温控无细胞反应体系的构建方法和该方法使用的质粒以及用途

1.本发明属于生物反应体系领域，具体涉及温控无细胞反应体系的构建方法以及该方法使用的质粒以及用途。


背景技术：

2.生物过程控制是生物制造和基因工程领域的一个重要问题。蛋白质合成和特定位点生物功能的时空激活和调控在生物技术、医学和工业生产等领域具有重要意义。目前常用的控制方法是利用分子的化学效应调节基因表达。然而，该方法也存在一些缺点，包括化学效应不稳定\空间精度低以及化学诱导剂可能带来的其他不良副反应。利用光和热等物理信号来控制生物过程是一种理想的方法。相对于光信号对机体渗透性较差，温度作为一种独特的物理信号，可以准确有效地控制整体和局部温度。温度调节表达体系依赖于一种强大而精细调节的启动子，避免使用特殊介质、有毒或昂贵的化学诱导剂。
3.目前，温度调控表达已成功用于许多重组蛋白和肽的生产。温度是一个非常明确的信号，可以通过外部触发的方式如聚焦超声、红外光和磁粒子热疗)进行空间定向。理想的能对温度变化做出响应的热生物开关应该对急剧的温度变化具有灵敏的开关效果。热休克蛋白被迅速鉴定为真核细胞中已知的选择性和诱导性转录调控的最引人注目的例子。脂质介导的构象在不同温度下的变化导致膜相关蛋白的酶催化特性不同，这赋予膜相关蛋白具有温度感知特性。被称为“rna温度计”的温度感应rna分子，可以被设计成具有高灵敏度的灵活切换响应温度。此外，转录抑制因子，在生物医学相关的32-46℃范围内，对细菌基因表达的阈值提供开关式控制。
4.然而，上述响应温度变化的细胞内调节机制面临着一些固有的困难。温度是影响酶活性和复杂细胞代谢的重要因素，温度变化可能导致细胞代谢强度和代谢流量的变化，从而对靶途径产生不利影响。此外，体内不同合成途径之间的相互作用可能限制了对蛋白表达的有效控制。因此，人们正在寻找一种更有效的方法来避免不必要的代谢途径干扰温度控制途径。
5.无细胞蛋白合成(cfps)体系是一个在体外合成活的有机体中应该已经产生且难以产生的蛋白质的平台。cfps以外源dna或mrna为模板，在体系中补充无机盐、反应物质和能量底物。在细胞提取物提供的各种酶的作用下，蛋白质的合成可以在没有细胞环境的情况下进行。与细胞体系相比，cfps可以避免细胞内代谢通路在不同温度下对目标代谢通路的干扰，提高温度调节通路的特异性。此外，无细胞体系的特点是其简单性和时间效率，作为一个开放的合成平台，没有膜的约束。它们只需要在生物合成反应中加入某些可以在几小时内完成的物质，从而可以快速探索和筛选出cfps中对控制元素有关键影响的因素。此外，先前的研究已经表明，由物理信号控制的无细胞合成体系被封装在脂质体中，以模拟活细胞的种群通信，并且这种响应性人工细胞具有传递药物的潜力。


技术实现要素：

6.本发明在cfps体系中建立了响应温度的遗传回路，从而在体外通过温度控制蛋白质合成(图1)。热敏变体的噬菌体λ阻遏ci857(本发明中简称为ci)用于构建温控无细胞蛋白质合成(以下称为tccfps)体系，并完成重建质粒和优化细胞提取物与氧化还原条件。本发明还建立可以通过温度控制蛋白质合成的人工细胞。
7.具体地，提供了以下技术方案：
8.1.一种质粒，其包括：
9.编码温度敏感元件的基因；
10.位于所述编码温度敏感元件的基因下游的能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元；
11.位于所述操纵单元下游的表达目标蛋白的外源基因。
12.2.根据项1所述的质粒，其中，能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元是指当温度升高到给定温度时，所述温度敏感元件失活从而操纵单元启动表达目标蛋白；以及当温度低于给定温度时，所述温度敏感元件抑制操纵单元启动表达目标蛋白，优选给定温度为37-40℃。
13.3.根据项1或2所述的质粒，其中，所述温度敏感元件和所述操纵单元配合使用，所述温度敏感元件和所述操纵单元选自噬菌体λ阻遏ci-pr-pl启动子、tlpa蛋白-tlpa启动子、大肠杆菌阻遏蛋白tetr温敏变体-tet操作子、大肠杆菌阻遏蛋白laci(ts)-laco位点+laci启动子或大肠杆菌热休克蛋白-phsp启动子中任意一种，优选，所述温度敏感元件和所述操纵单元选自噬菌体λ阻遏ci-pr-pl启动子。
14.4.根据项1-3任一项所述的质粒，其中，用于构建所述质粒的初始质粒选自psb3k3质粒、pet系列质粒、pgex系列质粒、pmal系列质粒、pqe-1质粒、pqe-60质粒、pgs-21a质粒、pcdfduet-1质粒、prsfduet-1质粒或pbluescriptii系列质粒中任意一种，优选为psb3k3质粒。
15.5.根据项1-4任一项所述的质粒，其中，所述目标蛋白选自荧光蛋白、疫苗蛋白、抗体蛋白、生物催化酶、膜蛋白、多肽、细胞因子蛋白、激素蛋白或补体蛋白中的任意一种或两种以上。
16.6.根据项5所述的质粒，其中，所述荧光蛋白为选自红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或黄色荧光蛋白中的任意一种或两种以上。
17.7.根据项1-6的任一项所述的质粒在无细胞反应体系中用于合成目标蛋白的用途。
18.8.一种脂质体药物递送体系，其包括：
