一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法与流程

1.本发明涉及免疫系统技术领域，具体涉及一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法。


背景技术：

2.白细胞是血液中除红细胞和血小板以外的其他血细胞的统称，包含五大类：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，他们主要参与机体的防御和免疫功能，淋巴细胞占白细胞总数的20-30％，包括b淋巴细胞，t淋巴细胞和自然杀伤细胞三种，淋巴细胞对于调节机体细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和创伤愈合以及协调机体免疫防御体系，维持机体内环境稳定发挥重要作用。
3.淋巴细胞的调节功能主要是靠其释放的细胞因子来发挥，细胞因子除了对自身细胞可发挥调节作用外，还对邻近的细胞以及远处的细胞发挥旁分泌和内分泌调节作用，从而发挥调节机体固有免疫和适应性免疫的平衡、促进血细胞生成和组织细胞生长以及促进损伤组织修复等多种功能。
4.因此将白细胞中的提取物中的具有活性的细胞因子提取出来进行研究应用将具有身份重要的意义，但目前白细胞提取物所用原料为成人外周血白细胞，经过裂解并除去杂质获得以核苷酸为主的产物，这个方法的细胞来源少，产率低，且人外周血中的白细胞已经走向衰老，分泌活性细胞因子的能力开始下降，因此需要一种新的方式来提取活性细胞因子。


