一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂的制作方法

1.本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂。


背景技术：

2.肺癌是中国发病率及死亡率第一的恶性肿瘤。早期肺癌表现隐匿且多样化，临床特征及体征不明显，大部分肺癌患者发现时已经处于晚期。肺癌晚期的5年生存率极低，而肺癌早期(ⅰ期)的五年生存率可以高达50％以上。由此，肺癌的早期发现诊断是降低肺癌发病率和死亡率的关键环节。
3.目前临床上有多种用于肺癌的检测手段，如ct、x线胸片、脱落细胞学检查和经ct定位穿刺活检等。虽然ldct在一些地区进行的筛查研究取得了一定的研究进展，但符合ldct的高危人群筛查标准的患者少，筛查准确度不够高等。
4.外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小囊泡，广泛存在于各种体液中，如血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁和腹水等，同时也来源于体内红细胞、白细胞、巨噬细胞和上皮细胞等多种细胞。外泌体含有母细胞来源的蛋白质、rrna、mirna以及dna等，在生理和疾病状态下介导细胞间的信号转导，具有疾病诊断、免疫调节等作用。肺来源的外泌体介导的细胞间相互作用可能在肺癌的发生转移过程中发挥重要的作用，而循环血液中肺来源外泌体的肺癌特异性蛋白和rna可以成为肺癌诊断的理想生物标志物，这将对肺癌的早期诊断、早期治疗及预后判断提供客观依据。
5.以血清肺来源外泌体为例的液体诊断具有以下优点：1、创伤小，病人依从性好；2、收集方便，利于存储；3、简单方便易操作。但是从血清中直接抽提肺来源蛋白、rna难度较大。
6.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的第一目的在于提供一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂，该试剂组提供的各个试剂组分之间协调配合，使用后可完整的将外泌体中的蛋白和rna提取出来。
8.本发明的第二目的在于提供上述复合试剂的使用方法，该方法步骤简单，可完整的提取出肺来源外泌体的蛋白和rna，解决现有技术中难以提取肺来源蛋白、rna的问题。
9.为了实现上述目的，本发明特采用以下技术方案：
10.本发明提供了一种用于肺来源外泌体组成物质抽提的复合试剂，该复合试剂包括富集试剂组、抽提试剂组；
11.所述富集试剂组包括富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3，所述富集试剂1按重量份计，包括10-20份浓度为25％的peg20000、5-15份浓度为20％的peg10000、1-4份浓度为0.05％的吐温20、1-4份磷酸二氢钾溶液、1-4份磷酸氢二钠溶液、1-4份氯化钠溶液和1-4份
氯化钾溶液，所述富集试剂2按重量份计，包括5-15份浓度为20％的peg20000、5-15份浓度为20％的peg8000、5-15份葡萄糖溶液和2-8份乙酸钠溶液，所述富集试剂3包括0.1-5份包被sftpc抗体的protein a/g磁珠；
12.所述抽提试剂组包括蛋白抽提试剂组和rna抽提试剂组；
13.所述蛋白抽提试剂组包括ripa强裂解液；
14.所述rna抽提试剂组包括rna抽提试剂1、rna抽提试剂2和rna抽提试剂3、rna清洗缓冲液1和rna清洗缓冲液2，所述rna抽提试剂1包括trizol裂解液，所述rna抽提试剂2包括浓度为100％的三氯甲烷，所述rna抽提试剂3包括浓度为100％的乙醇，所述rna清洗缓冲液1为3份rwp缓冲液，所述rna清洗缓冲液2为2份rpe缓冲液。
15.其中，各个试剂的用途如下所示：
16.25％的peg20000：用于富集外泌体；
17.20％的peg10000：用于富集外泌体；
