大叶蛋白菊花青素的提取方法及其应用与流程

1.本发明涉及植物花青素提取技术领域。更具体地说，本发明涉及一种大叶蛋白菊花青素的提取方法及其应用。


背景技术：

2.大叶蛋白菊，菊科，原产于美洲，既是一种观赏性的菊花，也是一种富含蛋白质等营养物质的新奇蔬菜。大叶蛋白菊具有吸收紫外线、抗辐射、消炎镇痛、抗氧化、抗菌以及清除自由基、抗衰老等功效，是很有价值的天然原料，也可应用于制备口腔护理、皮肤保养、化工等产品。另外，大叶蛋白菊具有适用性强、优良高产、改良土壤的特点，适于大面积种植和推广。
3.花青素是自然界中一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于类黄酮化合物，也是植物花瓣中的主要呈色物质。花青素是一种强有力的抗氧化剂，能清除人体内过剩的自由基，还具有抗突变、抗肿瘤、增强血管弹性、改善循环系统、抑制炎症和过敏等功能。
4.目前，花青素多以紫甘薯、越橘、蓝莓等为原料进行提取，大叶蛋白菊中含有花青素，但以大叶蛋白菊为原料提取花青素的研究尚未见报道；而且，常规的花青素提取方法存在提取得率低、提取效率低、有机溶剂残留或环境污染的问题，也会限制大叶蛋白菊花青素的应用，不利于推动大叶蛋白菊的开发和利用。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
6.本发明还有一个目的是提供一种大叶蛋白菊花青素的提取方法，能够显著提高大叶蛋白菊花青素的提取得率，且提取过程中使用的药品绿色环保，有利于促进大叶蛋白菊花青素的应用，所得大叶蛋白菊花青素可用于制备保健品、药物或饲料添加剂，进而有利于推动大叶蛋白菊的开发和利用。
7.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种大叶蛋白菊花青素的提取方法，包括以下步骤：
8.步骤1、将大叶蛋白菊花粉碎，得到大叶蛋白菊粉末；
9.步骤2、将乳酸、甘油和氯化胆碱按摩尔比为1:1～3:1～2混合，并于70～100℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂；
10.步骤3、向天然低共熔溶剂中加入蒸馏水，分别配制成含水量为40％的第一溶剂、含水量为30％的第二溶剂和含水量为20％的第三溶剂；
11.步骤4、将大叶蛋白菊粉末与第一溶剂混合，并置于微波功率为500w，温度为40℃的条件下提取10min，再过滤，得第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣与第二溶剂混合，并置于微波功率为600w，温度为45℃的条件下提取5min，再过滤，得第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣与第三溶剂混合，并置于微波功率为700w，温度为50℃的条件下提取3min，再过滤，得第三滤液和第三滤渣；其中，第一溶剂与大叶蛋白菊粉末的体积质量比为20ml:1g，第二溶
剂与大叶蛋白菊粉末的体积质量比为15ml:1g，第三溶剂与大叶蛋白菊粉末的体积质量比为10ml:1g；
12.步骤5、将第一滤液、第二滤液与第三滤液合并得提取液，将提取液离心分离，收集上清液，再经过大孔树脂吸附，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得大叶蛋白菊花青素。
13.优选的是，步骤4之前，将大叶蛋白菊粉末与溶出液混合，并于40℃下浸泡30min，再过滤，得第四滤液和第四滤渣，步骤4中第一溶剂与第四滤渣混合，步骤5中第四滤液与第一滤液、第二滤液、第三滤液合并得提取液；其中，溶出液为纤维素酶和果胶酶的混合水溶液，纤维素酶的浓度为0.2mg/ml，果胶酶的浓度为0.4mg/ml，溶出液与大叶蛋白菊粉末的体积质量比为10ml:1g。
14.优选的是，大叶蛋白菊粉末与溶出液混合后，先置于电场强度为3kv/cm的条件下处理120μs，再于40℃下浸泡30min。
15.优选的是，步骤1中，将大叶蛋白菊花置于45℃的烘箱内烘干，粉碎后过30目筛，得大叶蛋白菊粉末。
16.优选的是，步骤2中，将乳酸、甘油和氯化胆碱按摩尔比为1:2:1.5混合，并于90℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂。
17.优选的是，步骤5中，离心分离的温度为4℃，转速为9000r/min，时间为15min。
