阿尔茨海默病检测试剂盒、存储介质及电子设备

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种阿尔茨海默病检测试剂盒、存储介质及电子设备。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,ad)是一种起病过程隐匿的神经退行性疾病，其病发的群体主要集中在65岁以上。在未来，因患者人数增加带来高昂的护理成本无疑会给社会和家庭带来沉重的经济负担。然而，在患者数量快速增加的背景下，ad的病因尚不明了，且无有效的治疗药物。鉴于ad的发生过程缓慢，许多细微的病理变化在病发症状出现前10-20年就已经发生，如果能及早发现与ad相关的病理变化，并及早干预，这将是应对ad 的有效手段。因此，寻找诊断ad的生物标记物刻不容缓。
3.早期的ad临床诊断标准是根据记忆、意识、认知等特征来评判受试者是否患有ad，这些指标易受非相关因素的干扰，对ad神经病理变化的描述既不特异也不灵敏，在ad的诊断上不具有客观性。直到2011年，美国国家衰老研究所与阿尔茨海默病协会(nia-aa)将ad病理性诊断作为标准，主要是以病理性tau蛋白和aβ作为检测的标记物。随着对ad认识的深入，现在越来越多的研究者认识到生物标记物在整个疾病的进程中应保持统一。传统的标记物aβ和 tau过于单一化，需要引入更多的反映病理性变化的标记物，且这种标记物可以用来评估ad的发展进程。因此，2018年nia-aa又进一步进行了修改，将神经变性生物标志物纳入到ad的诊断上。到目前为止，用于ad诊断的标记物包括两大类：体液标记物和影像标记物。体液标记物包括脑脊液和血液中病理性蛋白aβ、tau蛋白(包含t-tau和p-tau)和神经变性标记物。虽然现在认为神经变性标记物也是提供病理分期的重要指标，但是缺乏由ad引起的特异性神经变性标记物，因此目前主要还是以aβ、tau蛋白为主。脑脊液诊断结果可信度高，是目前比较公认的方法，鉴于脑脊液的获取会带来创伤，且检查费用昂贵，这使得该方法难以推广。外周血液获取虽无创伤，可所含的标志物aβ和tau含量低，给诊断技术带来更高要求。影像标志物的检测则主要包含pet成像和功能磁共振成像，这类诊断灵敏度高、特异性强，但受限于技术和费用问题，也难以推广。因此，寻找特异性高的无创性检测生物标记物是目前急需解决的科学问题。
4.bdnf是一种在海马中高水平表达的神经营养因子，对突触的可塑性和记忆形成具有重要的作用。目前临床数据表明，健康受试者血清和脑脊液中bdnf 的水平高于轻度认知障碍(mci)和痴呆患者，另有研究证明血清中bdnf的水平与脑脊液中的aβ42水平呈正相关，血清中bdnf水平降低与内侧颞叶萎缩及ad的严重程度相关。这些证据提示bdnf与ad具有关联性，bdnf有作为诊断ad标志物的潜质，但是鉴于这种检测对灵敏度要求高，而且相比基因的检测存在滞后性问题。


技术实现要素：

5.本研究通过实例提供一种可用于诊断阿尔茨海默病的mirna诊断标志物，以解决
现有诊断标志物存在不足的问题，为阿尔茨海默病的筛查和早期干预提供参考。
6.本发明在ad模型动物和ad模型细胞上初步筛选出具有潜力的差异 mirnas(靶向调控ad病理性标志物蛋白)，接着以临床上确诊为mci、ad、 pd及精神疾病患者血浆样本来检验候选差异mirnas作为诊断ad的可行性。本发明以期通过检测者和正常人血浆中mirna水平的差异倍数，进而以此差异倍数作为患ad风险的评估参数，这样更好地规避了蛋白标志物丰度低和差异现象滞后的问题。
7.为了实现上述的目的，本发明按照如下技术方案进行实施：
8.标志物mir-206-3p在制备阿尔茨海默病诊断或治疗药物中的应用。
9.优选地，所述mir-206-3p的成熟的核苷酸序列为：
10.5'-uggaauguaaggaagugugugg-3'。
11.本发明还提供一种用于诊断阿尔茨海默病的试剂盒，所述的试剂盒包含有用于检测mir-206-3p含量的检测试剂。
12.优选地，所述检测试剂包含有用于扩增mir-206-3p的引物。
13.优选地，所述的引物的序列为：
14.(上游引物序列)5
’‑
ggaatgtaaggaagtgtgtggaaa-3’，(下游引物序列)5
’‑
gtccagtttttttttttttttctcg-3’或(上游引物序列) 5
’‑
cacgcatggaatgtaaggaagt-3’，(下游引物序列)5
’‑