18.0.05％的吐温：用于稳定缓冲液体系，便于后续洗涤；
19.磷酸二氢钾溶液、磷酸氢二钠溶液、氯化钠溶液和氯化钾溶液：缓冲液成分；
20.20％的peg20000：用于富集外泌体；
21.20％的peg8000：用于富集外泌体；
22.葡萄糖溶液：用于协助富集外泌体；
23.乙酸钠溶液：用于中和外泌体表面的阴性负离子，促进外泌体聚集沉降；
24.包被sftpc抗体的protein a/g磁珠：用于富集肺来源外泌体。
25.其中，peg可用于外泌体富集实验，不同分子量且不同浓度的peg溶液与葡萄糖等配合使用可以增加外泌体富集效果，收集得到更多的外泌体，分离效率远超单一的peg。此外，乙酸钠溶液、吐温等试剂的联合应用也增加了外泌体的分散性和稳定性，去杂质效果更好，大大地提高了外泌体的提取效率和纯度。
26.同时，采用的富集试剂组，一步步的进行外泌体的优化选择，通过富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3一步步的去除由大到小分布的杂质，保证了富集的外泌体的纯度，而且本发明所公布的各个试剂之间的比例也是极为重要的，所使用的缓冲的试剂量也是需要控制的，通过本发明的大量的实验证明，在缓冲试剂的使用量过大时，会造成外泌体的破损，在使用的缓冲试剂的量过小时，则会导致外泌体之间发生聚集的现象，而且所富集的外泌体有明显的杂质，无法保证收集的外泌体的纯度，这也就说明了本发明的各个试剂的使用的比例也是尤其重要的，是经过多次的实验得到的最佳的比例。
27.对于本发明的富集试剂组，之所以需要采用三种富集试剂，是因为通过实践发现如何只采用富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3中的任意一种，不进行组合使用，无法保证富集的外泌体的纯度，而且单一的富集试剂其配合作用较弱，无法保证在外泌体富集过程中的质量，容易发生破损也会出现外泌体聚集的现象，然而当将三种富集试剂配合后不仅保证了外泌体的质量，也能保证得到的外泌体的纯度，因此上述组合是最优的方案。
28.同样地，对于富集试剂1、富集试剂2和富集试剂3本身的组成，无论是所选择的组分还是各个组分的用量也是为了保证富集后的外泌体能够达到所要求的纯度，且在富集过程中外泌体不容易破损所服务的，比如所添加的吐温、葡萄糖等物质一方面是为了提高外泌体的分散性不容易聚集，还能够增加外泌体的稳定性更容易被聚集，但是其加量不宜过
大，否则其外泌体富集的纯度无法保证，也会因引入过多的试剂而影响富集操作的正常进行。
29.可见，对于本发明的方案来说无论是富集试剂的种类、个数，还是富集试剂本身所包含的组分以及用量，均是经过一系列的创造性实践才最终确定的，并不是通过简单的操作实践就可以得到的，是需要付出的大量创造性劳动的。
30.本发明提供的独特的复合试剂，优化了外泌体的纯化步骤，单一的富集试剂富集效果差且外泌体纯度低，通过富集试剂的联合使用，可以增加外泌体富集效果，收集得到更多的外泌体，去杂质效果更好，大大地提高了外泌体的提取效率和纯度，分离效率远超单一的peg。此外，还获得了特异性的肺来源外泌体，这也实现了常规外泌体富集试剂难以达到的结果。
31.本发明在富集得到外泌体后，接着采用的蛋白抽提试剂组与rna抽提试剂组进行收集蛋白与rna，使用内的rna抽提试剂组为复合型试剂，可以完整的将外泌体中的rna提取出来，通过rna抽提试剂1、rna抽提试剂2和rna抽提试剂3、rna清洗缓冲液1和rna清洗缓冲液2的互相配合，将外泌体中的rna去除杂质后进行提取缓冲得到纯净的rna，在经过多次的实验后，发现rna抽提试剂和缓冲液的比例是有极大的限制的，当所使用的rna抽提试剂过多时，就会损伤抽提的rna，导致rna断裂，而rna抽提试剂过少时，就会导致rna的杂质过多，导致无法进行有效的分析和诊断。
