一种高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽及其在制备改善记忆的药物、食品或保健品中的应用。


背景技术：

2.氧化应激(oxidative stress)是机体内过量自由基堆积引起的氧化—抗氧化系统失衡导致的应激损伤状态，被认为是衰老和疾病的重要因素。细胞线粒体进行氧化还原反应和能量代谢过程中产生的活性氧(reactive oxygen species，ros)是造成细胞氧化应激的重要原因之一。脑组织作为机体氧化代谢最活跃的器官更容易受到ros的攻击。大量的ros造成细胞内氧化-抗氧化系统失衡，诱发神经炎症和细胞凋亡，破坏线粒体功能，引起突触可塑性功能障碍、破坏血脑屏障完整性、神经元中毒性水肿、dna氧化损伤和蛋白质表达异常等，进而导致神经元损伤，学习记忆能力减退，严重者逐步发展为痴呆。研究证实，神经细胞保护因子通过提高抗氧化酶活性清除过量ros显著提高模型动物学习与记忆水平。因此，靶向维持机体氧化防御平衡，可作为神经保护和改善学习记忆减退的有效策略。目前认为食物摄取是获得外源抗氧化剂的重要来源，其中，食源性抗氧化肽因其具有来源广泛、安全有效、投入少、易生产等特点，受到越来越多研究学者的关注。
3.近年来随着我国老龄化人口数量递增、中青年人生活节奏加快以及各种精神压力的增大，加剧了氧化应激的发生和发展，阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、卒中、脑肿瘤等中枢神经系统(central nervous system，cns)疾病已经成为威胁人类生命的第二大类疾病。血脑屏障是哺乳动物中枢神经系统特有的防御机制，通过限制化合物进入中枢神经以维持神经系统内环境的相对稳定，但同时也阻碍了许多神经保护因子的脑内递送。几乎所有的大分子物质和98％小分子在这种严格限制下难以进入中枢神经系统，成为中枢神经功能因子开发亟需解决的难点问题。因此，亟需开发和使用天然来源具有抗氧化活性且可通过血脑屏障神经系统保护功能因子。
4.近年来，生物活性肽作为功能营养因子在慢性疾病中发挥的膳食干预作用被广泛报道。抗氧化肽(antioxidant peptides)是一类由3-15个氨基酸组成的天然生物活性肽，具有分子量小、活性高、安全性高，可直接进入细胞内发挥生物活性，在机体内吸收、转化和利用中具有显著优势等优点。本发明研究表明核桃抗氧化活性肽evsgpglspn衍生肽evsgpgyspn可穿透血脑屏障，保护氧化损伤神经细胞，改善d-半乳糖诱导衰老小鼠记忆障碍，改善小鼠学习和记忆能力。此外，可穿透血脑屏障抗氧化肽可以用作食品药品配方成分在食品和医疗保健品领域发挥重要作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽及其在制备改善记忆的药物、食品或保健品中的应用，属于天然衍生肽，安全性高，具有可穿透血脑屏障、高抗氧化活性和改善记忆力功能。
6.本发明所述的一种高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽，其特征在于：其氨基酸序列为glu-val-ser-gly-pro-gly-try-ser-pro-asn(evsgpgyspn，可以直接由生物公司合成，合成的具体方法见参考文献
1.)。
7.本发明所述的一种高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽，通过abts清除率和orac实验测定衍生肽的抗氧化能力，在衍生肽水溶液浓度为100μm时，evsgpgyspn的abts清除率达到34.49％，高于gsh的10.22％；orac值达到913.95μmol te/g，与gsh的918.01μmol te/g相比无显著性差异，表明本发明所述的衍生肽有高抗氧化活性。