技术实现要素：

5.本发明要解决的问题是提供了一种能够提取活性细胞因子且产率较好的脐带血淋巴细胞制剂的制备方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，包括以下具体步骤：
7.s1：取新生儿脐带血，加入淋巴细胞分离液，离心，吸取白膜层，洗涤，获得脐带血间充质干细胞，将脐带血间充质干细胞进行传代培养；
8.s2：取新生儿脐带血，加入红细胞裂解液进行裂解，裂解液经密度梯度离心，获得脐带血淋巴细胞，将脐带血淋巴细胞进行培养；
9.s3：将所述脐带血间充质干细胞与所述脐带血淋巴细胞分别转移至共培养装置中，加入空白培养基进行共培养；
10.s4：对患者进行血液提取，采用血细胞分离器提取患者的淋巴细胞，采用外循环系统，使患者的淋巴细胞在共培养装置内循环驯养；
11.s5：采用抗体对淋巴细胞进行活化，促进淋巴细胞增殖；
12.s6：将循环一定时间后的淋巴细胞重新输回患者体内，提取共培养装置内的细胞因子进行冻干，得到成品。
13.进一步的，步骤s3中，将所述脐带血间充质干细胞与脐带血淋巴细胞分别采用培
养基洗吹三次，离心，采用培养基进行吹打获得重悬细胞，转移至共培养装置中培养24-48h。
14.进一步的，步骤s6中，制备细胞因子冻干粉包括如下步骤：
15.将空白培养基加入s3所述的共培养装置中，24h-48h后收取脐带血淋巴细胞培养上清液；在4℃，2000g的条件下离心30min，弃去沉淀，得到培养上清液；
16.将所述培养上清液与外泌体提取液以体积比2:1进行混合，在4℃条件下孵育过夜，得到孵育液，将孵育液在4℃，10000g的条件下离心60min，吸取底部沉淀，获得含外泌体的浓缩液；
17.将浓缩液用pbs缓冲液进行溶解，得到外泌体盐溶液，将所述外泌体盐溶液进行冻干，得到细胞因子冻干粉。
18.进一步的，所述冻干温度为-80℃，冻干12h。
19.进一步的，步骤s4中，所述血液与淋巴细胞分离后重新输送至患者体内。
20.进一步的，步骤s5中，抗体为白细胞介素2或抗cd3抗体的一种。
21.进一步的，步骤s1中，所述淋巴细胞分离液为羟乙基淀粉与泛影葡胺溶于蒸馏水中高压灭毒后制成。
22.进一步的，所述羟乙基淀粉与泛影葡胺的质量比为2:3-3:2。
23.进一步的，步骤s2中，所述红细胞裂解液为质量分数0.8％的氯化铵溶液，所述氯化铵溶液为氯化铵溶解于pbs缓冲液，并经过高压灭毒后制成。
24.进一步的，所述细胞因子冻干粉内含有细胞因子，所述细胞因子为干细胞与免疫细胞共培养的外泌体，所述细胞因子的活性单位为5000u/g。
25.进一步的，所述淋巴细胞含有粒细胞和巨噬细胞等，所述共培养装置中的培养基均为rpmi1640培养基，共培养的培养基也为rpmi1640培养基。
26.与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：
27.本发明通过免疫细胞与干细胞进行共培养，能够诱导淋巴细胞与脐带血间充质干细胞、脐带血淋巴细胞进行相互作用，淋巴细胞能够促进脐带血淋巴细胞分泌细胞因子，且脐带血淋巴细胞具有较好的增殖分化的作用，从而能够提高活性细胞因子的产，且脐带血淋巴细胞为未分化的淋巴细胞，其活性较强，分泌活性细胞因子的能力也较强，因此提取得到的细胞因子的活性相较于成体的外周淋巴细胞更好；
28.且通过脐带血淋巴细胞能够对淋巴细胞进行调节，能够减少炎性细胞因子的数量，且淋巴细胞且将分离出的淋巴细胞重新输送回人体内，从而能够使其在人体内具有一定的作用，有效减少人体疾病的发生；
29.而成体的淋巴细胞也能起到部分促进脐带血淋巴细胞分化的作用，从而缩短脐带血淋巴细胞回输体内后的适应时间，提升免疫平衡能力。
具体实施方式
30.实施例1：
31.s1：取新生儿脐带血，加入10g羟乙基淀粉与15g泛影葡胺至75g的蒸馏水中，混匀后高温杀毒，制成的淋巴细胞分离液，离心，吸取白膜层，洗涤，获得脐带血间充质干细胞，将脐带血间充质干细胞进行传代培养，用0.25％的胰蛋白酶对间充质干细胞进行消化，加
入rpmi1640培养基终止消化，将其接种至t25培养瓶中，培养24h后更换培养基，培养7d；
32.s2：取新生儿脐带血，加入红细胞裂解液进行裂解，使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，采用培养基洗吹三次，裂解液经密度梯度离心，1000转/min离心5min收集细胞，获得脐带血淋巴细胞，将免疫细胞采用加入血浆和白介素-2和沙培林的rpmi1640培养基中进行培养，血浆的含量为体积的10％，将脐带血淋巴细胞转移至培养瓶中培养24h；红细胞裂解液为质量分数0.8％的氯化铵溶液，所述氯化铵溶液为氯化铵溶解于pbs缓冲液，并经过高压灭毒后制成；
33.s3：将所述脐带血间充质干细胞与脐带血淋巴细胞分别采用培养基洗吹三次，离心，采用培养基进行吹打获得重悬细胞，转移至分别转移至具有共培养膜的可调节压力和流量且具有外循环系统的共培养装置的两侧，加入含有10％血清的空白培养基培养24h；
34.s4：对患者进行血液提取，采用血细胞分离器提取患者的淋巴细胞，采用外循环系统，使患者的淋巴细胞在共培养装置内循环驯养，所述血液与淋巴细胞分离后重新输送至患者体内；
35.s5：采用白细胞介素2对淋巴细胞进行活化，白细胞介素2的终浓度为10μg/ml，促进淋巴细胞增殖；
36.s6：将循环一定时间后的淋巴细胞重新输回患者体内，将空白培养基加入共培养装置中，24h后收取脐带血淋巴细胞培养上清液；在4℃，2000g的条件下离心30min，弃去沉淀，得到培养上清液；
37.将培养上清液与外泌体提取液以体积比2:1进行混合，在4℃条件下孵育过夜，得到孵育液，将孵育液在4℃，10000g的条件下离心60min，吸取底部沉淀，获得含外泌体的浓缩液；