32.优选地，所述富集试剂1按重量份计，包括13-18份浓度为25％的peg20000、8-12份浓度为20％的peg10000、1.5-3份浓度为0.05％的吐温20、1.5-3份磷酸二氢钾溶液、1.5-3份磷酸氢二钠溶液、1.5-3份氯化钠溶液和1.5-3份氯化钾溶液，所述富集试剂2按重量份计，包括8-12份浓度为20％的peg20000、8-12份浓度为20％的peg8000、8-12份葡萄糖溶液和3-7份乙酸钠溶液，所述富集试剂3包括0.5-4份包被sftpc抗体的protein a/g磁珠。
33.优选地，所述富集试剂1按重量份计，包括15份浓度为25％的peg20000、10份浓度为20％的peg10000、2份浓度为0.05％的吐温20、2份磷酸二氢钾溶液、2份磷酸氢二钠溶液、2份氯化钠溶液和2份氯化钾溶液，所述富集试剂2按重量份计，包括10份浓度为20％的peg20000、10份浓度为20％的peg8000、10份葡萄糖溶液和5份乙酸钠溶液，所述富集试剂3包括1份包被sftpc抗体的protein a/g磁珠。
34.本发明还提供了上述试剂组的使用方法，该方法包括如下步骤：
35.将血清样品离心得到上清液；
36.加入富集试剂组得到复合物；
37.加入抽提试剂组得到相应的组成物质，所述组成物质包括蛋白和rna，所述蛋白包括nse和cea，所述rna包括mir-21-5p、mir-141和mir-23a。
38.优选地，加入所述富集试剂组包括如下步骤：
39.加入富集试剂1，3-5℃放置，离心后去清液得重悬液1；
40.加入富集试剂2，3-5℃放置，离心后去清液得重悬液2；
41.加入富集试剂3，3-5℃过夜孵育去清液得重悬液3。
42.优选地，所述富集试剂1与所述上清液的体积比为1：(3-5)，所述富集试剂2与所述重悬液1的体积比为1：(4-6)，所述富集试剂3与所述重悬液2的体积比为1：(4-6)。
43.优选地，当组成物质为蛋白时，选择蛋白抽提试剂，所述蛋白抽提试剂的使用方法
包括如下步骤：在重悬液3中加入蛋白抽提试剂后放置于冰箱，涡旋，重复三次，离心后取上清液即为蛋白。
44.优选地，所述蛋白抽提试剂与重悬液3的体积比为1：(0.5-2)。
45.优选地，当组成物质为rna时，选择rna抽提试剂组，所述rna抽提试剂组的使用方法包括如下步骤：
46.在重悬液3中加入rna抽提试剂1，涡旋震荡后室温放置；
47.加入rna抽提试剂2，室温放置后离心得到无色上清液；
48.加入rna抽提试剂3进行吸附。
49.优选地，还包括对吸附的rna进行冲洗的步骤：
50.进行离心后加入rna清洗缓冲液1，室温下离心后加入rna清洗缓冲液2，离心后加入去离子水，室温下离心后得到rna。
51.优选地，所述rna抽提试剂1与所述重悬液3的体积比为(4-6)：1，所述rna抽提试剂1与所述rna抽提试剂2的体积比为(3-5)：1；所述rna抽提试剂3与所述无色上清液的体积比为(1-2)：1。
52.本发明所提到的所有试剂的浓度均为体积百分比，其中包括富集试剂1、富集试剂2、富集试剂3、蛋白抽提试剂、rna抽提试剂1、rna抽提试剂2和rna抽提试剂3、rna清洗缓冲液1和rna清洗缓冲液2。
53.本发明与现有技术相比，至少有以下优异之处：
54.(1)本发明所提供的复合试剂能够从血清样品中方便、准确地抽提肺来源蛋白、rna，并且通过本发明获得的特异性蛋白、rna，可以诊断肺癌。并且本发明抽提的蛋白可以用于蛋白芯片、蛋白质谱等蛋白检测方案中，rna可用于基因二代测序，能够实时监测全面了解被检者的基因状态，达到精确检测，精确诊治，并能预测罹患疾病的可能性或指导临床诊治，对患者进行个体化靶向性的治疗。
55.(2)本发明通过上述技术方案，操作简单，实用性强，可减少外泌体提取过程中非外泌体蛋白和其他杂质的共沉淀污染，用于将样本中的外泌体从样本中分离出，使外泌体的纯度和产量大幅地提高。基于此，一份样本可进行蛋白和核酸的2个层面的抽提以及后续检测。
附图说明
56.通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
57.图1为本发明实施例所提供的外泌体的透射电镜图；
58.图2为本发明实施例所提供的外泌体的粒径浓度图，其中横坐标代表粒径，纵坐标代表囊泡浓度；