8.本发明所述的一种高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽，其特征在于：具有神经细胞保护作用，在浓度为100μm时，显著提高800μm h2o2诱导的ht22细胞活力(活力从58.41％提高至85.86％)。
9.本发明所述的一种高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽，可穿透体外血脑屏障模型，表观渗透系数(papp)＝1.74
×
10-6
cm/s。本发明所述的一种高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽，通过d-半乳糖诱导记忆损伤模型小鼠水迷宫试验，与模型组相比，衍生肽处理组小鼠有效区域移动时间从4.40s增加至12.43s，经过平台次数由0.73次增加至4.67次。
10.本发明相比现有技术的有益效果为：
11.本发明以核桃源高活性改善记忆力肽evsgpglspn(可由生物公司经过固相合成得到
1.)为模板，进行氨基酸替换，从而获得抗氧化活性更好、血脑屏障穿透率更高且改善记忆活性更佳的衍生肽evsgpgyspn。本发明公布的衍生肽序列不需要经过酶解及分离纯化便可获得高活性可穿透血脑屏障的改善记忆力肽。该生物活性肽的初级结构和空间构像决定其可穿透血脑屏障，直接作用于中枢神经系统起到神经保护作用。该衍生肽属于天然衍生肽，具有更高活性，更高生物利用率，高安全性的特点，可用于保护中枢神经系统，预防或延缓记忆损伤，该衍生肽可应用于制备改善记忆力和抗氧化药物、食品和保健品，对药物、保健品和食品开发具有巨大潜力，具有良好应用前景。
附图说明
12.图1为核桃抗氧化肽evsgpglspn和核桃改善记忆力衍生肽evspgpyspn的orac和abts测定结果图；(a)为orac测定结果；(b)为abts测定结果；
13.图2为衍生肽evsgpgyspn对h2o2损伤ht22细胞的保护作用图；
14.图3为衍生肽evsgpgyspn在体外血脑屏障模型的透过情况图；(a)为100μm evsgpgyspn肽hbss溶液的高效液相图；(b)为transwell小室受体池侧evsgpgyspn肽hbss溶液的高效液相图；(c)为免疫荧光显微镜观察b.end3细胞吸收evsgpgyspn的照片(图中亮的浅色为衍生肽)；
15.图4为核桃抗氧化肽evsgpglspn和衍生肽evsgpgyspn的小鼠morris水迷宫试验图；(a)为定位航行试验小鼠寻台轨迹图；(b)为有效区域移动时间柱形图；(c)为各组小鼠经过平台次数柱状图；
具体实施方式
16.以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何限定。实施
例1：本发明所述的高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽evsgpgyspn的抗氧化活性测定(见附图1)
17.1)abts自由基清除能力测定：将7mmol/l的abts水溶液和2.49mmol/l的过硫酸钾水溶液等体积混合后，避光放置12h后制得abts自由基储备液，于4℃条件下保存。使用时，加入5mmol/l的pbs稀释，使abts自由基储备液在734nm波长下吸光度为0.700
±
0.002，制成abts自由基工作液。取10μl浓度为100μm的衍生肽水溶液，同浓度的谷胱甘肽(gsh)水溶液作为对照组，分别加入到96孔板中，再加入190μl abts自由基工作液，准确反应6min后使用酶标仪于734nm波长下测定吸光值(a1)。清除率计算公式如下：
[0018][0019]
式中：a0为在abts自由基工作液中用蒸馏水代替衍生肽溶液的吸光值(不加衍生肽)；a1为在abts自由基工作液中加入衍生肽或谷胱甘肽溶液的吸光值；a2为用5mmol/l的pbs溶液代替abts自由基工作液的溶液吸光值(加衍生肽)。