19.如项1-4任一项所述的质粒，其中的目标蛋白是药物蛋白；
20.原核细胞或真核细胞的无细胞提取物；以及温度敏感蛋白
21.9.一种温控无细胞反应体系的构建方法，该方法包括下述步骤：
[0022]-提供细胞提取物；
[0023]-使所述细胞提取物与下述质粒混合以形成温控无细胞反应体系，该质粒包括编码温度敏感元件的基因和位于所述编码温度敏感元件的基因下游的能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元以及位于所述操纵单元下游的表达目标蛋白的外源基因；
[0024]-任选：向所述温控无细胞反应体系中添加能量源物质和氨基酸混合液，无机盐，转录翻译辅助物质；
[0025]-任选：向所述温控无细胞反应体系中添加氧化物质和还原物质；
[0026]-在给定温度下在反应体系中表达所述目标蛋白。
[0027]
10.一种温控无细胞反应体系的构建方法，该方法包括下述步骤：
[0028]-提供包含温度敏感元件的细胞提取物与不包含温度敏感元件的细胞提取物的细胞提取物混合物；
[0029]-使所述细胞提取物混合物与下述质粒混合以形成温控无细胞反应体系，该质粒包括能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元以及位于所述操纵单元下游的表达目标蛋白的外源基因；
[0030]-任选：向所述温控无细胞反应体系中添加能量源物质和氨基酸混合液，无机盐，转录翻译辅助物质；
[0031]-任选：向所述温控无细胞反应体系中添加氧化物质和还原物质；
[0032]-在给定温度下在反应体系中表达所述目标蛋白。
[0033]
11.根据项10所述的方法，其中，所述包含温度敏感元件的细胞提取物和不包含温度敏感元件的细胞提取物的体积比为1:2-2:1。
[0034]
12.根据项9-11任一项所述的方法，其中，所述细胞提取物是来自于大肠杆菌的、古细菌的、麦芽细胞的、酵母细胞的、兔网织红细胞的、烟叶细胞的、昆虫细胞的或中国仓鼠卵巢细胞的细胞提取物。
[0035]
13.根据项9-12任一项所述的方法，其中，所述温度敏感元件和所述操纵单元配合使用，所述温度敏感元件和所述操纵单元选自噬菌体λ阻遏ci-pr-pl启动子、tlpa蛋白-tlpa启动子、大肠杆菌阻遏蛋白tetr温敏变体-tet操作子、大肠杆菌阻遏蛋白laci(ts)-laco位点+laci启动子或大肠杆菌热休克蛋白-phsp启动子中任意一种，优选，所述温度敏感元件和所述操纵单元选自噬菌体λ阻遏ci-pr-pl启动子。
[0036]
14.根据项9-13任一项所述的方法，其中，所述能量源物质选自蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸、谷氨酸盐、多磷酸盐、磷酸烯醇式丙酮酸中的一种或两种以上。
[0037]
15.根据项9-14任一项所述的方法，其中，所述氨基酸混合液选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或两种以上。
[0038]
16.根据项9-15任一项所述的方法，其中，所述氧化物质为氧化型谷胱甘肽(gssg)和还原物质为还原型谷胱甘肽(gsh)，所述gssg与gsh的摩尔比为2:1-4:1。
[0039]
17.根据项9-16任一项所述的方法，其中，所述给定温度为37-40℃。
[0040]
发明效果
[0041]
本发明建立了一种温度控制蛋白合成的无细胞表达体系，通过添加本发明制备的具有温度敏感元件的质粒，可以实现根据特定温度控制蛋白质的合成。通过本发明所述的温度敏感元件的引入，避免了现有技术中温度调控表达过程中不必要的代谢途径而干扰温度控制途径，使得温控无细胞表达体系在不产生其他附加影响的同时更好的实现温度控制。
[0042]
本发明使用工程质粒作为引入温度敏感元件的复制模板的方式。将这些基因元件经由工程质粒一起带入反应体系被证明是成本低廉而有效的方法。
[0043]
本发明进一步优化了无细胞表达体系的条件，通过添加不同量的氧化物质和还原物质来优化氧化还原特性，可获得最高3.40倍的温控诱导表达倍数。通过改变无细胞表达体系中的细胞提取物的种类和比例，可获得最高4.10倍的温控诱导表达倍数。通过对反应动力学的分析，可以更清晰地揭示ci蛋白在不同温度下对pr-pl操纵子-启动子的调控，为今后治疗性蛋白合成和传递的可能应用提供理论依据。
[0044]
本发明成功构建了在特定温度下激活的具有蛋白表达功能的脂质体，以1-棕榈酰-2油基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)和胆固醇为基础，采用油包水乳液转移法构建脂质体。为了保证在人工细胞中有足够的反应时间来获得一定量的荧光表达，在超过12h的反应温度下制备脂质体。从流式细胞术结果显示，包裹tccfps的脂质体对温度控制有反应。证明了人工细胞对温度信号响应模型的可行性。
[0045]
本发明所构建的具有温度敏感元件的质粒同样可以控制细胞中的蛋白合成。
附图说明
[0046]
图1为本发明建立的温控无细胞蛋白合成体系(tccfps)；
[0047]
图2采用温度敏感电路ci-pr-pl的tccfps调控机制模型；
[0048]
图3a为质粒pci的结构图；
[0049]