59.图3为本发明实施例所提供的外泌体表面标志物条带，其中阳性标志物cd9分子量为25kda；
60.图4为本发明实验例所提供的肺来源外泌体中nse、cea的elisa分析结果；
61.图5为本发明实验例所提供的肺来源外泌体中mir-21-5p、mir-141、mir-23a的pcr
分析结果。
具体实施方式
62.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
63.实施例1
64.本实施例提供了一种抽提肺来源外泌体组成物质的方法，其可直接从血清样品中方便、准确地抽提肺来源蛋白和rna，抽提的蛋白和rna可在肺癌的早期诊断、筛查和诊治方面有极大的应用，并且创伤小，收集存储方便，大大的提高了肺癌的发现率。
65.肺来源外泌体蛋白、rna的抽提与检测，主要包括如下步骤：
66.1、血清肺来源外泌体富集；
67.(1)将血清样品取出，在25℃下水浴解冻后放置在冰上；
68.(2)在4℃下，在2000
×
g下离心10min，收取上清液；
69.(3)在4℃下，在10000
×
g下离心30min，收取上清液；
70.(4)加入富集试剂1，在3-5℃下放置30min，富集试剂1与上清液的体积比为1：(3-5)，本实施例为了达到更好的效果，将富集试剂1与上清液的体积比选择为1：4，将温度选择为4℃；
71.(5)以3000
×
g的速度离心10min后去掉上清液得到重悬液1；
72.(6)加入富集试剂2，在3-5℃下放置30min，富集试剂2与重悬液1的体积比为1：(4-6)，本实施例为了保证富集的效果，将富集试剂2与重悬液1的体积比选择为1：5，将温度选择为4℃；
73.(7)以3000
×
g的速度离心10min后去掉上清液得到重悬液2，此时得到的重悬液2可用于外泌体的表征鉴定；
74.(8)加入富集试剂3，在3-5℃下过夜孵育后放置于磁力架去上清液，得到含有肺来源外泌体磁珠复合物的重悬液3，富集试剂3与重悬液2的体积比为1：(4-6)，本实施例为了达到更好的复合物，将富集试剂3与所述重悬液2的体积比选择为1：5，将温度选择为4℃。
75.将上述重悬液3一分为二，分别进行蛋白和rna的抽取。
76.2、血清肺来源蛋白的抽取；
77.(1)在重悬液3中添加蛋白抽提试剂，在冰箱放置10min后，涡旋30s，重复进行3次，蛋白抽提试剂与重悬液3的体积比为1：(0.5-2)，本实施例为了达到更好的效果，将蛋白抽提试剂与重悬液3的体积比选择为1：1；
78.(2)以13200
×
g的速度离心5min后取上清液，这就是抽取的血清肺来源蛋白溶液。
79.3、血清肺来源rna的抽提；
80.(1)往重悬液3中加入rna抽提试剂1，然后涡旋震荡1min后室温放置10min，其中，rna抽提试剂1与重悬液3的体积比为(4-6)：1，本实施例为了达到更好的效果，将rna抽提试剂1与重悬液3的体积比选择为5：1；
81.(2)然后加入rna抽提试剂2，室温放置5min后，以12000g/min的速度离心15min后
得到无色上清液，其中，rna抽提试剂1与rna抽提试剂2的体积比为(3-5)：1，本实施例为了得到更到的上清液，将rna抽提试剂1与rna抽提试剂2的体积比选择为4：1；
82.(3)往无色上清液中添加rna抽提试剂3后将上清液转移至吸附柱，将吸附柱放置于收集管内，以12000g/min的速度离心15s，去除滤出液，重复至处理完所有无色上清液，其中，rna抽提试剂3与无色上清液的体积比为(1-2)：1，本实施例为了得到更好的效果，将rna抽提试剂3与无色上清液的体积比选择为1.5：1；
83.(4)加入500μl的rna清洗缓冲液1，室温条件下，在12000
×
g的条件下离心15s冲洗吸附柱；
84.(5)加入500μl的rna清洗缓冲液2，室温条件下，在12000
×
g的条件下离心2min冲洗吸附柱；
85.(6)忘吸附柱中加入15μl的去离子水，室温条件下，在12000
×
g的条件下离心2min得到rna。
86.4、外泌体电镜检测；
