制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0183]
在一个实施方式中，本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可 持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分， 其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如， cd7的car-t细胞引起抗cd7细胞的特异性免疫应答。
[0184]
尽管本文公开的数据具体公开了包括sectm1蛋白或其片段、铰链和跨膜区、 和4-1bb和cd3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建 体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
[0185]
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管 化的肿瘤。癌症包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)和实体瘤。 用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病 或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成 人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
[0186]
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病， 包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血 病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白 血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血 病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等 级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯
特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异 常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0187]
本发明的car-修饰t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫 苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0188]
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生： i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
[0189]
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细 胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体进行基因修饰(即， 体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。 哺乳动物接受者可为人，和car-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地， 细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0190]
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以 引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0191]
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本 发明的car-修饰的t细胞。
[0192]
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或 与其他组分诸如il-2、il-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发 明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接 受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫 酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋 白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例 如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0193]
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的 数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度—— 尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0194]
当指出“有效量”、“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制 有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑 患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常 指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量， 优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞 组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术 (见例如rosenberg等，new eng.j.of med.319:1676，1988)施用。对于具体患 者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域 技术人员容易地确定。
[0195]
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞 咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、 肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明 的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明 的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴 结或感染位置。
[0196]
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t 细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合 (例如，之
前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进 行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知 为ara-c)或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对具 体肿瘤患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使 用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯 和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物 与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例 如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高 剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后， 对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞 在外科手术前或外科手术后施用。
[0197]
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而 变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗 程，可将1
×
106个至1
×
10
10
个本发明的car-t细胞，通过例如静脉回输的方式， 施用于患者。
[0198]
本发明的主要优点包括：
[0199]
(a)靶点特异：本发明的car免疫细胞仅针对细胞膜高表达cd7的恶性细 胞或部分正常t细胞，而对其他不表达cd7的细胞或组织无杀伤作用。
[0200]
(b)本发明利用配体与受体相结合作用方式，而非传统意义上的scfv。受 体/配体结合方式具有经自然进化选择的亲和力，以配体sectm1胞外片段作为 胞外结合域时，虽然会引起cd7 car-t细胞的自杀现象，但此后会有一群cd7 低表达或阴性的car-t细胞扩增，这些细胞同样具有杀伤靶细胞的功能。
[0201]
(c)本发明的cart细胞，经过体外扩增(伴随部分自相残杀)所制备的这 些car-t细胞，相对于对照组car-t细胞，具有更偏向于记忆细胞的表型，这 提示在体内持续时间更久，作用时间更长。
[0202]
(d)本发明的car-t细胞，对于cd7阴性或低表达地t细胞不杀伤，在临 床应用时可保留病人必要的免疫力；同时对cd7表达更高的肿瘤细胞能高效杀 伤，可解决了t细胞分离和car-t制备过程中肿瘤细胞污染的问题。
[0203]
(e)本发明的基于天然配体受体特定区段的car，在灵长类动物中进行的安 全性评价具有更高的临床参考价值。
[0204]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york: cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0205]
本技术实施例中的试剂、质粒、和细胞，除非另外说明，均为可市售获得 的。
[0206]
表a序列
[0207]
[0208]
[0209][0210]
其中，下划线部分为sectm1蛋白29-1445位氨基酸。
[0211]
实施例1：制备sectm1-car载体
[0212]
基于sectm1/k12的核苷酸序列(nm_003004.3)、人的cd8α铰链区、人的 cd8跨膜区、人的4-1bb胞内区以及人cd3ζ胞内区基因序列信息，通过人工合 成方法或pcr法获得相应的核苷酸序列。在合成cd8信号肽及sectm1胞外区 域的基因片段后，通过xbai(thermo)和nhei(thermo)双酶切该car分子的核苷 酸序列，经t4 dna连接酶(neb)连接插入已将cd8tm、4-1bb、cd3ζ插入的 慢病毒载体ptomo中，转化感受态大肠杆菌(stbl3),sectm1示意图如图1a， car全长示意图如图1b。
[0213]
将重组质粒进行测序，结果表明，car的编码序列正确地插入了质粒的预 定位置
(图1c)。
[0214]
所有质粒均用qiagen公司的无内毒素大抽试剂盒抽提，纯化质粒用碧云 天lipo6000转染293t细胞进行慢病毒包装。
[0215]
实施例2：病毒包装
[0216]
在15cm培养皿中进行包装且所用293t细胞为小于20代，待293t细胞汇合 度在80％-90％左右进行转染，准备2ml optimem溶解的质粒混合物(核心质粒 20ug、pcmvδr8.9 10ug、pmd2.g 4ug)；在另一离心管中2ml optimem以及 68ul的lipo6000。室温静置5min后，将质粒复合物加入脂质体复合物中，室温静 置20min。将上述混合物滴加入293t细胞中，37℃孵育6小时后去除培养基。重 新加入预热的完全培养基。收集48小时和72小时病毒上清后，于4℃3000rpm离 心20分钟后，用0.45um滤膜过滤。于25000rpm 4℃离心2.5小时进行病毒浓缩。 浓缩的病毒用30ul病毒溶解液过夜溶解后，病毒滴度用qpcr检测。结果显示， 病毒滴度达到要求。
[0217]
实施例3：cart细胞制备
[0218]
用ficool分离液从人外周血中分离单核细胞，由rosettesep human t cellenrichment cocktail(stemcell technologies)获得纯化的cd3+t细胞。t细胞用 cd3/cd28磁珠进行活化(life technology)，再加入200u/ml的il2(peprotech)，刺 激培养48小时后进行病毒感染。慢病毒在lentiboost存在时按照moi＝20感染t 细胞制备car-t细胞。感染一天后更换培养基。
[0219]