图3b为质粒pδci的结构图；
[0050]
图4为质粒pci在细胞体系中不同温度下的表达对比图；
[0051]
图5为质粒pci在无细胞体系中不同温度下的表达对比图；
[0052]
图6为无细胞体系中不同温度下不同摩尔比gssg:gsh的gfp的表达对比图；
[0053]
图7为无细胞体系中添加不同体积分数的ci-bs细胞提取物的混合细胞提取物时，gfp在不同温度下的平均荧光和的比值图；
[0054]
图8为不同温度下ci-mrna在tccfps中的浓度曲线图；
[0055]
图9为不同温度下gfp-mrna在tccfps中的浓度曲线图；
[0056]
图10为含tccfps的人工细胞模型；
[0057]
图11为不同温度下脂质体中gfp的表达对比图；
[0058]
图12a为30℃下脂质体中liss rhodpe荧光的共焦图像；
[0059]
图12b为37℃下脂质体中liss rhodpe荧光的共焦图像；
[0060]
图12c为30℃下脂质体中liss rhodpe荧光和gfp荧光的共焦图像；
[0061]
图12d为37℃下脂质体中liss rhodpe荧光和gfp荧光的共焦图像。
具体实施方式
[0062]
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以
说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0063]
本发明在第一方面涉及：质粒。
[0064]
在一个具体的实施方式中，提供了一种质粒，其包括：编码温度敏感元件的基因；位于所述编码温度敏感元件的基因下游的能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元；位于所述操纵单元下游的表达目标蛋白的外源基因。
[0065]
在本说明书的上下文中，“质粒”符合生物工程领域的一般定义，它是细菌、酵母菌和放线菌等生物中除染色体(或拟核)以外的dna分子，存在于细胞质中(但酵母除外，酵母的存质粒存在于细胞核中)，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链dna分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，有利于细菌在特定的环境条件下生存。与细菌基因组相同，质粒也属于环形双链dna(共价闭环dna，covalently closed circular dna,cccdna)。本发明使用工程质粒作为引入蛋白质复制模板(连同响应于温度敏感蛋白的启动子)和温度敏感蛋白的方式。将这些基因元件经由质粒一起带入反应体系被证明是成本低廉而有效的方法。
[0066]
在本说明书的上下文中，“操纵单元”是指生物工程领域中的启动子或者操纵子，或者串联的启动子-操纵子。
[0067]
在本说明书的上下文中，“启动子”符合生物工程领域的一般定义，它是rna聚合酶识别、结合和开始转录的一段dna序列，它含有rna聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。但有一些启动子(如trna启动子)位于转录起始点的下游,这些dna序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。
[0068]
在本说明书的上下文中，“操纵子”符合生物工程领域的一般定义，是指一组关键的核苷酸序列，包括了一个操纵基因(operator)，一个普通的启动子，及一个或以上的结构基因被用作生产信使rna(mrna)的基元。操纵子通常由2个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。启动序列是rna聚合酶结合并启动转录的特异dna序列。多种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列，称为共有序列。大肠杆菌及一些细菌启动序列的共有序列在-10区域是tataat，又称pribnow盒(pribnowbox)，在-35区域为ttgaca。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响rna聚合酶与启动序列的结合及转录起始。因此，与共有序列的一致度决定启动序列的转录活性大小。操纵序列是原核阻遏蛋白的结合位点。当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍rna聚合酶与启动序列的结合，或使rna聚合酶不能沿dna向前移动，阻遏转录，介导负性调节。原核操纵子调节序列中还有一种特异dna序列可结合激活蛋白，使转录激活，介导正性调节。
[0069]
在某一具体的实施方式中，所述能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元是指当温度升高到给定温度时，所述温度敏感元件失活从而操纵单元启动表达目标蛋白；以及当温度低于给定温度时，所述温度敏感元件抑制操纵单元启动表达目标蛋白，优选给定温度为37-40℃，例如可以为37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃。
[0070]