[0020]
2)氧自由基吸附能力(orac)测定：在96孔黑板中，分别加入25μl75mmol/l ph7.4的磷酸盐缓冲液、25μl trolox标准液(浓度分别为12.5μm、25μm、50μm和100μm)和25μl衍生肽的磷酸盐溶液(浓度100μm，溶解于75mmol/l ph7.4的磷酸盐缓冲液)，每个样品设置三个平行孔。将96孔板放入预热30min的酶标仪中震荡5s，37℃温育10min。用多孔道移液枪向各孔加入150μl、63mmol/l荧光素钠溶液，震荡5s，37℃温育20min。用多孔道移液枪向各孔中迅速加入25μl、6mmol/l的偶氮二异丁脒盐酸盐(aaph，现用现配)，同时设置两个对照组，一组为是96孔黑板中加入自由基(+aaph)，一组为96孔黑板中不加入自由基(-aaph)(空白)，放入酶标仪中震荡5s后进行检测记录吸光度。以激发波长(485
±
20)nm、发射波长(530
±
20)nm连续测定荧光强度，整个体系保持37℃，每2min测定一次荧光强度，测定时间为达到初始荧光强度的5％为止(本实验设置60个循环)。实验所得的各微孔不同时间点的荧光强度数据与其初始时间的荧光强度相比获得相对荧光强度(初始荧光强度值设置为1)，采用近似积分法计算荧光衰退曲线下面积(auc)：
[0021]
auc＝0.5
×
[2
×
(f0+f1…
+f
n-1
+fn)-f
0-fn]
×△
t
[0022]
式中，fn第n个测定点的相对荧光强度；
△
t为相邻时间点之间的间隔时间2min。
[0023]
以trolox浓度为横坐标，auc
trolox
值为纵坐标，绘制trolox标准曲线。
[0024]
测定结果以orac值表示。待测样品的orac值以μmol te/g表示(表示每克或每毫升样品的抗氧化力代表多少毫克标准品的抗氧化力)。
[0025]
orac值＝[(auc
样品-auc
空白
)/(auc
trolox-auc
空白
)]
×ctrolox
/c
样品
。
[0026]
其中auc
样品
为衍生肽磷酸盐缓冲液的结果；auc
空白
为加25μl磷酸盐缓冲液的结果；auc
trolox
为加trolox标准液(浓度100μm)的结果；c
trolox
为trolox摩尔浓度；c
样品
是衍生肽的摩尔浓度即100μm，其中trolox标准曲线为y＝0.0914x+38.566r2＝0.9931，横坐标为trolox摩尔浓度(12.5μm、25μm、50μm和100μm)，纵坐标为auc
trolox
。
[0027]
如附图1所示，在衍生肽浓度为100μm时，evsgpgyspn的abts清除率达到34.49％，高于gsh的10.22％；orac值达到913.95μmol te/g，与gsh的918.01μmol te/g相比无显著性差异，表明本发明所述的可穿透血脑屏障改善记忆衍生肽有高抗氧化活性。
[0028]
实施例2：本发明所述的高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽
evsgpgyspn对ht22细胞保护能力测定(见附图2)
[0029]
收集对数期生长的ht22细胞，采用dmem完全培养液(含有10％胎牛血清+1％青/链霉素的dmem高糖培养液)以6
×
104个/孔密度制备细胞悬液接种于96孔板中，置于二氧化碳培养箱中37℃培养24h。向96孔板中的5孔中加入100μl dmem完全培养液，培养24h后吸出培养液加入新的100μl dmem完全培养液，2h后加入10μl、5mg/ml mtt溶液(现用现配)，4h后终止培养，作为空白组(control)。向96孔板的5孔中加入100μl dmen培养液，培养24h后加入含100μl含有800μm h2o2的dmem培养液处理2h；培养结束后，每孔再加入10μl、5mg/ml mtt溶液(现用现配)，4h后终止培养，作为模型组(model)。向96孔板5孔中加入100μl、100μm的衍生肽水溶液，培养24h后加入100μl含800μm h2o2的dmem完全培养液处理2h；培养结束后，每孔中再加入10μl、5mg/ml mtt溶液(现用现配)，4h后终止培养，作为活性肽样品组。