得到的car-t细胞增殖倍数及总数结果如图2所示。其中，ntr为未感染的t 细胞，control car为mock，即感染了无cd7胞外结合域的对照病毒的t细胞.结果 显示，通过细胞计数可以得知在感染后第三天细胞数量显著低于对照组(图2a)， 且可以检测到细胞因子ifnγ的分泌也显著升高(图2b)，此数据说明sectm1 car确实存在“自杀现象”。值得注意的是，不同于配体形式的sectm1 car, 本研究中观察到sectm1 car的增殖倍数在前三天由于自杀现象增殖显著低 于对照组，而第6天再次计数检测细胞增殖与对照组相当，此后每3天进行计数 检测，均与对照组无明显差异(图3a)，细胞计数总数统计显示虽然t细胞前期 增殖受到自杀现象的影响，但是通过后期增殖可以得到足够数目的t细胞用于 体内实验(图2c)。
[0220]
对于后期增殖的car-t细胞，本发明人进行了cd7分子的检测，数据表明 该群细胞主要是一群cd7阴性或者弱阳性的t细胞，同时有文献报道在正常血液 中存在一群cd7阴性的t细胞，会随着年龄的增长比例增加，该群细胞是一群偏 向于cd4阳性，cd45ro阳性cd45ra阴性的记忆型t细胞。本发明人对得到的 cd7阴性的car-t细胞进行了cd4,cd8分子以及cd45ro,ccr7分子检测，表明 本发明人的这群cd7阴性t细胞相比于对照组，cd4阳性更高，也是一群偏向于 效应记忆和中央记忆细胞群体(图3)。那么对于这群cd7阴性的cd7 car-t 细胞具有记忆表型可以使这群t细胞在体内存活时间更久，从而发挥更久的杀 伤作用。
[0221]
实施例4：流式细胞仪检测感染cart细胞的阳性率
[0222]
分别离心收集病毒感染72小时后的cart细胞和对照组t细胞，pbs洗涤一 次后弃上清，用含有2％fbs的pbs重悬细胞，流式检测阳性率。
[0223]
转染效率的结果如图4所示，其中图4a代表荧光显微镜下观察结果，图4b 代表流
式检测结果。结果表明，如上图所示，car细胞因为共表达的car-mkate2 融合蛋白，因此表达后的融合蛋白经t2a切割，形成的mkate2蛋白在胞内表现出 红色荧光。
[0224]
图4显示，采用针对sectm1的红色荧光mkate2进行流式检测pe-cy5通 道时，细胞膜上表达本发明car的car-t阳性率在70％左右。
[0225]
实施例5：肿瘤细胞与正常t细胞cd7表达差异及杀伤差异
[0226]
将靶细胞ccrf-cem与正常t细胞分别用cfse及violet两种荧光染料标 记，调整靶细胞密度为各20万/ml，共40万/ml。将100ul cfse细胞接种于96 孔板中，将cart/nk细胞调整细胞密度为80万/ml,按照e:t为1：1、2：1、 4：1、8：1接种至96孔板中，每孔接种100ul。将上述靶细胞和t细胞混匀后 至于培养箱孵育24小时。细胞收集后用7-aad染色10min后流式检测杀伤效 果。
[0227]
结果如图5所示，其中图5a是靶细胞与t细胞cd7检测结果，结果表明， 肿瘤细胞cd7丰度高于正常t细胞；图5b显示靶细胞与t细胞的杀伤结果， 靶细胞杀伤效果高于t细胞。
[0228]
实施例6：检测各靶细胞cd7的表达
[0229]
将靶细胞各2*106个收集分至两个ep管中，加入1ml含2％fbs的pbs重悬后， 分别加入cd7同型对照抗体及human cd7抗体4℃孵育1h；离心弃上清后用1ml 含2％fbs的pbs清洗两遍，300ul重悬后流式上机检测靶细胞cd7表达阳性率。
[0230]
结果如图6所示。本发明人选择了cd7阳性的t-all肿瘤细胞ccrf-cem, molt4以及aml肿瘤细胞kg-1a,kasumi-3及cd7阴性的细胞k562检测cd7表 达，各细胞表现出不同的cd7表达水平。
[0231]
实施例7：携带luciferase的靶细胞构建
[0232]
从pgl3-luciferase质粒中pcr扩增出luciferase片段，然后通过xbai和 bamhi连接进入ptomo载体构建ptomo-egfp-t2a-lucferase质粒。分别从 ptomo及plko.1质粒中分别扩增ires及puromycin片段。通过三片段连接成 功构建ptomo-egfp-t2a-luciferase-ires-puro质粒。慢病毒包装及滴度测定如 前所述，按照moi＝100分别感染人ccrf-cem及kg-1a细胞系，48小时后用 puromycin(1ug/ml)筛选1周分别得到ccrf-cem-luciferase、kg-1a-luciferase 细胞。
[0233]
实施例8：cart细胞杀伤
[0234]
在本实施例中，检测本发明cart细胞对不同靶细胞的杀伤能力。采用的靶 细胞包括：表达cd7的靶细胞：ccrf-cem,molt4,kg-1a及kasumi-3；不表达 或基本上不表达cd7的靶细胞：k562。
[0235]
方法如下：将各靶细胞收集后用cfse进行染色，37℃，10min后加入3倍体 积含5％fbs的pbs终止染色5min后离心去上清，清洗细胞两遍后用t细胞培养 基重悬，调整靶细胞密度为40万/ml。将100ul cfse细胞接种于96孔板中，按照 e:t为0.5：1、1：1、2：1、4：1接种至96孔板中，每孔接种100ul。将上述靶 细胞和t细胞混匀后至于培养箱孵育24小时。收集细胞上清冻存于-80℃检测细 胞因子释放量。细胞收集后用7-aad染色10min后流式检测杀伤效果。
[0236]
结果如图7所示。结果表明，sectm1-cart细胞对表达cd7的肿瘤细胞的 杀伤作用随着效靶比(e:t)升高而逐渐增强，且杀伤效果与靶细胞cd7表达水平正 相关；对cd7阴性
细胞株k562无明显杀伤效果。
[0237]
实施例9：细胞因子释放
[0238]
在本实施例中，检测本发明cart细胞与靶细胞共孵育情况下的细胞因子的 释放情况。采用细胞杀伤实验中共孵育的细胞上清进行检测。
[0239]
以ifnγ为例，方法如下：取实施例8中本发明cart细胞与cd7阳性的靶细 胞ccrf-cem,molt4,kg-1a及ksumi-3(et比为2：1)共孵育的细胞上清，按照 ifn gamma human elisa kit(life technology)检测ifnγ。
[0240]
用standard dilution buffer溶解标准品，并进行梯度稀释成1000pg/ml、500 pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、15.6pg/ml、0pg/ml的标准 品。
[0241]
每孔中加入50ul incubation buffer、50ul检测样本、50ulifnγbiotin conjugatedsolution，混匀后室温静置90分钟。
[0242]
然后依次按照以下步骤进行操作：
[0243]
(1)用1*wash buffer洗孔4次，每次停留1分钟。
[0244]
(2)每孔加入100ul 1*streptavidin-hrp solution，室温静置45分钟。
[0245]
(3)用1*wash buffer洗孔4次，每次停留1分钟。
[0246]
(4)加入100ul stabilized chromogen，室温静置30分钟.
