一种铬还原杆菌及其用于修复铬污染土壤的方法与流程

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种微生物及利用其的修复污染土壤技术，具体涉及一种铬还原杆菌及其用于修复铬污染土壤的方法。


背景技术：

2.铬渣主要产生于铬盐行业及少数金属铬企业的重铬酸钠生产过程中，尤以采用有钙焙烧生产工艺的铬盐生产企业产生的数量最多。铬化合物是无机化工的主要系列产品之一，广泛应用于化工、轻工、冶金、纺织、机械等行业。
3.铬污染通常会引起过人敏性皮炎或湿疹，吸入、刺激、腐蚀呼吸道，引起咽炎、支气管炎等多种疾病，另外，六价铬的化合物不能自然降解，会在生物和人体内长期积聚富集，也属一种重污染环境物质。微生物法治理铬渣具有解毒彻底、无二次污染、经济高效等优点，但该方法因外引入菌种及菌种对铬耐受性低的问题造成解毒效果不稳定等问题。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种铬还原杆菌，该铬还原杆菌可用于修复受铬污染的土壤土著，长效稳定固化六价铬。
5.本发明的第二个目的在于提供一种用于放大培养上述的铬还原杆菌的培养基。
6.本发明的第三个目的在于提供一种铬还原杆菌修复铬污染土壤的方法，该方法通过铬还原杆菌的直接作用、间接作用将六价铬固定并还原，最终实现铬渣污染土壤中六价铬的长效稳定固化。
7.为了实现上述目的，本发明提供一种铬还原杆菌，该铬还原杆菌的分类命名为：leucobacter chromiireducens grinml swg2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号为：cctcc no：m2021991。
8.本发明还提供一种用于放大培养上述的铬还原杆菌的培养基，该培养基配方为：胰蛋白胨8-10g、酵母提取物3-5g、氯化钠10-13g、700-900ml蒸馏水，2-3ml硝酸，加入0.1～0.3g的重铬酸钾并用蒸馏水定容至1000ml。
9.本发明又提供一种铬还原杆菌修复铬污染土壤的方法，包括如下步骤：
10.1)在上述的培养基培养中接种上述的铬还原杆菌，置于20℃～30℃的空气浴恒温振荡器培养7～10天得到铬还原杆菌的菌液；其中，培养基接种前采用0.5mol/l的hno3或naoh调节初始ph值至7.0-8.0；
11.2)将受污染的土壤置于锥形瓶中，并将步骤1)培养的铬还原杆菌的菌液接种于锥形瓶中，将锥形瓶置于温度为20℃-35℃的空气浴恒温振荡器培养10-15天后，土壤得到修复。
12.优选地，步骤1)中所述的菌种接种体积为培养基体积的8～15％，初始供接种的菌液细菌浓度为8
×
107～9.1
×
107个/ml。
13.优选地，步骤2)所述铬还原杆菌接种体积为培养基体积的10％-12％，初始供接种
的铬还原杆菌的菌液的细菌浓度为9.0
×
10
7-9.7
×
107个/ml。
14.优选地，步骤2)所述cr(vi)浓度梯度递增到100-200mg/l。
15.优选地，步骤3)所述菌液添加量为土壤与菌液的质量体积比(g:ml)为1:1-2:1。
16.培养过程中，每隔2天加入培养基以补充反应过程中培养基的自然及微生物消耗。
17.接种后，当培养基中细菌浓度为8
×
107～9.1
×
107个/ml、铬浓度为1600ml/l时，铬的去除率可达70％。
18.经过分析检测，铬与微生物代谢产物结合生成铬螯合物，在土壤中可稳定存在，迁移性及生物可利用性较弱。
19.本发明所用铬还原杆菌从cr(vi)初始浓度为200mg/l直至cr(vi)初始浓度为1600mg/l浓度进行逐级驯化；修复65天后，对1600mg/l cr(ⅵ)的去除率逐渐增加，去除率高达70％以上。
20.本发明的有益效果在于：
21.本发明提供一株铬还原杆菌及利用该铬还原杆菌修复铬污染土壤的方法，该铬还原杆菌通过直接作用(铬还原杆菌所产酶的氧化还原作用)、间接作用(铬还原杆菌所产代谢产物，有机酸，无机酸等对铬的催化、沉淀作用)及直接作用和间接作用协同，和生物吸附将六价铬固定并还原，从而解决了铬污染土壤难解毒问题，严重污染土壤地下水等一系列问题，实现铬渣污染土壤中六价铬的长效稳定固化。
附图说明
22.图1为本发明提供的铬还原杆菌的菌落照片。
23.图2a为本发明提供的铬还原杆菌修复受铬污染土壤的修复组的ph及eh变化趋势图。
24.图2b为本发明提供的铬还原杆菌修复受铬污染土壤的对照组的ph及eh变化趋势图。
25.图3为本发明提供的对照组和修复组中铬还原杆菌对cr(ⅵ)的还原率的统计图。
具体实施方式
26.下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
27.本发明所涉及的用于修复受污染土壤的铬还原杆菌，该铬还原杆菌的分类命名为：leucobacter chromiireducens grinml swg2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号为：cctcc no：m2021991。