[0030]
培养完成后，将空白组、模型组和活性肽样品组均弃去培养液，再向每孔中加入150μl dmso溶液，立即用振荡器37℃震荡10min，使紫色结晶物质充分溶解；用酶标仪在490nm处测得每孔的吸光度值，每组取5个孔的平均值。细胞活力计算公式如下：
[0031]
细胞活力(％)＝(a1/a0)
×
100％
[0032]
式中：a0：空白组的吸光度值；a1：活性肽样品组的吸光度值或模型组的吸光度值；
[0033]
如图2所示，control组细胞活力为100％，model组细胞活力为58.41％，evsgpgyspn可将800μm h2o2诱导氧化损伤的ht22细胞活力从58.41％提高至85.86％，高于ensgpglspn组的细胞活力(83.18％)。表明本发明所述的高抗氧化可穿透血脑屏障改善记忆衍生肽具有神经保护功能。
[0034]
实施例3：本发明所述的高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽的体外血脑屏障穿透能力测定(见附图3)
[0035]
1)标准曲线建立
[0036]
配浓度梯度为100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm的evsgpgyspn水溶液，分别注入液相色谱仪，测定样品的色谱峰面积，以样品浓度为横坐标、峰面积积分值为纵坐标绘图，进行线性回归分析。
[0037]
2)色谱条件设置
[0038]
溶剂a：0.1％三氟乙酸in 100％乙腈
[0039]
溶剂b：0.1％三氟乙酸in 100％水
[0040]
timeab0.01min16％84％25min41％59％25.1min100％0％30minstopstop
[0041]
流速：1.0ml/min
[0042]
检测波长：220nm
[0043]
进样体积：10ul
[0044]
3)体外bbb模型构建
[0045]
将1
×
105个/孔小鼠星形胶质细瘤细胞(c6)接种于12孔transwell小室下方，4h后正置小室，加入1.5ml含10％胎牛血清的dmem培养液，将1
×
105个/孔小鼠脑微血管内皮细
胞(b.end3)接种于transwell小室inserts内，保持小室内外液面高度一致。每2天换培养液一次，待细胞完全融合且teer值稳定后开始试验。
[0046]
4)衍生肽在体外bbb模型透过性研究
[0047]
用hbss缓冲液清洗transwell 2遍，向ap(供体池)侧加入0.5ml肽溶液，配置相同浓度的肽溶液进行高效液相分析(浓度为100μm，溶解于hbss缓冲液，见附图3a，在4min左右出峰)；向bl(受体池)侧加入1.5ml新鲜hbss缓冲液，于37℃、5％co2条件下培养2h，收集bl侧样品用于hplc分析(见附图3b，在4min左右出峰)。每组设置三次重复实验。肽的吸收率用表观渗透系数papp(cm/s)通过以下公式计算。
[0048][0049]
式中，dc/dt为bl侧肽浓度变化速率(mm/s)(经高效液相分析bl测衍生肽，仪器会自动给出出峰的峰面积，带入1中建立的标准曲线，求得bl测衍生肽浓度/2*60*60s)，a为细胞单层膜面积(cm2)，c0为ap侧肽的初始浓度(mm)，v为bl侧体积(ml)
[0050]
5)衍生肽在b.end3中的吸收情况
[0051]
将b.end3细胞以5
×
104cfu/ml浓度接种与12孔细胞培养板中，待完全贴壁后更换为无血清dmem培养液饥饿处理12h。加入fitc-evsgpgyspn(经生物公司通过固相合成