本发明中，所述能够编码温度敏感元件的基因与所述操纵单元配合使用，例如，当
所述温度敏感元件为噬菌体λ阻遏ci时，所述操纵单元为pr-pl启动子。
[0071]
所述噬菌体λ阻遏ci是指文献tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbial therapeutics中所描述的ci857，本发明中，将其命名为ci38，简称ci，即，本发明中“噬菌体λ阻遏ci”、“ci857”、“ci38”、“ci”表达的意义相同，噬菌体λ阻遏子ci是一种众所周知的温度敏感变体，作用于串联pr-pl操作子-启动子，它能有效调控启动子下游克隆的基因。
[0072]
本发明中其他的实施方式中，所述温度敏感元件和所述操纵单元还可以为tlpa蛋白-tlpa启动子、大肠杆菌阻遏蛋白tetr温敏变体-tet操纵子、大肠杆菌阻遏蛋白laci(ts)-laco位点+laci启动子或大肠杆菌热休克蛋白-phsp启动子中任意一种。
[0073]
在一具体实施方式中，所述目标蛋白选自荧光蛋白、疫苗蛋白、抗体蛋白、生物催化酶、膜蛋白、多肽、细胞因子蛋白、激素蛋白或补体蛋白中的任意一种或两种以上，对于本发明中涉及的“目标蛋白”，并无分子量、化学和物理属性上的特别限制。
[0074]
在本说明书的上下文中，“疫苗蛋白”符合生物技术领域的一般定义，其涵盖了亚单位疫苗与多肽疫苗。目前，dna重组技术使得获取大量纯抗原分子成为可能。这与以病原体为原料制备的疫苗相比在技术上发生了革命性变化，使得质量更易控制，价格也更高。从效果来看，有些亚单位疫苗，如非细胞百日咳、hbsag等，在低剂量就具有高免疫原性；而另外一些疫苗的免疫力则较低，要求比铝盐更强的佐剂。肽疫苗通常由化学合成技术制造。其优点是成分更加简单，质量更易控制。但随着免疫原分子量和结构复杂性的降低，免疫原性也显著降低。因此，这些疫苗一般需要特殊的结构设计、特殊的递送体系或佐剂。
[0075]
在本说明书的上下文中，“生物催化酶”符合生物技术领域的一般定义，也可以简称为“酶”。酶的化学本质是蛋白质(作为例外，也有少数为rna)，因此它也具有一级、二级、三级，乃至四级结构。按其分子组成的不同，可分为单纯酶和结合酶。结合酶中的酶蛋白为蛋白质部分，辅助因子为非蛋白质部分，只有两者结合成全酶才具有催化活性。酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。很多酶也可以作为药物使用，例如门冬酰胺酶。
[0076]
在本说明书的上下文中，“膜蛋白”符合生物技术领域的一般定义，即指生物膜所含的蛋白。膜蛋白基本可分为三大类：外在膜蛋白或称外周膜蛋白、内在膜蛋白或称整合膜蛋白和脂锚定蛋白。膜蛋白包括糖蛋白，载体蛋白和酶等。通常在膜蛋白外会连接着一些糖类，这些糖相当于会通过糖本身分子结构变化将信号传到细胞内。膜蛋白的功能是多方面的。膜蛋白可作为“载体”而将物质转运进出细胞。有些膜蛋白是激素或其他化学物质的专一受体，如甲状腺细胞上有接受来自脑垂体的促甲状腺素的受体。膜表面还有各种酶，使专一的化学反应能在膜上进行，如内质网膜上的能催化磷脂的合成等。细胞的识别功能也决定于膜表面的蛋白质。这些蛋白常常是表面抗原。表面抗原能和特异的抗体结合，如人细胞表面有一种蛋白质抗原hla，是一种变化极多的二聚体。膜蛋白在生物体的许多生命活动中起着非常重要的作用，如细胞的增殖和分化、能量转换、信号转导及物质运输等。据估计有大约60％的药物作用靶点是膜蛋白。
[0077]
本说明书的上下文中，“多肽”可以和“多肽药物”互换使用，其涵盖了内源性多肽和外源性多肽；前者即人体固有的内生性多肽，如脑啡肽、胸腺肽、胰脏多肽等；后者为诸如蛇毒、唾液酸、蜂毒、蛙毒、蝎毒、水蛭素、竽螺毒素衍生物和苍蝇分泌的杀菌肽等，其可以拥
有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等方面的活性。
[0078]
在本说明书的上下文中，“抗体”符合生物技术领域的一般定义，即指抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它(免疫球蛋白不仅仅只是抗体)是一种由浆细胞(效应b细胞)分泌，被免疫体系用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其b细胞的细胞膜表面。
[0079]
在本说明书的上下文中，“细胞因子”符合生物技术领域的一般定义，即指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、t细胞、b细胞、nk细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。细胞因子(cytokine，ck)是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、apsc多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。具体地，可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。
[0080]