18.优选的是，步骤5中，大孔树脂的型号为ab-8，吸附流速为2.5bv/h；洗脱液为70％的乙醇水溶液，洗脱流速为2bv/h，洗脱液与大孔树脂的体积质量比为6ml:1g。
19.优选的是，权利要求1～7任一项所述的大叶蛋白菊花青素的提取方法得到的大叶蛋白菊花青素在制备保健品、药物或饲料添加剂中的应用。。
20.本发明至少包括以下有益效果：
21.一、本发明以乳酸、甘油和氯化胆碱为原料制备天然低共熔溶剂，并以三种不同含水量的天然低共熔溶剂作为溶剂，与不同的料液比、微波功率、温度以及提取时间进行组合，按照顺序对大叶蛋白菊粉末中的花青素分三次进行提取，能够显著提高大叶蛋白菊花青素的提取得率，且提取过程中使用的药品绿色环保，有利于促进大叶蛋白菊花青素的应用，进而有利于推动大叶蛋白菊的开发和利用；
22.二、本发明在采用天然低共熔溶剂提取大叶蛋白菊粉末中的花青素之前，通过纤维素酶和果胶酶的混合水溶液浸泡，能够有效溶解大叶蛋白菊的细胞壁，有助于大叶蛋白菊中花青素的溶出，再以经浸泡处理后的滤渣作为天然共熔溶剂提取花青素的原料，能够进一步提高大叶蛋白菊花青素的提取得率；
23.三、本发明在大叶蛋白菊粉末与纤维素酶和果胶酶的混合水溶液混合后采用高压脉冲电场进行处理，能够有利于提高纤维素酶和果胶酶溶解大叶蛋白菊细胞壁的效果，进而有利于进一步提高大叶蛋白菊花青素的提取得率。
24.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
25.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所
述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
26.《实施例1》
27.一种大叶蛋白菊花青素的提取方法，包括以下步骤：
28.步骤1、将大叶蛋白菊花置于45℃的烘箱内烘干，粉碎后过30目筛，得大叶蛋白菊粉末；
29.步骤2、将乳酸、甘油和氯化胆碱按摩尔比为1:1:1混合，并于70℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂；
30.步骤3、向天然低共熔溶剂中加入蒸馏水，分别配制成含水量为40％的第一溶剂、含水量为30％的第二溶剂和含水量为20％的第三溶剂；
31.步骤4、将5g大叶蛋白菊粉末与100ml第一溶剂混合，并置于微波功率为500w，温度为40℃的条件下提取10min，再过滤，得第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣与75ml第二溶剂混合，并置于微波功率为600w，温度为45℃的条件下提取5min，再过滤，得第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣与50ml第三溶剂混合，并置于微波功率为700w，温度为50℃的条件下提取3min，再过滤，得第三滤液和第三滤渣；
32.步骤5、将第一滤液、第二滤液与第三滤液合并得提取液，将提取液离心分离，收集上清液，再经过大孔树脂吸附，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得大叶蛋白菊花青素；其中，离心分离的温度为4℃，转速为9000r/min，时间为15min；大孔树脂的型号为ab-8，吸附流速为2.5bv/h；洗脱液为70％的乙醇水溶液，洗脱流速为2bv/h，洗脱液与大孔树脂的体积质量比为6ml:1g。
33.《实施例2》
34.一种大叶蛋白菊花青素的提取方法，包括以下步骤：
35.步骤1、将大叶蛋白菊花置于45℃的烘箱内烘干，粉碎后过30目筛，得大叶蛋白菊粉末；
36.步骤2、将乳酸、甘油和氯化胆碱按摩尔比为1:2:1.5混合，并于90℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂；
37.步骤3、向天然低共熔溶剂中加入蒸馏水，分别配制成含水量为40％的第一溶剂、含水量为30％的第二溶剂和含水量为20％的第三溶剂；
38.步骤4、将5g大叶蛋白菊粉末与100ml第一溶剂混合，并置于微波功率为500w，温度为40℃的条件下提取10min，再过滤，得第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣与75ml第二溶剂混合，并置于微波功率为600w，温度为45℃的条件下提取5min，再过滤，得第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣与50ml第三溶剂混合，并置于微波功率为700w，温度为50℃的条件下提取3min，再过滤，得第三滤液和第三滤渣；