28.实施例1铬还原杆菌的分离、培养及驯化
29.1)将10g采集自青海省原海北化工厂的铬污染场地土样添加至90ml的去离子水中，置于25℃、120rpm的摇床条件下震荡30分钟后，取出静止60分钟，收集上清液；
30.2)取1ml上述上清液加入10ml的培养基中，置于25℃、120rpm的摇床条件下培养10天；该培养基配方为：酵母提取液5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，k2cr2o7 100mg/l，ph为7；
31.3)取1ml上述培养后的菌液加入10ml无菌水中摇匀，得到10-1
梯度稀释液，按梯度
依次稀释10-2
至10-5
于分离培养基平板上均匀涂布，25℃下倒置培养10天后，挑起平板上的单菌落四线三区划线培养；该分离培养基配方为：酵母提取液5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，k2cr2o
7 100mg/l，ph为7，琼脂粉20g/l，121℃灭菌15min，倒平板，冷却制成分离培养基平板；
32.4)使用分离培养基平板进行多次转接与分离纯化，得到菌落特征一致的单一菌落，如图1所示。从图1可以看出，该菌落为黄色半透明，呈圆形，表面光滑，边缘规则，中央微凸起。
33.5)对菌落提取基因组dna，用引物27f/1492r进行pcr扩增，然后将pcr产物切胶纯化回收，用引物27f/1492r测序，将测序结果序列在ncbi上blast比对同源性。经鉴定分析，确定菌株与leucobacter chromiireducens亲源关系最近，命名为leucobacter chromiireducens grinml swg2。
34.6)将鉴定后的leucobacter chromiireducens grinml swg2接种到步骤2)的培养基中，置于25℃、120rpm的摇床培养菌液至细菌浓度为9.0
×
10
7-9.7
×
107个/ml；然后将培养的菌液按照体积比为10％-12％的比例添加到装有80-100ml的培养基的250-300ml锥形瓶中，然后利用0.2mol/l的重铬酸钾调整培养基中初始cr(vi)浓度为200-1600mg/l，锥形瓶中cr(vi)浓度以80-100mg/l梯度递增，依次对所述铬还原杆菌进行驯化，将锥形瓶置于温度为20℃～30℃的空气浴恒温振荡器培养7-10天，得到高耐受、高效铬还原杆菌的菌液。
35.将驯化后的leucobacter chromiireducens grinml swg2进行生物保藏。
36.实施例2铬污染土壤修复的微生物修复
37.以微生物法解毒处理青海地区某铬污染土壤，取cr污染土壤原样，绿植区域及岩石区域三个采样点为研究对象。cr污染土壤原样、绿植区域和岩石区域样品在1mol/l的kcl溶液中的ph值(依据土壤ph测定方法(ny-t 1377-2007))分别为10.62、8.67和7.48。不同地理位置由地下水等多因素影响，呈现不同ph。三个样品的铬含量利用icp测试，结果显示，cr污染、绿植区域和岩石区域样品中cr的含量分别为2.67％、0.19％和0.56％，含量远远超出土壤环境质量标准(iii级标准总铬含量低于300mg/kg)。
38.修复所用的培养基成分为：胰蛋白胨9g、酵母提取物4g、氯化钠10g、700ml蒸馏水，加入0.2g的重铬酸钾并用浓度为1％的硝酸调整ph为7，最后用容量瓶定容至1000ml。
39.取铬污染土壤、绿植区域及岩石区域样品，设置为修复组，培养基对照组，每组取样品200g，分别置于3000ml锥形瓶中。修复组为加入100ml培养基，接种10ml菌液，培养基对照组为只加入100ml培养基。随后试验组均置于恒温培养箱中于25℃静止培养10天，以确定微生物修复效果。
40.1)对比修复前后eh及ph变化可知，修复组eh从初始250-310mv降至-380—-250mv，明显呈现降低趋势，培养基对照组eh趋于稳定(260-320mv)；经过铬还原杆菌修复的试验组ph稳定在7.3-8.7区域，此ph和eh范围铬的稳定形态为铬螯合物。
41.2)微生物修复效果
42.如图3所示，与培养基对照组数据相比较，铬还原菌的试验组对铬污染土壤修复效果显著，经过微生物修复7-10天后，当原铬浓度为200mg/l时，cr(vi)还原固定率均达到99.2％以上；铬浓度为1600mg/l时，铬的还原去除率达到70％以上，沉淀后产物经检测为铬螯合物。
43.从上述实施例可以看出，本发明提供的铬还原杆菌及该铬还原杆菌修复铬污染土壤的方法，可以将铬污染土壤中的六价铬固定并还原，从而防止铬返溶，实现铬渣污染土壤中六价铬的长效稳定固化。
44.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。