在本说明书的上下文中，“补体”符合生物技术领域的一般定义，即指一种存在于人和脊椎动物血清及组织液中的血清蛋白质，其不耐热，活化后具有酶活性、可介导免疫应答和炎症反应。它可被抗原-抗体复合物或微生物所激活，导致病原微生物裂解或被吞噬。
[0081]
在再一具体实施方式中，所述荧光蛋白为选自红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或黄色荧光蛋白中的任意一种或两种以上。
[0082]
在本说明书的上下文中，“荧光蛋白”符合生物技术领域的一般定义，它是生物学研究中经常用到的标记分子。最早出现的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,gfp)是由下村修等人在1962年在一种学名aequorea victoria的水母中发现，之后又在海洋珊瑚虫中分离得到了第二种gfp。其中水母gfp是由238氨基酸组成的单体蛋白质，分子量约27kd，gfp荧光的产生主要是在氧气存在下，分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α酪氨酸键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，这样gfp分子中就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。在搞清楚了这一原理后，gfp被广泛的应用到生物学研究中，各个厂家如promega公司、stratagene公司(包括来自香港中文大学的橙色蛋白制备技术)、clontech公司(现属takara公司)等都出产了相应的产品。在本发明的具体实施方式中特别地使用绿色荧光蛋白gfp，其序列在下文中列出。
[0083]
在一具体的实施方式中，本发明构建了pci质粒，其dna部分序列参见序列表的seq id no.7，该序列依次包括ci基因序列，pr操纵子序列、pl操纵子序列以及gfp基因序列。
[0084]
在另一具体的实施方式中，本发明构建了pδci质粒，其dna部分序列参见序列表的seq id no.8，该序列依次包括pr操纵子序列、pl操纵子序列以及gfp基因序列。
[0085]
本发明在第二方面涉及：上述质粒在无细胞蛋白合成体系中的应用。
[0086]
在一个具体实施方式中，提供了上述质粒在无细胞蛋白合成体系中用于合成目标蛋白的用途，其中，在无细胞蛋白质合成体系中还添加有作为辅因子的温度敏感元件。
[0087]
在一个更具体的实施方式中，提供了上述质粒在基于大肠杆菌提取物的无细胞蛋白质合成体系中用于合成目标蛋白质的用途，其中，在无细胞蛋白质合成体系中还添加有
作为辅因子的温度敏感元件噬菌体λ阻遏ci。
[0088]
在此，通过将提供含有表达该温度敏感元件的质粒的培养物来引入温度敏感元件。
[0089]
本发明在第三方面涉及：基于上述应用的各类产品。
[0090]
在一个具体实施方式中，提供了一种脂质体药物递送体系，其包括上述质粒；其中的目标蛋白是药物蛋白；原核细胞或真核细胞的无细胞提取物；以及温度敏感蛋白；并且该药物递送体系在给药至人体之前，需在低温下保存，以防止污染。
[0091]
本发明在第四方面涉及：一种温控无细胞反应体系的构建方法。
[0092]
在一个具体实施方式中，提供了一种温控无细胞反应体系的构建方法，该方法包括下述步骤：
[0093]-提供细胞提取物；
[0094]-使所述细胞提取物与下述质粒混合以形成温控无细胞反应体系，该质粒包括编码温度敏感元件的基因和位于所述编码温度敏感元件的基因下游的能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元以及位于所述操纵单元下游的表达目标蛋白的外源基因；
[0095]-任选：向所述温控无细胞反应体系中添加能量源物质和氨基酸混合液，无机盐，转录翻译辅助物质；
[0096]-任选：向所述温控无细胞反应体系中添加氧化物质和还原物质；
[0097]-在给定温度下在反应体系中表达所述目标蛋白。
[0098]
本发明进一步提供了另一种温控无细胞反应体系的构建方法，该方法包括下述步骤：
[0099]-提供包含温度敏感元件的细胞提取物与不包含温度敏感元件的细胞提取物的细胞提取物混合物；
[0100]-使所述细胞提取物混合物与下述质粒混合以形成温控无细胞反应体系，该质粒包括能够通过所述温度敏感元件调控的操纵单元以及位于所述操纵单元下游的表达目标蛋白的外源基因；
[0101]-任选：向所述温控无细胞反应体系中添加能量源物质和氨基酸混合液，无机盐，转录翻译辅助物质；
[0102]-任选：向所述温控无细胞反应体系中添加氧化物质和还原物质；
[0103]-在给定温度下在反应体系中表达所述目标蛋白。
[0104]
在一个具体的实施方式中，所述包含温度敏感元件的细胞提取物可以是，将含有温度敏感元件的质粒在细胞中进行表达到一定量，然后按照wen等人的方法(a cell-free biosensor for detecting quorum sensing molecules in p.aeruginosa-infected respiratory samples.acs synth.biol.2017,6(12),2293
–
2301.)制备所述细胞的提取物。
[0105]