ccagtgcagg gtccgaggt-3’或(上游引物序列)5
’‑
ggccacatgcttctttatatcct-3’， (下游引物序列)5
’‑
ccaaaaccacacacttccttac-3’或(上游引物序列)5
’ꢀ‑
aggccacatgcttctttatatcc-3’，(下游引物序列)5
’‑
ccaaaaccacac acttccttacat-3’或(上游引物序列)5
’‑
caggccacatgcttctttatatc
‑ꢀ3’
，(下游引物序列)5
’‑
caaaaccacacacttccttaca-3’中的至少一对。
15.优选地，所述检测试剂包含有用于检测mir-206-3p含量的探针。
16.优选地，所述的探针的序列为：5
’‑
digoxin-ccacacacuuccuuacauucca
‑ꢀ
digoxin-3’或5
’‑
digoxin-acacacuuccuuacauucca-digoxin-3’或5
’‑
digoxi n-cacacuuccuuacauucca-digoxin-3’中的至少一种。
17.本发明还提供一种筛选用于治疗阿尔茨海默病的药物的方法；包括：
18.步骤1：用待选药物处理ad模型动物或ad模型细胞；
19.步骤2：检测处理后的ad模型动物或ad模型细胞中mir-206-3p的量；
20.步骤3：根据所获取mir-206-3p含量进行药物筛选；若待选药物降低了 mir-206-3p的含量则待选药物为筛选得到的目标药物。
21.本发明还提供一种存储介质，所述存储介质上存储有计算机可执行的程序代码，所述程序代码被计算机系统的一个或多个处理器执行时，所述计算机系统执行一种阿尔茨海默病的诊断方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：获取受试者的检测样本中mir-206-3p的含量t和正常人的检测样本中mir-206-3p的含量 n；所述受试者年龄大于55岁；
22.步骤2：计算r＝t/n；
23.步骤3：若r≤1时，即可以理解为，当t小于等于n时，则输出受试者为健康，否则输出为不健康，此处可以理解为当t大于n时，即mir-206-3p高于正常人或者所设定的判断阈值时，则为不健康。此处的不健康指的是不健康的多种状态的至少其中一种。此时，所述的n可以为作为参照同时检测的正常人的mir-206-3p含量数值，或者为通过在先检测获得的判
断阈值。
24.更进一步的，步骤3为：
25.若r≤2.15时，则输出受试者为健康；当采用此判断值时，采用了更加严格的判断标准，出具的结果会更加准确，即要求t远大于n值，才认定为不健康状态；
26.若2.15《r≤4.23时；则输出受试者为处于发展为轻度认知障碍阶段；
27.若4.23《r≤5.7时；则输出受试者为处于轻度认知障碍向ad阶段发展；
28.若5.7《r时；则输出受试者为患有ad。
29.本发明还提供一种电子设备，包括：一个或多个处理器；以及存储装置，存储一个或多个程序；当所述一个或多个程序被所述一个或多个处理器执行，使得所述一个或多个处理器实现阿尔茨海默病诊断方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：获取受试者的检测样本中mir-206-3p的含量t和正常人的检测样本中 mir-206-3p的含量n；所述受试者年龄大于55岁；
30.步骤2：计算r＝t/n；
31.步骤3：若r≤1时，则输出受试者为健康，否则输出为不健康。此时，所述的n可以为临时检测的正常人的mir-206-3p含量数值，亦可以为通过在先检测获得的判断阈值。
32.更进一步的，步骤3为：
33.若r≤2.15时，则输出受试者为健康；
34.若2.15《r≤4.23时；则输出受试者为处于发展为轻度认知障碍阶段；
35.若4.23《r≤5.7时；则输出受试者为处于轻度认知障碍向ad阶段发展；
36.若5.7《r时；则输出受试者为患有ad。
37.本发明通过研究发现mir-206-3p参与调控阿尔茨海默病的病程，主要通过如下的方式实现：在阿尔茨海默病发病过程中，异常激活的星形胶质细胞会高水平表达mir-206-3p，而高水平表达的mir-206-3p会通过外泌体来传递给靶细胞，定向结合靶细胞中bdnf的3’utr区域，抑制bdnf的表达，减弱神经元生长及正常功能的维持，进而加速ad的病理发展。