39.步骤5、将第一滤液、第二滤液与第三滤液合并得提取液，将提取液离心分离，收集上清液，再经过大孔树脂吸附，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得大叶蛋白菊花青素；其中，离心分离的温度为4℃，转速为9000r/min，时间为15min；大孔树脂的型号为ab-8，吸附流速为2.5bv/h；洗脱液为70％的乙醇水溶液，洗脱流速为2bv/h，洗脱液与大孔树脂的体积质量比为6ml:1g。
40.《实施例3》
41.一种大叶蛋白菊花青素的提取方法，包括以下步骤：
42.步骤1、将大叶蛋白菊花置于45℃的烘箱内烘干，粉碎后过30目筛，得大叶蛋白菊粉末；
43.步骤2、将乳酸、甘油和氯化胆碱按摩尔比为1:3:2混合，并于100℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂；
44.步骤3、向天然低共熔溶剂中加入蒸馏水，分别配制成含水量为40％的第一溶剂、含水量为30％的第二溶剂和含水量为20％的第三溶剂；
45.步骤4、将5g大叶蛋白菊粉末与100ml第一溶剂混合，并置于微波功率为500w，温度为40℃的条件下提取10min，再过滤，得第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣与75ml第二溶剂混合，并置于微波功率为600w，温度为45℃的条件下提取5min，再过滤，得第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣与50ml第三溶剂混合，并置于微波功率为700w，温度为50℃的条件下提取3min，再过滤，得第三滤液和第三滤渣；步骤5、将第一滤液、第二滤液与第三滤液合并得提取液，将提取液离心分离，收集上清液，再经过大孔树脂吸附，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得大叶蛋白菊花青素；其中，离心分离的温度为4℃，转速为9000r/min，时间为15min；大孔树脂的型号为ab-8，吸附流速为2.5bv/h；洗脱液为70％的乙醇水溶液，洗脱流速为2bv/h，洗脱液与大孔树脂的体积质量比为6ml:1g。
46.《实施例4》
47.与《实施例2》的不同在于，步骤4之前，将5g大叶蛋白菊粉末与50ml溶出液混合，并于40℃下浸泡30min，再过滤，得第四滤液和第四滤渣，步骤4中第一溶剂与第四滤渣混合，步骤5中第四滤液与第一滤液、第二滤液、第三滤液合并得提取液；其中，溶出液为纤维素酶和果胶酶的混合水溶液，纤维素酶的浓度为0.2mg/ml，果胶酶的浓度为0.4mg/ml；其他步骤及参数与实施例2相同。
48.《实施例5》
49.与《实施例4》的不同在于，5g大叶蛋白菊粉末与50ml溶出液混合后，先置于电场强度为3kv/cm的条件下处理120μs，再于40℃下浸泡30min；其他步骤及参数与实施例4相同。
50.《对比例1》
51.与《实施例2》的不同在于，步骤2，将乳酸和氯化胆碱按摩尔比为1:1.5混合，并于90℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂；其他步骤及参数与实施例4相同。
52.《对比例2》
53.与《实施例2》的不同在于，步骤2，将甘油和氯化胆碱按摩尔比为1:1.5混合，并于90℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂；其他步骤及参数与实施例4相同。
54.《对比例3》
55.与《实施例2》的不同在于，步骤2，将乳酸、乙二醇和氯化胆碱按摩尔比为1:2:1.5混合，并于90℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂；其他步骤及参数与实施例4相同。
56.《对比例4》
57.与《实施例2》的不同在于，步骤2，将柠檬酸、甘油和氯化胆碱按摩尔比为1:2:1.5混合，并于90℃下恒温搅拌至形成透明液体，得天然低共熔溶剂；其他步骤及参数与实施例4相同。
58.《对比例5》
59.与《实施例2》的不同在于，
60.步骤4、将5g大叶蛋白菊粉末与100第一溶剂混合，并置于微波功率为500w，温度为40℃的条件下提取18min，再过滤，得第一滤液和第一滤渣；