在另一个具体的实施方式中，所述包含温度敏感元件的细胞提取物也可以是，将温度敏感元件直接添加入不包含温度敏感元件的细胞提取物中。
[0106]
所述不包含温度敏感元件的细胞提取物是指，细胞中没有将含有温度敏感元件的质粒在其中进行表达也没有添加温度敏感元件的细胞提取物，同样是按照wen等人的方法制备的。
[0107]
在一优选的实施方式中，本发明通过将表达了ci阻遏蛋白的大肠杆菌bl21star(de3)提取物，与不含ci阻遏蛋白的大肠杆菌bl21star(de3)的细胞提取物按照不同比例混合，与质粒pδci一起加入到无细胞体系中，构成了一种温控无细胞反应体系。
[0108]
在一个具体的实施方式中，所述包含温度敏感元件的细胞提取物中ci含量为7.2ug/ml。
[0109]
在进一步优选的实施方式中，包含温度敏感元件的细胞提取物和不包含温度敏感元件的细胞提取物的体积比为1:2-2:1，例如可以为1:2、1:1.5、1:1、1.5:1、2:1，优选的，所述含有ci的细胞提取物的体积分数为0.67，即，包含温度敏感元件的细胞提取物不包含温度敏感元件的细胞提取物的体积比为2:1。
[0110]
在一具体实施方式中，所述细胞是指大肠杆菌、古细菌、麦芽细胞、酵母细胞、兔网织红细胞、烟叶细胞、昆虫细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
[0111]
在又一具体实施方式中，所述细胞提取物是来自于大肠杆菌的、古细菌的、麦芽细胞的、酵母细胞的、兔网织红细胞的、烟叶细胞的、昆虫细胞的或中国仓鼠卵巢细胞的细胞提取物。
[0112]
在再一具体实施方式中，所述温度敏感元件和所述操纵单元配合使用，所述温度敏感元件和所述操纵单元选自噬菌体λ阻遏ci-pr-pl启动子、tlpa蛋白-tlpa启动子、大肠杆菌阻遏蛋白tetr温敏变体-tet操作子、大肠杆菌阻遏蛋白laci(ts)-laco位点+laci启动子或大肠杆菌热休克蛋白-phsp启动子中任意一种，优选，所述温度敏感元件和所述操纵单元选自噬菌体λ阻遏ci-pr-pl启动子。
[0113]
在又一具体实施方式中，所述能量源物质可以是蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸、谷氨酸盐、多磷酸盐和/或磷酸烯醇式丙酮酸。
[0114]
在再一具体实施方式中，所述氨基酸混合液包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。而所述转录翻译辅助物质选自：谷氨酸钾、谷氨酸铵、草酸钾、谷氨酸镁、氧化性谷胱甘肽、还原性谷胱甘肽、碘乙酰胺、腐胺、亚精胺、nad、nadh、atp、ctp、gtp、utp、amp、cmp、gmp、ump、coa、trna、亚叶酸中的一种或两种以上。
[0115]
在本发明的一个具体实施方式中，向所述温控无细胞反应体系中添加氧化物质和还原物质以使温控效果更好。
[0116]
优选的，所述氧化物质为氧化型谷胱甘肽(gssg)和还原物质为还原型谷胱甘肽(gsh)。
[0117]
谷胱甘肽(gsh)是细胞内含量最丰富的多功能抗氧化剂，它被证明是自由基解毒和活性亲电子试剂的天然捕获剂。此外，谷胱甘肽二硫(gssg)是一种内源性肽，是gsh的氧化形式。将这两种氧化还原调节剂按不同比例加入到含有pci质粒的tccfps中，得到不同的氧化还原条件。
[0118]
在一个优选的实施方式中，所述gssg与gsh的摩尔比为2:1-4:1，例如可以为2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1。
[0119]
在一个具体实施方式中，所述给定温度为37-40℃，例如可以为37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃。
[0120]
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0121]
实施例1:质粒构建
[0122]
噬菌体λ阻遏子ci是一种众所周知的温度敏感变体，作用于串联pr-pl操作子-启动子，它能有效调控启动子下游克隆的基因。当温度低于37℃(通常是28-32℃)时，它会抑制基因表达，而当宿主rna聚合酶将温度提高到37℃以上时，突变的抑制因子会失活并转录，所述调控机制如图2所示。
[0123]
本发明使用的所有质粒都是按照标准的分子生物学技术构建的。
[0124]
本发明以psb3k3质粒(购自addgene(addgene#78636)37)为骨架，选择绿色荧光蛋白gfp作为报告蛋白(由genewiz公司合成)。荧光报告基因在pl/pr启动子控制下通过gibson装配克隆，将表达抑制子ci和包含pr-pl操作启动子和gfp荧光报告蛋白的温控回路的基因连接到psb3k3质粒骨架上，得到质粒psb3k3-ci-gfp(这里称为pci质粒)，如图3a所示。以同样的方法构建敲除ci蛋白基因的质粒，命名为psb3k3-gfpδci(以下简称pδci)作为阴性对照，如图3b所示。
[0125]
质粒dna纯化采用omega质粒mini kit和qiagen质粒maxi kit。质粒序列经天翼生物技术验证。
[0126]
质粒制备过程中的启动子、rbs及部分基因序列信息如表1所示.