87.采用外泌体电镜检测技术，观察外泌体的大小、形态等。具体步骤如下所示：
88.(1)取外泌体样本5μl滴加在铜网上，室温孵育5min；
89.(2)孵育结束后，用吸水纸在一侧吸干多余液体；
90.(3)向铜网上滴加一滴2％的乙酸双氧铀，室温孵育1min；
91.(4)孵育结束后，用吸水纸在一侧吸干多余液体；
92.(5)室温干燥20min左右，上机观察；
93.(6)测试所用的仪器信息：
94.仪器名称：纳米透射电镜检测仪
95.生产公司：fei；
96.仪器型号：tecnai g2 spirit biotwin；
97.加速电压设置：80kv。
98.检测结果如图1所示。
99.5、外泌体粒径检测；
100.采用纳米颗粒跟踪分析技术，确定外泌体分散性、粒径大小及分布情况。具体步骤如下所示：
101.(1)取冻存样本，25℃水浴解冻，冰上放置；
102.(2)安装nanopore：将nanopore安装在qnano上，并通过旋转手柄将stretch调至47mm左右；
103.(3)润湿nanopore：吸取75μl过滤好的wetting solution小心加入到lower fluid cell中，确保无气泡产生。安装upper fluid cell并盖上保护帽。通过vpm调至-20mpa，等待5min。
104.(4)调整基线电流：用75μl电解液替换lower fluid cell内的wetting solution，通过upper fluid cell加入35μl电解液在nanopore上。vpm调至20mp啊，电压调至0.1v，5min。再通过调整电压是电流在140na左右，等待5-10min；
105.(5)coating nanopore：用75μlcoating solution替换lower fluid cell内的电解液，并通过upper fluid cell加入35μl coating solution在nanopore上，盖上保护帽，
vpm调至20mpa，等待5min；
106.(6)重复步骤3；
107.(7)测定校准粒子和样本：并通过upper fluid cell加入35μl校准粒子溶液在nanopore上，vpm将压力调至2mpa，待电流稳定，并有粒子通过后，开始记录数据。压力调至5mpa再记录一次。样本是同样的操作步骤；
108.(8)点击analyse date打开需要分析的文件，右键点击unprocesswd files，进行文件处理；
109.(9)选择样本及对应压力的校准粒子，进行分析并生成图像，预览报告并保存；
110.(10)测试所用仪器的信息：
111.仪器名称：qnano纳米粒子分析仪；
112.生产公司：izon science；
113.仪器型号：qnano gold；
114.分析用软件版本：izon control suite v3.3.2.2001。
115.检测结果如图2所示。
116.6、外泌体的western blot检测；
117.取外泌体重悬液3，加入等体积的ripa(强)裂解液进行裂解以及蛋白抽提，western blot检测外泌体标志物。具体步骤如下所示：
118.(1)制胶：根据目的蛋白分子量，使用1.5mm玻璃板，15孔样品梳，配制一块10％的分离胶，5％的浓缩胶；
119.(2)样品上样；
120.(3)电泳：稳压80v进行电泳，至loading buffer(指示剂)进入分离胶中，换成稳压120v继续电泳，直至loading buffer(指示剂)到达胶最底部，即可终止电泳；
121.(4)转膜：选择孔径为0.22μm的pvdf膜，恒流200ma，转膜时间为90min；
122.(5)封闭：pbst稀释5％脱脂奶粉，封闭1h，使用pbst洗3次，每次10min；
123.(6)孵育一抗：将膜放入杂交盒中，加入相对应抗体，放于脱色摇床4℃过夜；
124.(7)孵育二抗：杂交盒放于摇床缓慢摇动，恢复室温。移除一抗，使用pbst洗膜3次，每次10min，将二抗与膜重新放入杂交盒中，置于摇床上缓慢摇动，室温孵育1h；