38.本发明提供的用于阿尔茨海默病诊断的mirna标记物，所述的具体方法为：首先，qpcr检测寡聚aβ处理后的原代星形胶质细胞中mir-206-3p的水平，原位杂交检测app/ps1转基因小鼠大脑内mir-206-3p的异常变化，通过对比正常组和模型组中mir-206-3p的异常变化，初步确认mir-206-3p具有作为病理指标的潜在可能性；接着在ad模型动物上，检测9月龄的app/ps1小鼠及同窝野生型对照小鼠血浆中mir-206-3p的水平，以确定血浆中mir-206-3p作为阿尔茨海默病诊断标记物的可行性；最后，在临床上分别对比健康志愿者与轻度认知障碍患者、阿尔茨海默病患者、帕金森患者、精神分裂症患者、精神障碍患者、焦虑和抑郁患者血浆中mir-206-3p的水平，若临床数据中存在mir-206-3p在ad 患者血浆中高表达，且伴随着疾病进程而升高，则指示mir-206-3p可以作为ad 诊断的标记物。
39.本发明的有益的效果在于：本发明从实例中发现ad模型细胞(大脑中占比最高的星形胶质细胞细胞)、转基因ad模型小鼠(app/ps1)、临床ad病人血浆样本中mir-206-3p水平显著高于正常对照组。进一步临床数据表明，轻度认知障碍患者血浆中mir-206-3p的水平是正常人4.23倍，痴呆患者血浆中 mir-206-3p水平是正常人的5.7倍，且这种倍数差异高于精神分裂和精神障碍等精神疾病。这些发现表明，mir-206-3p在ad的诊断上具有偏向性，可以为ad 的诊断提供一定的预警作用，具有应用于ad早期诊断的潜在价值。
附图说明
40.为了清楚地展示本发明具体的实施方式以及在实验中采用的某些检测技术，下面将对实施方案及采用的技术进行描述，主要通过附图的形式进行介绍。
41.图1为mirnas在体外ad模型星形胶质细胞外泌体中表达水平的富集分析图。图1a为正常对照组和ad模型组差异mirnas表达水平结果的热图，图1b 为差异mirnas靶基因参与的信号通路富集分析图。
42.图2为外泌体中差异mirnas的qpcr验证图。
43.图3为mir-206-3p在体外ad模型星形胶质细胞中的检测图。
44.图4为mir-206-3p在app/ps1小鼠皮质中表达水平的检测图。
45.图5为mir-206-3p在app/ps1小鼠海马中表达水平的检测图。
46.图6为原位杂交检测mir-206-3p在app/ps1脑切片中的表达水平的检测图。在图a中荧光信号强表明mir-206-3p的水平高，图b为统计分析图。
47.图7为mir-206-3p结合bdnf的3
’‑
utr检测结果图。图7a为结合位点示意图，图7b为结合位点及突变位点的测序峰图，图7c为双荧光素酶实验检测结果图。
48.图8为mir-206-3p在app/ps1小鼠血浆中表达水平的检测图。
49.图9为比较mir-206-3p在ad病人及其他精神疾病类受试者血浆中表达水平的检测结果图。
50.具体实施的方式
51.本发明具体的实施方式通过实施例来辅助解释，除检测所用的技术对本发明不做任何形式的限制外，描述的实施例中部分方案属发明的一部分实施例，在本领域的普通技术操作人员在没有创造性的成果获得的实施例，均属本发明的保护范围。
52.实施例1小rna测序技术检测mir-206-3p在ad病理状态下星形胶质细胞外泌体中高表达
53.使用iiiumina hiseq
tm
2500系统对星形胶质细胞外泌体中mirnas进行检测，图1a为mirnas差异分析结果(左侧为对照组右侧为处理组)，图中展示了ad病理下和正常状态下星形胶质细胞外泌体中存在显著差异的10个 mirna，且在这10个差异mirnas中，mir-206-3p的差异倍数位居首位。图 1b为这些差异mirna靶基因参与的信号通路富集情况。由图可知，排前2位的分别为调控轴突生长，神经营养因子信号途径。而参与2个途径调控的显著性 mirnas包含mir-206-3p，说明mir-206-3p在ad的病理过程中可能扮演重要作用，提示mir-206-3p对ad的诊断或许具有潜在价值。
54.实施例1的操作方法如下：
55.收集ad模型星形胶质细胞分泌的外泌体，采用trizol法提取总rna,通过在3’和5’端相继接头，反转录生成cdna，生成的cdna再经过体外聚合酶链扩增反应(pcr)扩增。接着割胶回收目的片段，待质检合格后，开始测序。比对测序后的文库信息与已知数据库以确定样本中mirna的种类及水平，最后，对鉴定出来的mirnas进一步进行表达聚类分析，并对mirnas靶基因进行功能注释和kegg信号通路富集分析。