[0127]
表1 启动子、rbs及部分基因序列信息
[0128]
[0129][0130]
pci质粒的dna部分序列参见序列表的seq id no.7，该序列依次包括ci基因序列，pr操纵子序列、pl操纵子序列以及gfp基因序列。
[0131]
pδci质粒的dna部分序列参见序列表的seq id no.8，该序列依次包括pr操纵子序列、pl操纵子序列以及gfp基因序列。
[0132]
实施例2：质粒在细胞体系中的表达
[0133]
将pci质粒和pδci质粒转入大肠杆菌bl21 star(de3)中，分别在30℃和37℃条件下培养12小时。然后测定细菌溶液的od600和荧光强度。结果如图4所示，pci质粒在37℃的gfp水平均高于30℃，证实构建的pci质粒可以在细胞内预期的高温下激活靶蛋白的表达。
[0134]
实施例3：质粒在无细胞体系中的表达
[0135]
通过将pci质粒直接加入无细胞体系，在不同温度下启动反应，检测tccfps的蛋白合成控制能力。
[0136]-大肠杆菌bl21 star(de3)无细胞提取物(简称bs)制备
[0137]
用大肠杆菌过夜培养，将200ml 2
×
yt-p培养基接种在1-l烧瓶中，稀释倍数为1:20。将培养物加入4l发酵罐，37℃，500rpm培养3.5小时。用100ml冰冻s30a缓冲液(14mm mg-谷氨酸，60mm k-谷氨酸，50mm tris,ph 7.7)洗涤细胞微球两次，然后在8000
×
g 4℃下离心15分钟。然后用30ml冰冻s30a缓冲液重悬细胞微球，转入预称量50ml falcon锥形管中，4℃10000
×
g离心10分钟。最后，重称管子，在-80℃储存之前将其快速冷冻在氮气中。
[0138]
第二天，将冰冻的细胞微球在冰中解冻，然后每克细胞微球用1ml s30a缓冲液重新悬浮。细胞悬液经高压破碎机2次裂解，压力为15000-20000psi,4℃12000
×
g离心10分钟，分离细胞质。离心后，小心将上清转移到新试管中，每1ml裂解液加入3μl 1m dtt。37℃,120转/分钟摇匀80分钟，内源性核酸酶消化剩余mrna。将提取液4℃12000
×
g离心10分钟，上清转至6-8kda的mwco透析袋中，在1l的s30b缓冲液(14mm mg-glutamate,60mm kglutamate，～5mm tris,ph 8.2)中在4℃下透析3小时。4℃ 12000
×
g下再离心10分钟。收集上清液，得到大肠杆菌bl21 star(de3)无细胞提取物。
[0139]-无细胞体系中的表达
[0140]
向所述无细胞提取物中添加构建好的质粒，报告蛋白为绿色荧光蛋白gfp，质粒添
加量为300ng，将无细胞体系分装，构成tccfps(温控无细胞蛋白质合成体系)。
[0141]
分别在不同温度下启动反应。结果如图5所示，pci质粒在37℃的gfp水平均高于30℃，构建的pci质粒可以在bs提取液的tccfps(温控无细胞蛋白质合成体系)中发挥高温激活蛋白合成的功能。
[0142]
实施例4：无细胞蛋白合成体系的氧化还原特性对翻译蛋白的折叠影响本发明进一步验证了不同氧化还原条件下pci质粒的温控表达效果。
[0143]
谷胱甘肽(gsh)是细胞内含量最丰富的多功能抗氧化剂，它被证明是自由基解毒和活性亲电子试剂的天然捕获剂。此外，谷胱甘肽二硫(gssg)是一种内源性肽，是gsh的氧化形式。将这两种氧化还原调节剂按不同比例加入到含有pci质粒的tccfps中，得到不同的氧化还原条件。分别在不同温度下启动反应。
[0144]
结果如图6所示，过量添加gsh溶液的反应体系在30℃和37℃两种温度下，pci质粒的gfp表达差异没有特别大，而过量添加gssg溶液到tccfps中，gfp蛋白表达的温控效果较好。当gssg与gsh的摩尔比值为2、3、4，即比为2:1-4:1时，gfp蛋白表达的温控效果较突出，尤其是3:1时，温控诱导表达倍数最高，为3.40。这是因为不同的gssg/gsh比值改变了细胞游离体系的氧化还原电位，影响了蛋白质二硫键的形成，而部分氧化(gssg)条件在tccfps中可获得最佳的控温效果。
[0145]
实施例5：通过在细胞提取物中表达噬菌体λ阻遏子ci对无细胞体系的温控效果
[0146]
该实验使用了含有ci阻遏蛋白的提取物对pδci进行测试，将表达了ci(ci含量为7.2ug/ml)阻遏蛋白的大肠杆菌bl21star(de3)提取物，与原有不含ci阻遏蛋白的细胞提取物按照不同比例混合，与质粒pδci一起加入到无细胞体系中，无细胞体系中gssg:gsh比值为3:1，其他条件与实施例3相同。观察不同体积分数的ci-bs细胞提取物的混合细胞提取物时，gfp的平均荧光在37℃和30℃下的表达水平和比值，结果如图7所示，在添加了不同量ci-bs细胞提取物的情况下，在无细胞体系中均能实现温控效果，说明外源表达的ci能够赋予pδci温控能力，特别是当含有ci的提取物的体积分数为0.67时有最好的温控效果，此时ci蛋白的浓度为4.8ug/ml。
[0147]
实施例6：tccfps表达动力学研究
[0148]