61.步骤5、将第一滤液离心分离，收集上清液，再经过大孔树脂吸附，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得大叶蛋白菊花青素；其中，离心分离的温度为4℃，转速为9000r/min，时间为15min；大孔树脂的型号为ab-8，吸附流速为2.5bv/h；洗脱液为70％的乙醇水溶液，洗脱流速为2bv/h，洗脱液与大孔树脂的体积质量比为6ml:1g；
62.其他步骤及参数与实施例2相同。
63.《对比例6》
64.与《实施例2》的不同在于，步骤4、将5g大叶蛋白菊粉末与100ml第一溶剂混合，并置于微波功率为500w，温度为40℃的条件下提取10min，再过滤，得第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣与50ml第三溶剂混合，并置于微波功率为700w，温度为50℃的条件下提取3min，再过滤，得第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣与75ml第二溶剂混合，并置于微波功率为600w，温度为45℃的条件下提取5min，再过滤，得第三滤液和第三滤渣；其他步骤及参数与实施例2相同。
65.《对比例7》
66.与《实施例2》的不同在于，步骤4、将5g大叶蛋白菊粉末与75ml第二溶剂混合，并置于微波功率为600w，温度为45℃的条件下提取5min，再过滤，得第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣与100ml第一溶剂混合，并置于微波功率为500w，温度为40℃的条件下提取10min，再过滤，得第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣与50ml第三溶剂混合，并置于微波功率为700w，温度为50℃的条件下提取3min，再过滤，得第三滤液和第三滤渣；其他步骤及参数与实施例2相同。
67.《对比例8》
68.与《实施例2》的不同在于，步骤4、将5g大叶蛋白菊粉末与75ml第二溶剂混合，并置于微波功率为600w，温度为45℃的条件下提取5min，再过滤，得第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣与50ml第三溶剂混合，并置于微波功率为700w，温度为50℃的条件下提取3min，再过滤，得第二滤液和第二滤渣；将第二滤渣与100ml第一溶剂混合，并置于微波功率为500w，温度为40℃的条件下提取10min，再过滤，得第三滤液和第三滤渣；其他步骤及参数与实施例2相同。
69.《对比例9》
70.采用恒温水浴法提取大叶蛋白菊花青素，包括以下步骤：
71.步骤1、将大叶蛋白菊花置于45℃的烘箱内烘干，粉碎后过30目筛，得大叶蛋白菊粉末；
72.步骤2、将5g大叶蛋白菊粉末与40ml ph为5.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液混合，并于40℃下浸提6h，再以1000r/min的转速离心15min，收集上清液，得提取液；
73.步骤3、提取液经过大孔树脂吸附，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得大叶蛋白菊花青素；其中，大孔树脂的型号为ab-8，吸附流速为2.5bv/h；洗脱液为70％的乙醇水溶液，洗脱流速为2bv/h，洗脱液与大孔树脂的体积质量比为6ml:1g。
74.《对比例10》
75.采用有机溶剂法提取大叶蛋白菊花青素，包括以下步骤：
76.步骤1、将大叶蛋白菊花置于45℃的烘箱内烘干，粉碎后过30目筛，得大叶蛋白菊粉末；
77.步骤2、将5g大叶蛋白菊粉末与40ml体积浓度为70％的经盐酸酸化的乙醇溶液混合，并于40℃下浸提3h，过滤得第一浸提液，再将过滤后的剩余物与40ml体积浓度为70％的经盐酸酸化的乙醇溶液混合，并于40℃下浸提3h，过滤得第二浸提液；其中，经盐酸酸化的乙醇溶液的ph为5.8；
78.步骤3、将第一浸提液与第二浸提液合并得提取液，将提取液离心分离，收集上清液，再经过大孔树脂吸附，再用洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得大叶蛋白菊花青素；其中，离心分离的温度为4℃，转速为9000r/min，时间为15min；大孔树脂的型号为ab-8，吸附流速为2.5bv/h；洗脱液为70％的乙醇水溶液，洗脱流速为2bv/h，洗脱液与大孔树脂的体积质量比为6ml:1g。