125.(8)移除二抗，使用pbst洗膜3次，每次10min；
126.(9)曝光：加入适量ecl发光液，使用数字成像仪，对膜进行拍照。
127.检测结果如图3所示。
128.7、外泌体蛋白bca定量检测；
129.(1)稀释样本；
130.(2)用bsa配置标准曲线；
131.(3)根据bca试剂盒要求配置bca工作液；
132.(4)将稀释好的样本加入到96孔酶标板中，加入bca工作液(样本：工作液＝1：8)；
133.(5)37℃烘箱，12min；
134.(6)酶标仪检测蛋白浓度，检测结果如表1所示。
135.表1蛋白bca定量结果
[0136][0137][0138]
8、肺来源rna定量检测；
[0139]
取1μl rna通过denovix超微量分光光度计进行rna定量检测，检测结果如表2所示。
[0140]
表2 rna定量结果
[0141] 样本名称denovix浓度(ng/μl)体积(μl)总量(ng)a260/a2801外泌体25.2315378.51.8312磁珠富集7.121071.21.449
[0142]
上述的方案中，所述富集试剂1包括15份浓度为25％的peg20000、10份浓度为20％的peg10000、2份浓度为0.05％的吐温20、2份磷酸二氢钾溶液、2份磷酸氢二钠溶液、2份氯化钠溶液和2份氯化钾溶液，所述富集试剂2按包括10份浓度为20％的peg20000、10份浓度为20％的peg8000、10份葡萄糖溶液和5份乙酸钠溶液，所述富集试剂3包括1份包被sftpc抗体的protein a/g磁珠；所述蛋白抽提试剂组包括ripa强裂解液；所述rna抽提试剂1包括trizol裂解液，所述rna抽提试剂2包括浓度为100％的三氯甲烷，所述rna抽提试剂3包括浓度为100％的乙醇，所述rna清洗缓冲液1为3份rwp缓冲液，所述rna清洗缓冲液2为2份rpe缓冲液。
[0143]
实施例2-5
[0144]
具体实施方式与实施例1一致，不同之处如下表3、表4所示。
[0145]
对比例1
[0146]
具体实施方式与实施例1一致，不同之处在于改变了25％peg20000的用量，如下表3、表4所示。
[0147]
对比例2
[0148]
具体实施方式与实施例1一致，不同之处在于改变了磷酸氢二钠溶液的用量，如下表3、表4所示。
[0149]
对比例3
[0150]
具体实施方式与实施例1一致，不同之处在于改变了20％peg20000的用量，如下表3、表4所示。
[0151]
对比例4
[0152]
具体实施方式与实施例1一致，不同之处在于改变了葡萄糖溶液的用量，如下表3、表4所示。
[0153]
对比例5
[0154]
具体实施方式与实施例1一致，不同之处结果在于未使用富集试剂1，如下表3、表4所示。
[0155]
对比例6
[0156]
具体实施方式与实施例1一致，不同之处在于未使用富集试剂3，如下表3、表4所示。
[0157]
表3富集试剂1的组分
[0158][0159][0160]
表4富集试剂2、3的组分
[0161] 20％peg2000020％peg8000葡萄糖溶液乙酸钠溶液protein a/g磁珠实施例2515580.1实施例31551525实施例4812870.5实施例51281234对比例110101051对比例210101051对比例320101051对比例41010051对比例510101051对比例610101050
[0162]
对比例7
[0163]
具体实施方式与实施例1一致，不同之处在于rna抽提试剂组选用的是rna抽提试剂1和rna抽提试剂2。
[0164]
对比例8
[0165]
采用市售的外泌体提取试剂进行实验。
[0166]
试剂盒货号：cat#exorg50a-1，主要包含外泌体提取试剂(exosome extraction reagent)、样品稀释液(sample solution)、纯化柱/1.5ml收集管(collection tubes 1.5ml)。
[0167]
按照试剂盒说明书进行外泌体提取，具体操作步骤如下：