为了进一步探究tccfps转录和蛋白表达水平升高的机制，使用了基于大肠杆菌bl21star(de3)提取物、质粒为pci、gssg:gsh比值为3:1的tccfps体系为观察对象，在不同温度下，在不同时间点对tccfps进行了8小时的探究，结合mrna水平的检测探究体系的表达动力学。
[0149]-tccfps体系的转录过程
[0150]
采用实时定量pcr检测体系(qpcr)对上述tccfps体系的转录过程进行监测。分别观察不同温度(30℃、37℃)下ci基因转录的mrna水平(这里称为ci-mrna)，结果如图8所示，在30℃和37℃的条件下，ci基因转录的mrna水平在前2小时内均急剧上升，然后下降，最后达到稳定水平，mrna的降解率与dna转录率达到了平衡，而在稳定水平阶段，30℃的ci-mrna明显高于37℃，说明ci基因在37℃时能够发挥抑制作用的量已经远低于30℃。
[0151]
同时观察gfp基因转录水平(这里简称gfp-mrna)，结果如图9所示，尽管在前一小时内，37℃时gfp基因转录的mrna水平(这里简称gfp-mrna)略低于30℃，但在一小时后，37℃的gfp-mrna急剧下降到较低水平而达到平衡，说明ci蛋白对pr-pl操纵启动子的抑制作
用造成30℃时gfp-mrna较低，而37℃时ci蛋白的表达量下降较缓慢，说明在37℃及以上时，ci蛋白失活，rna聚合酶进行转录，使gfp基因具有较高的转录水平。
[0152]
实施例7：质粒在人工细胞中的表达
[0153]
模仿活细胞结构和功能特征的人工细胞可用于进一步研究生命的物理原理，促进细胞工程和生物医学的发展。无细胞体系的发展极大地促进了人工细胞的发展。人工细胞中蛋白质和酶的合成已被成功地证明。在本发明中，tccfps被分隔成可以对热信号作出反应的人工细胞。这种具有高温启动蛋白合成功能的人工细胞可以作为药物合成和传递的潜在载体，当体内发生发热等异常热反应时，允许特定部位合成并释放治疗性蛋白。
[0154]-制备脂质溶液
[0155]
油包水(w/o)乳液转移方法用于创建包含无细胞温度控制体系的人工细胞室。使用先前研究提出的协议的修改版本，脂质溶液用于制备脂质体。
[0156]
将30μl popc氯仿溶液(100mg/ml)和15μl胆固醇氯仿溶液(100mg/ml)溶解于450μl液态石蜡中，并加入1μl liss rhod(丽丝胺碱性蕊香红b磺酰氯)使脂质呈红色。为了使氯仿充分蒸发，将溶液在80℃加热1h，得到脂质溶液。
[0157]-制备含tccfps的外溶液和内溶液。
[0158]
内部的溶液由无细胞试剂组成，加入40毫克葡萄糖，在小瓶中制备，并放置在冰上，以防止反应的发生。外溶液采用与内溶液相同的组分和浓度制备，不添加质粒，外溶液中加入相同摩尔浓度的葡萄糖。内外溶液浓度应保持一致。如果外部溶液浓度较低，会导致内部小分子量组分从脂质体内泄漏到外。
[0159]-制备脂质体
[0160]
将100μl脂质溶液添加到200μl外溶液(ls-os)中，并在冰上孵育30分钟以形成油水界面。将2μl内溶液添加到150μl脂质溶液(ls-is)中，旋转1分钟，然后在冰上孵育20分钟。将ls-is溶液缓慢加入ls-os溶液中，4000g，4℃离心15分钟。将下层的脂质体悬浮液转移到另一个1.5mleppendorf管中，与200μl新鲜外溶液混合，4000g，4℃离心10分钟。去除上清液，将脂质体颗粒悬浮在20-50μl的外液中。就得到了包封了先前构建的tccfps体系溶液的脂质体，如图10所示。
[0161]
实施例8
[0162]
通过流式细胞术(bd lsrfortessa sorp)分析30℃和37℃条件下包封了先前构建的tccfps体系溶液的脂质体中的反应，检测蛋白质生成的影响。在19例流式细胞分析中，检测了gfp的单个荧光信号。测量总共获得了60000个数据样本。gfp用488nm激发，550
±
30nm带通滤波器检测发射。从流式细胞术结果显示，如图11所示，包裹tccfps的脂质体对温度控制有反应，脂质体在37℃下反应产生的荧光蛋白比在30℃下反应产生的荧光蛋白多，并且在高荧光波段的脂质体数量百分比较高。
[0163]
实施例9
[0164]
通过共聚焦显微镜(zeiss lsm710)观察如上所述反应后的脂质体。测量前，用稀释缓冲液(100mm hepes-koh ph 7.6,24mm乙酸镁，280mm谷氨酸钾，1.5mm dtt,200mm葡萄糖)稀释囊泡至适当浓度。显微镜观察用
×
63物镜。通过相应的滤光片获得gfp的荧光图像，结果表明，囊泡的大小通常在5-20μm之间，在30℃和37℃条件下捕获了一些清晰的荧光囊泡，如图12所示。图12a和12b中发光部分为染在脂质体膜上的liss rhod所发出的荧光，图
中可以看出，在30℃和37℃条件，脂质体形态都是正常的，图12c和12d中还包括gfp发光部分，在488nm的激发波长下观察到的gfp所发出的荧光，结果表明37℃条件下，脂质体内的gfp表达量非常高，目标蛋白的表达效果很好，模拟出了表达强烈荧光的人工细胞。
[0165]
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。