1.)使其终浓度为100μm，作用12h后通过荧光显微镜观察衍生肽的吸收情况(见附图3c)，可见fitc-evsgpgyspn可被b.end3细胞吸收。
[0052]
衍生肽可完整穿透体外bbb模型，经计算papp系数为1.74
×
10-6
cm/s，通过荧光显微镜观察fitc荧光标记fitc-evsgpgyspn可被内皮细胞摄取，表明本发明所述的高抗氧化可穿透血脑屏障改善记忆衍生肽具有穿透血脑屏障的能力。
[0053]
实施例4：本发明所述的高抗氧化可穿透血脑屏障的改善记忆力衍生肽改善d-半乳糖诱导记忆损伤模型小鼠学习记忆能力(见附图4)
[0054]
根据血脑屏障穿透肽的氨基酸偏好，在保留原肽高抗氧化活性的基础上(甘氨酸g、丙氨酸a、缬氨酸v、亮氨酸l、异亮氨酸i、甲硫氨酸m、色氨酸w、丝氨酸s、酪氨酸k、半胱氨酸c、苯丙氨酸f、天冬酰胺n、谷氨酰胺q、苏氨酸t、天冬氨酸d、谷氨酸e、赖氨酸l、精氨酸r和组氨酸h)替换进行固相合成。
[0055]
小鼠研究经吉林农业大学伦理委员会的批准，遵循欧盟委员会发布的《实验动物护理和使用指南》。雄性c57/n6小鼠(20-25g)购自辽宁长生生物科技有限公司(中国本溪)。小鼠在稳定温度(20
±
2℃)下饲养，光照/黑暗条件下暴露12小时，自由饮食。将小鼠随机分为5组(n＝10)：(i)用生理盐水灌胃小鼠60天同时颈背部皮下注射60天(空白对照，control)；(ii)用生理盐水灌胃60天，同时颈背部皮下注射d-半乳糖60天(200gm/kg)(模型组，model)；(iii)用vc(30mg/kg)灌胃小鼠60天，同时同时颈背部皮下注射d-半乳糖60天(200gm/kg)(阳性组，positive)；(iv)用肽evsgpglspn(30mg/kg)灌胃小鼠60天，同时同时颈背部皮下注射d-半乳糖60天(200gm/kg，evsgpglspn组)；(v)用肽evsgpgyspn(30mg/kg)灌胃小鼠60天，同时颈背部皮下注射d-半乳糖60天(200gm/kg，evsgpgyspn组)。
[0056]
morris水迷宫行为学实验
[0057]
(1)定位航向实验
[0058]
向直径为1200mm的水迷宫圆池内注入20
±
2℃的温水，平台固定在迷宫东北象限
水面以下1cm处，小鼠轻放于平台对面，监测时间设置为120s，图像采集系统记录小鼠游泳轨迹。小鼠在120s内找到平台所用时间记录为潜伏期，在平台上停留10s后放入笼内，120s未找到平台的小鼠指引到平台并停留10s。通过计算机采集系统记录小鼠从入口到隐蔽平台的游动路径(见附图4a)、逃逸潜伏期(见附图4b)。与空白组(control)相比，模型组(model)小鼠逃避潜伏期长，说明模型组小鼠记忆损伤，与模型组相比，抗氧化肽evsgglspn和衍生肽evsgpgyspn组小鼠有效区域停留时间增加(从4.40s增加至12.43s)，表明小鼠记忆损伤得到改善，因此抗氧化肽evsgglspn和衍生肽evsgpgyspn组具有改善d-半乳糖诱导记忆损伤模型小鼠学习记忆能力的作用。
[0059]
(2)空间探索实验
[0060]
定位航向实验结束后，将放在水下的平台取出。将小鼠轻放于平台对面，图像采集系统记录小鼠游泳轨迹，同时并计时90s。根据数据采集系统，分析并计算小鼠90s穿越原平台次数(见附图4c)。与空白组(control)相比，模型组(model)小鼠有效区域停留时间和穿越原平台次数明显减少，说明模型组小鼠记忆损伤，与模型组相比，抗氧化肽evsgglspn和衍生肽evsgpgyspn组小鼠穿越原平台次数显著增加(由0.73次增加至4.67次)，说明抗氧化肽evsgglspn和衍生肽evsgpgyspn具有d-半乳糖诱导记忆损伤模型小鼠学习记忆能力的作用。
[0061]
参考文献
[0062]
[1]李正超，韩香：多肽合成方法研究进展[j]，武警后勤学院学报(医学版),2013,22(02):153-157。