[0247]
(5)每孔加入100ul stop solution后混匀。
[0248]
(6)450nm处检测吸光值。
[0249]
类似地，tnfα的检测用human tnfαelisa kit(bd bioscience)试剂盒进行。
[0250]
结果如图8所示。结果表明，sectm1-cart细胞对肿瘤细胞的杀伤作用伴 随着ifnγ(图8a)及tnfα(图8b)释放。
[0251]
实施例10：过表达cd7后对sectm1-cart肿瘤杀伤作用影响
[0252]
k562是一株cd7阴性的红白血病细胞系，sectm1-cart对k562无杀伤作 用。在本实施例中，将过表达cd7的cds区的载体，通过体外包装慢病毒，并用 该慢病毒感染k562细胞，经puromycin(1ug/ml)筛选7天后，获得稳定过表达cd7 的k562 cd7 over细胞系，流式检测cd7表达，结果如图9a。
[0253]
按实施例8的体外杀伤方法，通过流式检测sectm1-car对k562 cd7 over 细胞的杀伤作用，结果如图9b所示。结果表明，在细胞膜上的过表达cd7的k562 cd7 over细胞系，可被本发明的sectm1-cart有效杀伤。同时检测细胞因子 ifnγ，相对于k562野生型细胞、过表达组细胞因子分泌明显上调(图9c)
[0254]
实施例11：sectm1c car-t细胞猴子输注后安全性验证
[0255]
将从猴子血液中分离的t细胞以moi＝100进行体外感染，流式细胞术检测t 细胞感染效率,结果表明sectm1 car的感染效率可达35％左右(图10a)。同时 收集感染前三天的细胞上清进行ifnγ，il2,il6以及tnfα细胞因子检测，可观察 到相对于对照组t细胞，sectm1 car的细胞因子有不同程度的升高(图10b). 对感染后的t细胞没两天进行计数可观察到第2，第4天的sectm1 car-t细胞 相对比对照组t细胞略低，但第6天后维持在相当水平(图10c)，这些数据表明： 本研究中设计的sectm1 car可以识别猴子t细胞并出现自杀现象及细胞因子释 放，可以很好地在灵长类猴子体内模拟临床过程。
[0256]
同时在car-t细胞输注前后检测猴子的体重，肛温，血压，心率(图10d) 以及血常
规检测(图10e)，其变化均在范围内，未观察到严重毒副作用，证明了 本sectm1 car的体内安全性。
[0257]
讨论
[0258]
cd7分子是一种大小为40kd的i型跨膜糖蛋白，是一种谱系特异性抗原， 正常情况下主要存在于t/nk细胞及其祖细胞上，在外周血中仅有9％的外周单 个核细胞(pbmc)是cd7阴性，即大部分pbmc为cd7阳性。
[0259]
因此在本发明之前，本领域认为cd7不似乎作为car免疫细胞疗法的合 适靶点，因为针对cd7靶点的car免疫细胞(如car-t细胞)也会杀伤这些cd7 阳性细胞。
[0260]
另外，在car-t细胞制备过程中，一些t细胞也是cd7阳性的，因此存 在严重的t细胞的自相残杀，导致无法有效地制备car-t细胞。因此，一些 研究人员开发了基于cd7阻断技术的car-t细胞。然而，采用cd7阻断分子 来阻断cart细胞表达cd7，存在工艺复杂等缺点。
[0261]
在本发明中，本发明人意外地发现，将sectm1的胞外域的特定区段(即 29-145位氨基酸序列)作为car的胞外结合域，不仅具有合适的亲和力，并且 在car-t细胞的制备过程中对于car-t的增殖虽然有一定影响，但仍可成功 地大量制备所需的car-t细胞，并且所制备的car-t细胞含有较多记忆t细 胞，因此对cd7阳性的靶细胞(如肿瘤细胞)具有更长久的高效杀伤能力。并且 由于肿瘤细胞cd7表达丰度高于正常t细胞，car-t细胞会优先清除cd7表 达更高的肿瘤细胞，从而可解决t细胞分离和car-t细胞制备过程中肿瘤细 胞污染的问题。
[0262]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。