56.实施例2外泌体中mir-206-3p的差异验证
57.采用实时荧光定量pcr方法对外泌体中差异的mirnas进行验证，结果如图2所示，在ad模型细胞星形胶质细胞分泌的外泌体中mir-206-3p显著高于对照组(n＝5，p《
0.0001)，且水平最高。
58.实施例2的操作方法如下：
59.(1)饥饿处理纯度为98％以上的星形胶质细胞24小时，接着加入含有4 微摩尔的寡聚aβ
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处理72小时，设置正常对照组；
60.(2)收集处理细胞72小时后的培养基，在4℃离心机中经过500
×
g离心15分钟,2000
×
g离心15分钟，10,000
×
g离心30分钟，接着过0.22微米的滤膜以取出细胞碎片；
61.(3)经过30kd的截流柱，在4℃离心机中用6,000rpm离心50分钟，以浓缩收集的上清；
62.(4)浓缩上清与外泌体提取试剂按2：1比例混匀，4℃孵育过夜；
63.(5)次日，4℃离心机中以12,000rpm的速度离心1小时，弃上清，收集的沉淀即为外泌体；
64.(6)加入800微升trizol于收集的外泌体中，剧烈振荡裂解5分钟；
65.(7)加入200微升氯仿，振荡后静置5分钟；
66.(8)4℃，1,2000rpm离心15分钟，转移上清至干净的ep管中；
67.(9)加入等体积的异丙醇，轻柔混匀后静置10分钟；
68.(10)1,2000rpm,离心10分钟，收集沉淀；
69.(11)加入70％乙醇溶液，洗涤2次，室温晾干，加入20微升无rna酶的水溶解；
70.(12)定量测得提取的rna浓度，然后以2000微克的rna逆转录生成 cdna；
71.(13)以稀释5倍的cdna作为模板，经过95℃，变性10秒；60℃，退火20秒；72℃，延伸10秒,扩增循环40次，收集荧光信号，分析mir-206-3p 的水平。
72.实施例3 mir-206-3p在体外病理条件下星形胶质细胞中高表达
73.饥饿处理星形胶质细胞24小时,接着使用终浓度为4微摩尔寡聚aβ
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处理星形胶质细胞72小时。寡聚aβ
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是由aβ
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单体聚合成的一类小分子，它对细胞的毒害作用最强。加入寡聚aβ
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处理后收集细胞，使用qpcr的方法检测星形胶质细胞中mir-206-3p的表达水平(图3)。图3表明，寡聚aβ
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显著上调了星形胶质细胞中mir-206-3p的表达水平(n＝4，p《0.05)。
74.实施例3的操作方法如下：
75.(1)收集纯度为98％以上的星形胶质细胞，以分别接种到2个细胞培养瓶中，细胞培养瓶的编号分别为
①
、
②
，37℃培养36小时，使细胞恢复正常状态；
76.(2)用pbs润洗细胞2次，加入无血清的dmem-f12培养基，培养24小时；
77.(3)加入终浓度为4微摩尔的寡聚aβ
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于
②
号瓶，
①
号瓶用加入等体积的溶剂作对照，培养72小时；
78.(4)消化下
①
、
②
号瓶中的细胞，收集于2个干净的ep管中；
79.(5)后续的实验操作同实施例2第(6)—(12)步。
80.实施例4 mir-206-3p在9月龄app/ps1小鼠皮质和海马中高表达
81.体外检测发现寡聚aβ
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处理72小时后，细胞中mir-206-3p的水平显著上调。鉴于app/ps1小鼠的主要病理特征出现在7个月后，且随着年龄增加而加重，因此，本发明中选择9月龄小鼠进行检测，此时脑内已经出现寡聚aβ
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的沉积，由此推测在体内ad模型上mir-206-3p的水平也会与细胞模型中的结果类似。为了证实推测，本发明处死9月龄的app/ps1