79.将实施例1～5和对比例1～10得到的大叶蛋白菊花青素分别配制成适当浓度的样品溶液，并采用ph示差法测定出样品溶液中花青素的含量，再计算大叶蛋白菊花青素提取得率，其中，大叶蛋白菊花青素提取得率(mg/g)＝样品溶液中花青素的质量/大叶蛋白菊粉末的质量，实施例1～5和对比例1～10的大叶蛋白菊花青素提取得率的结果见表1：
80.表1不同提取方法的大叶蛋白菊花青素提取得率
81.组别提取得率(mg/g)实施例12.951实施例23.102实施例33.039实施例43.412实施例53.594对比例11.891对比例21.736对比例32.112对比例42.253对比例52.432对比例62.611对比例72.509对比例82.448对比例91.241对比例101.524
82.由表1可知，实施例1～3的大叶蛋白菊花青素提取得率均较高，位于2.951～3.102mg/g之间，显著高于对比例9和对比例10的大叶蛋白菊花青素提取得率；本发明能够显著提高大叶蛋白菊花青素的提取得率，且提取过程中使用的药品绿色环保，有利于促进大叶蛋白菊花青素的应用，进而有利于推动大叶蛋白菊的开发和利用；相较于对比例1～4，实施例2的大叶蛋白菊花青素提取得率显著提高，由此可见，以乳酸、甘油和氯化胆碱为原料的天然低共熔溶剂提取大叶蛋白菊花青素的效果更好；相较于对比例5～8，实施例2的大
叶蛋白菊花青素提取得率显著提高，由此可见，按照本发明中步骤4的提取顺序和条件进行三次提取，大叶蛋白菊花青素的提取效果更好；因此，本发明以乳酸、甘油和氯化胆碱为原料制备天然低共熔溶剂，并以三种不同含水量的天然低共熔溶剂作为溶剂，与不同的料液比、微波功率、温度以及提取时间进行组合，按照顺序对大叶蛋白菊粉末中的花青素分三次进行提取，能够显著提高大叶蛋白菊花青素的提取得率，且提取过程中使用的药品绿色环保，有利于促进大叶蛋白菊花青素的应用，进而有利于推动大叶蛋白菊的开发和利用；
83.相较于实施例2，实施例4的大叶蛋白菊花青素提取得率显著提高，由此可见，在采用天然低共熔溶剂提取大叶蛋白菊粉末中的花青素之前，通过纤维素酶和果胶酶的混合水溶液浸泡，能够有效溶解大叶蛋白菊的细胞壁，有助于大叶蛋白菊中花青素的溶出，再以经浸泡处理后的滤渣作为天然共熔溶剂提取花青素的原料，能够进一步提高大叶蛋白菊花青素的提取得率；另外，回收浸泡处理后的滤液中的花青素也有利于提高大叶蛋白菊花青素的提取得率；
84.相较于实施例4，实施例5的大叶蛋白菊花青素提取得率明显提高，由此可见，在大叶蛋白菊粉末与纤维素酶和果胶酶的混合水溶液混合后采用高压脉冲电场进行处理，能够有利于提高纤维素酶和果胶酶溶解大叶蛋白菊细胞壁的效果，进而有利于进一步提高大叶蛋白菊花青素的提取得率。
85.《饲喂试验》
86.选用相同品种、周龄相同且处于产蛋期的健康蛋鸡180只，分为6个组，每个组10个重复，每个重复3只鸡，并对每只试验蛋鸡进行编号，6个组分别为试验组1、试验组2、试验组3、试验组4、试验组5和对照组，试验组1以日常饲料+0.02％实施例2提取的大叶蛋白菊花青素作为日粮，试验组2以日常饲料+0.02％实施例4提取的大叶蛋白菊花青素作为日粮，试验组3以日常饲料+0.02％实施例5提取的大叶蛋白菊花青素作为日粮，试验组4以日常饲料+0.02％对比例9提取的大叶蛋白菊花青素作为日粮，试验组5以日常饲料+0.02％对比例10提取的大叶蛋白菊花青素作为日粮，对照组以日常饲料作为日粮，均按照正常时间喂食和管理，日常饲料为淘宝上购买的鸡饲料，鸡饲料名称为正大524蛋鸡饲料，饲料的公司名称为石家庄正大饲料有限公司，；
87.饲喂4周后连续1周收集试验蛋鸡所产鸡蛋，每只鸡收集5枚鸡蛋，并标注蛋鸡编号和收集日期，常温储存，分别在产蛋当天、储存5天、10天、15天、20天和25天以重复为单位测定每枚鸡蛋的哈式单位，哈式单位采用多功能蛋品质检测仪测定，不同组在不同储存时间下鸡蛋的哈式单位的结果见表2：
88.表2不同组在不同储存时间下鸡蛋的哈式单位
[0089][0090]
由表2可知，在储存过程中，鸡蛋的哈式指数都有降低，相较于对照组，试验组1～5的鸡蛋的哈式指数明显下降得更慢，由此可见，将大叶蛋白菊花青素作为鸡饲料添加剂加入日常饲料中，能够有效减慢鸡蛋的哈式指数的降低，有利于延长新鲜鸡蛋的保质期，相较于试验组4～5，试验组1～3的鸡蛋的哈式指数下降得更慢，储存25天后，试验组1～3的鸡蛋的哈式指数仍能达到63.25～65.93，由此可见，采用本发明的提取方法得到的大叶蛋白菊花青素制备鸡饲料添加剂能够有效延长新鲜鸡蛋的保质期。
[0091]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。