38.将浓缩液用pbs缓冲液进行溶解，得到外泌体盐溶液，将外泌体盐溶液进行冻干，冻干温度为-80℃，冻干12h，得到细胞因子冻干粉，得到成品。
39.实施例2：
40.s1：与实施例1相同，不同在于淋巴细胞分离液中加入15g羟乙基淀粉与10g泛影葡胺；
41.s2-s4与实施例1相同，不同在于脐带血淋巴细胞转移至培养瓶中的培养时间为36h；
42.共培养装置中加入含有10％血清的空白培养基的培养时间为36h；
43.s5：采用抗cd3抗体对淋巴细胞进行活化，抗cd3抗体的终浓度为10μg/ml，促进淋巴细胞增殖；
44.s6：与实施例1相同，不同在于将空白培养基加入共培养装置中的培养时间为36h，作为实验组b。
45.实施例3：
46.s1：与实施例1相同，不同在于淋巴细胞分离液中加入10g羟乙基淀粉与10g泛影葡胺至80g蒸馏水中；
47.s2-s4与实施例1相同，不同在于脐带血淋巴细胞转移至培养瓶中的培养时间为48h；
48.共培养装置中加入含有10％血清的空白培养基的培养时间为48h；
49.s5：采用白细胞介素2或抗cd3抗体对淋巴细胞进行活化，抗cd3抗体的终浓度为5μg/ml，白细胞介素2的终浓度为5μg/ml，促进淋巴细胞增殖；
50.s6：与实施例1相同，不同在于将空白培养基加入共培养装置中的培养时间为48h，作为实验组c。
51.实施例4：
52.s1：与实施例1相同，不同在于淋巴细胞分离液中加入8g羟乙基淀粉与10g泛影葡胺至82g蒸馏水中；
53.s2-s4与实施例1相同，不同在于脐带血淋巴细胞转移至培养瓶中的培养时间为36h；
54.共培养装置中加入含有10％血清的空白培养基的培养时间为36h；
55.s5：采用白细胞介素2或抗cd3抗体对淋巴细胞进行活化，抗cd3抗体的终浓度为5μg/ml，白细胞介素2的终浓度为5μg/ml，促进淋巴细胞增殖；
56.s6：与实施例1相同，不同在于将空白培养基加入共培养装置中的培养时间为36h，作为实验组d。
57.实施例1-4中变量如表1所示：
58.表1.实施例1-4中各变量
[0059][0060]
实验例1：
[0061]
该实验例考察了各成分浓度对成品消炎效果的影响。
[0062]
对照组：采用的是成体外周淋巴细胞进行培养后的上清液进行细胞因子的提取，并于-80℃下，冻干8h得到的；
[0063]
实验组a、实验组b、实验组c、实验组d、实验组e:按照实施例1的方法制备用于解决青春痘的细胞因子敷料，所不同的是白细胞介素2的终浓度分别为2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml；
[0064]
实验组f、实验组g、实验组h、实验组i、实验组j：按照实施例1的方法制备用于解决青春痘的细胞因子敷料，所不同的是抗cd3抗体的终浓度分别为2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μ
g/ml、10μg/ml；
[0065]
实验组k、实验组l、实验组m：采用抗cd3抗体与白细胞介素2复配活化淋巴细胞，抗cd3抗体与白细胞介素2按照1:1配置，抗cd3抗体与白细胞介素2的终浓度为4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml；
[0066]
测定对照组与实验组a-m中提取的制剂对人成纤维细胞(hff-1)细胞的促增殖活性检测，采用对数生长期的hff-1细胞，用无血清培养基进行培养，将其加入96孔板中，将对照组与实验组a-m中提取的制剂分别接种至各孔中，于培养箱37℃，5％co2的条件下孵育72h，然后加入cck-8溶液10μl/孔，继续培养2h，采用酶标仪测定hff-1细胞在波长450nm处的吸光度值，来计算hff-1细胞的促增殖活性，结果如表2所示。
[0067]
表2.面部炎症改善情况
[0068]
组别抗cd3抗体浓度(μg/ml)白细胞介素2浓度(μg/ml)促增殖活性(％)对照组0036.12实验组a0245.21实验组b0468.34实验组c0682.31实验组d0893.31实验组e010121.35实验组f2047.35实验组g4059.32实验组h6076.24实验组i8096.52实验组j100112.58实验组k2275.84实验组l44112.64实验组m55146.21
[0069]
通过炎症改善情况的测定，能够看出实验组k-m中能够看出通过两种抗体复配能够起到较好的促进脐带血淋巴细胞分泌活性细胞因子的作用，而细胞因子的活性较高从而能够间接促进人成纤维细胞的增殖，而其他实验组中均采用单一的抗体，相较于实验组k-m较差，但仍能较好的促进脐带血淋巴细胞的活性，且抗体的效果随着抗体的浓度升高而升高；
[0070]
本发明通过免疫细胞与干细胞进行共培养，能够诱导淋巴细胞与脐带血间充质干细胞、脐带血淋巴细胞进行相互作用，淋巴细胞能够促进脐带血淋巴细胞分泌细胞因子，且脐带血淋巴细胞具有较好的增殖分化的作用，从而能够提高活性细胞因子的产，且脐带血淋巴细胞为未分化的淋巴细胞，其活性较强，分泌活性细胞因子的能力也较强，因此提取得到的细胞因子的活性相较于成体的外周淋巴细胞更好；
[0071]
且通过脐带血淋巴细胞能够对淋巴细胞进行调节，能够减少炎性细胞因子的数量，且淋巴细胞且将分离出的淋巴细胞重新输送回人体内，从而能够使其在人体内具有一定的作用，有效减少人体疾病的发生；
[0072]
而成体的淋巴细胞也能起到部分促进脐带血淋巴细胞分化的作用，从而缩短脐带
血淋巴细胞回输体内后的适应时间，提升免疫平衡能力。
[0073]
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。