小鼠及野生型对照小鼠，取出小鼠海马及前额叶皮质部位，然后经过qpcr检测海马及前额叶皮质中mir-206-3p的水平(图5)。结果显示，在9月龄的app/ps1小鼠海马及前额叶皮质中mir-206-3p高于正常对照组小鼠(n＝4，p《0.05)，说明mir-206-3p与ad存在关联性。
82.实施例4的操作方法如下：
83.取app/ps1小鼠及野生型小鼠的前额叶皮质和海马，加入trizol试剂于组织块中，研磨充分，后续步骤同实施例2中第(7)—(12)步。
84.实施例5原位杂交检测app/ps1小鼠脑内mir-206-3p的表达水平
85.本实施例中原位杂交实验结果的分析及判定：在低倍镜下观察不同动物的同一区域，使用相同的激发光曝光参数进行拍摄，然后根据荧光信号的强弱来分析mir-206-3p的表达水平，判读的结果可根据如下描述确定：观察对应区域，若荧光越亮，荧光铺展的面积越大，则说明mir-206-3p的表达水平越高。如图6所示，在app/ps1小鼠脑中mir-206-3p显著高于野生型小鼠(n＝4，p《0.05)。
86.实施例5的操作方法如下：
87.(1)取出切片，用4％的多聚甲醛室温固定15分钟，pbs漂洗5分钟；
88.(2)用0.2mol/l盐酸处理12分钟；
89.(3)甩干盐酸后，使用含0.5％曲拉通的溶液处理组织12分钟；
90.(4)吸走含0.5％曲拉通的溶液，用pbs(depc水配置)润洗5分钟；
91.(5)在片子上滴加20微克/毫升的蛋白酶k，室温静置12分钟，接着用pbs(depc水配置)洗5分钟；
92.(6)3％h2o2室温孵育切片15分钟，接着用0.1％的depc水洗切片5分钟；
93.(7)甩尽残留的depc水后，滴加多聚甲醛于组织上，固定10分钟；
94.(8)吸走多聚甲醛，将切片放入pbs溶液中浸泡5分钟；
95.(9)预杂交：40微升的mirnahybridizationbuffer覆盖组织，并盖上用depc水处理后的盖玻片，恒温箱中55℃孵育1.5小时；
96.(10)探针准备：预杂交结束前10分钟，将标记有地高辛的mir-206-3p探针：mirnahybridizationbuffer＝1:100配置并混匀，85℃变性3分钟，37℃平衡5分钟；
97.(11)杂交：滴加探针稀释液，轻轻地放入湿盒，最后合上盖子移入41℃恒温箱中孵育48小时；
98.(12)杂交完成后，用洗涤液(10
×
washingbuffer：depc水＝1：9)洗3次，每次5分钟；
99.(13)甩干洗涤液，滴加blockingbuffer，37℃孵育1小时；
100.(14)甩掉blockingbuffer，滴加抗地高辛的hrp(anti-digoxinhrpconjugate：blockingbuffer＝1：100)，37℃孵育1小时；
101.(15)pbs(depc水配)洗3次，每次5分钟；
102.(16)滴加含有tsa-488:tsaamplificationbuffer:0.15％h2o2＝1:100:1；37℃避光孵育15分钟；
103.(17)避光条件下，用pbs(depc水配)洗3次，每次5分钟；
104.(18)甩干pbs，滴加dapi-antifadesolution并盖上盖玻片，室温放置20分钟，避光保存；
105.(19)拍照。
106.实施例6 mir-206-3p与bdnf的结合情况
107.使用在线预测软件—miranda及targetscan发现mir-206-3p与bdnf具有结合位点，如图7a所示，这表明mir-206-3p可能潜在调控bdnf。为此，本发明选择了mir-206-3p与3
’‑
utr-bdnf有可能结合的一段序列进行pcr扩增，同时定点突变结合位点的序列作为对照。接着，将获得的片段插入到用于检测双荧光素酶活性的载体上，即获得构建好的野生型重组载体 (wt-3’utr-bdnf-psicheck2)和突变型的重组载体 (mut-3’utr-bdnf-psicheck2)，测序结果表明构建的载体无误(图7b)。如图7c所示，将构建好的野生型载体和突变型载体与mir-206-3p模拟物共转染至 hek293细胞，培养48h后，使用双荧光素酶检测试剂盒检测细胞中荧光素酶活性，并以萤火虫荧光素酶活性校准，计算海肾荧光素酶的相对活性。图7结果表明，mir-206-3p模拟物与wt-3’utr-bdnf-psicheck2共转后，显著降低荧光素酶活性(n＝3,p《0.05)，与mut-3’utr-bdnf-psicheck2共转后，细胞内的荧光素酶的相对活性不受mir-206-3p模拟物的抑制，这表明mir-206-3p可以与 bdnf的3’utr区的位点结合。而bdnf作为ad的病理指标，在血浆中的含量低，难以检测，但是mir-206-3p与bdnf存在负相关性，这提示mir-206-3p 作为一种基因水平的标记物具有潜在的可行性。