[0168]
1.样本预处理
[0169]
对于冻存样品，室温或25℃水浴解冻，将完全融化的样品置于冰上；对于新鲜样品，收集样品后置于冰上，3,000
×
g，4℃离心15min，去除细胞或细胞碎片，离心后将上清吸入新管中。
[0170]
2.沉淀外泌体
[0171]
吸取250μl(至少100μl)处理后的血清放入1.5ml离心管(试剂盒不提供)，加入等体积(250μl)的样品稀释液，混匀，然后加入125μl外泌体提取试剂，颠倒充分混匀后4℃静置至少30min。静置后的样品1,500
×
g，4℃离心30min，管底可见白色沉淀，吸去上清，1,500
×
g，4℃离心5min，完全去除残留液体，注意不要破坏外泌体沉淀。
[0172]
3.外泌体重悬
[0173]
加入100ul样品稀释液，或下游应用所需的相应缓冲液，用移液器反复吹打或漩涡混合均匀，彻底溶解沉淀，此重悬液中含有提取的完整外泌体。
[0174]
4.外泌体纯化
[0175]
将重悬的外泌体转移至纯化柱，放入1.5ml收集管(试剂盒提供，事先已放好)中，2,000
×
g，4℃离心5min，弃掉纯化柱，收集管中为提取的外泌体。提取的外泌体可直接应用于下游实验(如，粒径分析、核酸提取等)，或者储存在2-8℃保存一周，或者-80℃保存大约三个月。
[0176]
实验例
[0177]
应用实施例1、实施例3、对比例1-8所提供的方法对20例肺癌患者和20例健康人的血清样本中的肺来源蛋白、rna抽提，结合elisa实验对肺癌疾病标志物nse、cea进行检测，实施例1的检测结果见图4。结合rt-pcr实验对mir-21-5p、mir-141、mir-23a进行检测，实施例1的检测结果见图5。
[0178]
具体步骤如下所示：
[0179]
1、血清肺来源外泌体富集；
[0180]
实施例和对比例实验方法与前述基本一致，不同之处见富集试剂1、2、3的组分表所示。
[0181]
2、血清肺来源蛋白、rna抽提；
[0182]
实验方法与实施例相同。
[0183]
3、elisa对特定蛋白含量进行检测；
[0184]
实验方法具体参考试剂盒说明书。
[0185]
4、qpcr检测mirna表达量；
[0186]
(1)cdna第一链合成；
[0187]
从-80℃冰箱中取出rna，在4℃下解冻，然后在0.2mlpcr管中配制如下反应溶液。
将pcr管置于pcr仪，运行程序：37℃孵育15min，98℃变性5min，4℃保温。
[0188]
表5反转录反应体系
[0189]
总rna1μg5xrtbuffer2μlrtenzymemix0.5μlprimermix0.5μlh2oxμlrnatmplatexμl总volume20μl
[0190]
(2)sybrgreenqpcr；
[0191]
在0.2mlpcr管中配制如下反应液。将反应液加入96孔板中，将96孔板置于abi7500实时荧光定量pcr仪中。运行程序：50℃孵育2min；95℃，10min；40个循环：95℃，15秒，60℃，1min；溶解曲线。
[0192]
表6 pcr反应体系
[0193]2×
sybrgreenpcrbuffer10μlforwardprimer(10μm)0.5μlreverseprimer(10μm)0.5μltemplate10ngddh2oxμl总volume10μl
[0194]
(3)试剂与设备；
[0195]
反转录试剂：toyoborevertraaceqpcrrtkit；
[0196]
定量pcr试剂：abipowersybrgreenpcrmastermix；
[0197]
引物合成：上海生工生物工程有限公司；
[0198]
定量pcr仪：abi7500实时荧光定量pcr系统。
[0199]
实施例3、对比例1-8的检测结果如下表7、表8所示：
[0200]
表7健康人样本实验结果
[0201][0202]
表8肺癌患者样本实验结果
[0203][0204][0205]
根据实验结果可知：
[0206]