108.实施例6的操作方法如下：
109.(1)targetscan/mirdb/microrna软件预测出mir-206-3p的种子区与靶基因bdnf结合的3
’‑
utr序列；
110.(2)设计含有突变位点的序列，并由上海生工合成这一段突变序列(端含有xholi、noti酶切位点)；
111.(3)富集目的片段，切胶回收；
112.(4)使用xholi、noti限制性内切酶对psicheck-2载体进行酶切，接着对产物进行切胶回收；
113.(5)连接目的基因片段和酶切载体psicheck-2后的序列，转化，挑取单克隆菌落，抽提质粒并测序。
114.(6)复苏hek293t细胞，传代一次后按每孔4000个细胞接种在96孔白板上；
115.(7)将2.25微升的lipofectamine 3000转染试剂加入500微升的opti-mem培养基中，混合均匀，静置5分钟；
116.(8)将2微升浓度为20微摩尔的mir-206-3p mimic/mir-206-3p inhibitor (终浓度是40nm)加入到250微升的opti-mem中，混匀并静置5分钟；
117.(9)将(0.9微克)载体(psicheck-2、psicheck-2-bdnf-wt-3
’‑
utr、 psicheck-2-bdnf mut-3
’‑
utr)加入到250μlopti-mem中，混匀并静置5分钟；
118.(10)把载体和mir-206-3p mimic/mir-206-3p inhibitor混合液加入到转染试剂混合液里，混匀，静置20分钟。细胞密度为60％时，pbs洗细胞3次，将试剂加入到细胞中，37℃培养箱培养6小时，而后换回完全培养基，继续培养 48小时；
119.(11)弃培养基，pbs洗2次，加入dual-glo luciferase reagent裂解，随后转移到检测板检测萤火虫荧光素酶发光信号，加入dual-glo stop&gloreagent，检测海肾萤光素酶发光信号。
120.实施例7 mir-206-3p在app/ps1小鼠血浆中高表达
206-3p是ad的特异标记物。为此，本发明收集了焦虑、抑郁、精神分裂、帕金森、精神障碍症状的受试者血浆，并采用qpcr方法对血浆中mir-206-3p 的水平进行检测。虽然精神分裂症、精神障碍等多见于年轻群体，但考虑到ad 发病年龄普遍在55岁以后，因此，本发明选择收集年龄在55岁的焦虑、抑郁、精神分裂、精神障碍受试者进行对比(图9h)。结果表明，mir-206-3p在ad中的水平显著高于正常受试者(图9g)，且mir-206-3p在ad和mci受试者血浆中的水平显著高于焦虑、抑郁、帕金森、精神分裂和精神障碍受试者血浆中 mir-206-3p的水平(正常n＝7、阿尔茨海默病n＝6、轻度认知障碍n＝4、焦虑n＝12、抑郁n＝6、帕金森n＝4、精神分裂n＝6和精神障碍n＝5，*p《0.05，**p《0.01， ***p《0.001)。根据以上结果，本发明设置焦虑、抑郁、帕金森、精神分裂和精神障碍受试者血浆中mir-206-3p最高的为基准(基线,b线)，以轻度认知障碍的为a线，以ad的为c线。对于55岁以上的受检测者，若mir-206-3p水平接近年龄对应的健康组4.23倍时，被视为尽可能发展为mci；若高出正常健康组 4.23倍且低于5.7倍时，则被判为mci发展为ad阶段。由于mir-206-3p的丰度与ad的发展相关，因此可以通过检测mir-206-3p的丰度来检测药物是否对 ad有治疗作用。
140.实施例9的操作方法如下：
141.(1)对比55岁以上的受试者血浆中mir-206-3p水平(除精神障碍年龄小 4岁)；
142.(2)对比各组受试者年龄的差异；
143.(3)设置ad与mci的阈值，根据其他类精神疾病的变化，选出最高的 mir-206-3p水平作为下线。
144.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。