实施例3中的试剂使用配比不是最优化组合，所以对于蛋白和核酸的定量结果有影响，得率仅有实施例1结果的50％左右。在肺癌样本的elisa检测结果中，实施例1中蛋白检测水平在8-12ng/ml，而实施例3中浓度仅有实施例1中的一半，蛋白浓度在5ng/ml左右。pcr定量检测结果中与蛋白检测结果对比可得到相同结论。
[0207]
对比例1-4中单一因素实验条件的更改均对标志物检测的结果造成了不同程度的影响。虽然在健康样本的检测结果中，对比例1-4与实施例1中标志物检测结果十分接近，这是由于本身健康样本中标志物水平较低原因导致。而在肺癌样本检测结果中，对比例1-4的蛋白标志物(nse、cea)浓度范围在2.5-5.5ng/ml，远低于实施例1中蛋白检测水平8-12ng/ml。mirna标志物(mir-21-5p、mir-141、mir-23a)相对表达量在0.8-4.4，远低于实施例1中
mirna相对表达量5.9-8.2，这就证明了本发明中的单一因素的变化会对本发明的方案产生极大的影响，在进行使用时，需要保证满足本发明的范围要求，这样才可以达到本发明的优异检测效果。
[0208]
对比例5中由于没有使用富集试剂1，导致出现初始外泌体富集总量过少的非理想状态，蛋白含量以及rna均很低，蛋白总量不超过1ug，核酸也仅有5ng左右，间接影响了标志物的检出情况，肺癌样本蛋白检测水平仅有1ng/ml，mirna相对表达量也仅在1左右，检测结果不如实施例1检测数据理想。
[0209]
对比例6中缺少了富集试剂3的使用，无法获得肺来源特异性外泌体，因此得到阴性结果。
[0210]
对比例7中使用非发明内容所述的rna抽提试剂，显示正常的蛋白定量结果，而核酸定量结果明显偏低，仅有8ng左右，而实施例1中核酸总量可达到60ng。过低的核酸总量也直接影响了对mirna标志物检测水平，mirna相对表达量也仅在1左右，检测结果不如实施例1检测数据理想。
[0211]
对比例8中使用外泌体制备市售试剂盒，经过实验，发现出现阴性结果。肺癌样本蛋白检测水平不超过2ng/ml，mirna相对表达量也不超过2，检测结果不如实施例1检测数据理想。
[0212]
通过上述实验可知，本发明具有操作简单，实用性强的特点，实施例1中通过特定比例的复合试剂能够从血清样品快速抽提出总外泌体并减少外泌体提取过程中非外泌体蛋白和其他杂质的共沉淀污染，使外泌体的纯度和产量大幅地提高。此外，特异性抗体的应用以及抽提试剂的配合使用可以方便、准确地抽提肺来源蛋白、rna，并且通过本发明获得的特异性蛋白、rna，可以诊断肺癌。
[0213]
对比例中，由于复合试剂比例的大幅度改变，其对外泌体抽提效果造成了显著影响，并间接影响了后续肺来源外泌体的富集纯度以及蛋白、核酸的抽提检测结果，呈现阴性结果。此外，市售的试剂盒由于试剂成分的不确定性，无法与本发明中后续肺来源外泌体富集直接承接，出现阴性结果。由于对比例不在本发明的范围内，所以无法达到预期检测效果。
[0214]
同时，通过实验可知：对于外泌体得率来讲，试剂联合使用总外泌体浓度每毫升可以达到为11个数量级，而常规方法仅有10个数量级左右。对比外泌体理解范围，本发明制备得到的外泌体粒径范围集中，符合文献报告，不超过200nm，且粒径均一性好，效果远超传统制备所得：其制备的外泌体范围跨度大，小至20nm，大至300nm，其已经超过传统文献报道认知。另外，在电镜检测结果对比可知，本发明复合试剂使用制备的外泌体背景干净，无明显杂质，其数量和结构均较好，外泌体呈囊泡状。传统方法制备得到的外泌体容易发生聚集和破损情况。通过粒子数与蛋白量计算比值评估外泌体纯度，其数量与总蛋白量比值高，比值可达200，远超传统方法的比值50-100，提示本发明富集试剂富集的外泌体纯度更高。最后，结合western blot技术对本发明制备的外泌体进行特定高丰度蛋白albumin和igg(l)检测，提示本发明有更显著高丰度去除作用，提示试剂联合使用的效果更好。
[0215]
最后，可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。