一种柱花草的遗传转化方法

1.本发明属于植物的遗传转化技术领域。更具体地，涉及一种柱花草的遗传转化方法。


背景技术：

2.柱花草(stylosanthes spp.)是一种重要的热带豆科植物，起源于巴西和哥伦比亚，其适应性强，产量高且富含蛋白质，在世界热带地区被广泛利用。柱花草既可用作饲草喂养牲畜，也可以用于豆科绿肥植物、人工草地建设、天然草地改良和林果草生态工程建设等。随着研究技术手段的发展，柱花草在生态学、生理生化特性、遗传多样性和转基因等方面开展了较多研究。然而，由于存在着可利用资源少和遗传能力弱等限制因素，严重制约了柱花草深入研究的开展。为解决在柱花草中存在的上述问题，最有效的手段就是通过生物技术方法对柱花草进行遗传改良。
3.目前，转基因柱花草的获得主要是通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法。然而，柱花草是一种难以被根癌农杆菌介导转化的豆科植物，根癌农杆菌介导的柱花草遗传方法的转化效率低、耗时长、成本高，严重制约了柱花草深入研究的开展。除根癌农杆菌介导的遗传转化方法外，中国专利cn113604498a中利用发根农杆菌实现了对柱花草毛状根的诱导，但其诱导率仍不够高，仅58.3％，且诱导过程操作繁琐，对培养环境的要求高，需在无菌条件下培养。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种操作简便、耗时短、遗传转化效率高的柱花草遗传转化方法。
5.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
6.本发明利用携带β-葡萄糖苷酸酶(gus)报告基因质粒的重组发根农杆菌，通过侵染柱花草下胚轴后培养并检测，成功构建了一种操作简便、耗时短、遗传转化效率高的柱花草遗传转化方法。
7.本发明所述柱花草的遗传转化方法包含以下步骤：
8.s1.取柱花草幼苗，斜切幼苗下胚轴，取地上部待用；
9.s2.在地上部的下胚轴斜切面处涂布携带有目的基因的重组发根农杆菌，随后将柱花草地上部移植于土壤基质中，同时在土壤移植处加入携带有目的基因的重组发根农杆菌菌液，完成侵染；
10.s3.将完成侵染的柱花草幼苗培养至第二对三出复叶完全展开，并长出新的根系，新长出的地下部部分即为转化后的柱花草。
11.具体地，步骤s1中所述柱花草幼苗为生长3～12d的幼苗。
12.优选地，所述幼苗为生长了6～9d的幼苗。
13.具体地，步骤s1中斜切下胚轴时，在距柱花草子叶节下0.7～1.5cm处斜切断下胚
轴。
14.优选地，在距柱花草子叶节下0.7cm处斜切断下胚轴。
15.具体地，步骤s2中所用发根农杆菌菌株为k599、arqual、msu440或c58c1。
16.优选地，所用发根农杆菌菌株为k599、arqual或c58c1。
17.具体地，步骤s2中所用发根农杆菌菌液的od600值为0.8～1.0，加入的菌液的体积为0.3～0.6ml。
18.优选地，所述发根农杆菌菌液的od600值为1.0，加入的菌液的体积为0.5ml。
19.具体地，步骤s3中所述柱花草幼苗在用保鲜膜包裹后，再放入光照培养箱中培养，培养温度为24～26℃，光照强度为80μmol m-2
s-1
，16h光照/8h黑暗。
20.具体地，所述柱花草的品种为“热研5号”圭亚那柱花草(stylosanthes guianensis)。
21.本发明具有以下有益效果：
22.本发明所述柱花草的遗传转化方法操作简便，成本低，对环境要求低，不需在无菌环境中进行，也不需要利用培养基进行诱导培养，遗传转化效率在85％以上，且耗时短，20天即可获得转化后的柱花草，克服了现有柱花草遗传转化方法耗时长，遗传转化效率低的问题。
附图说明
23.图1为本发明所述柱花草遗传转化方法的过程图；其中，图a为培养的柱花草幼苗；图b-c为斜切柱花草幼苗下胚轴；图d-e为在下胚轴斜切面处涂布携带有目的基因的重组发根农杆菌；图f为在土壤移植处加入携带有目的基因的重组发根农杆菌菌液；图g为保鲜膜包裹的柱花草幼苗；图h为培养所得的转化后的柱花草；图i为转化后的柱花草的gus染色结果。
24.图2为转基因柱花草中标记基因的检测结果；其中，图a为用9d苗期柱花草遗传转化所得转基因柱花草中标记基因的pcr检测结果；图b为用9d苗期柱花草遗传转化所得转基因柱花草中标记基因表达情况的检测结果。
25.图3为不同处理对柱花草遗传转化效率的影响；其中，图a为不同苗期对柱花草转基因植株遗传转化效率的影响结果；图b为斜切不同下胚轴位置对柱花草转基因植株遗传转化效率的影响结果；图c为使用不同发根农杆菌菌株对柱花草转基因植株遗传转化效率的影响结果。
具体实施方式
26.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
27.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
28.本发明所用柱花草材料为“热研5号”圭亚那柱花草(stylosanthes guianensis)，所述柱花草的种子保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所。
29.本发明使用的6种发根农杆菌菌株分别为：k599、ara4、ar1193、arqual、msu440和
c58c1。
30.本发明转染发根农杆菌所用质粒为ptf102载体，其携带有β-葡萄糖苷酸酶(gus)报告基因。
31.本发明所述hoagland营养液配方中含有3mm kno3、2mm ca(no3)2、0.25mμ kh2po4、0.5mm mgso4、5μm mnso4、0.5μm znso4、1.5μm cuso4、0.09μm(nh4)6mo7o
24
、23μm nab4o7和80μm fe-na-edta(ph 5.8)。
32.本发明所用土壤基质为德国k牌422泥炭土(ph 6.0)。
33.本发明所述ty培养基中含有8g/l tryptone、5g/l yeast extract、5g/l nacl和15g/l琼脂(液体培养基不需要添加)。
34.gus染色液由上海源叶生物科技有限公司提供。
35.dna提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供。
36.普通pcr试剂(2
×
rapid taq master mix)和反转录试剂(hiscript iii 1st strand cdna synthesie kit)由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供。
37.本发明的实验数据采用microsoft excel 2021进行计算和作图，采用spss软件(spss institute，美国)进行统计分析。遗传转化效率(％)＝(gus染色阳性植株数/用于gus染色的总植株数)
×
100％。
38.实施例1柱花草的遗传转化
39.1、柱花草的培养
40.将“热研5号”柱花草种子去除外种皮后放入1.5ml离心管内，加入适量无菌水没过种子，置于80℃水浴锅加热3min，冷却后把种子置于铺有湿润滤纸的培养皿内，室温萌发1～2d；把萌发的柱花草幼苗转移至hoagland营养液中正常光照培养备用(图1a)。
41.2、重组发根农杆菌的制备
42.(1)发根农杆菌的转化
43.将带有β-葡萄糖苷酸酶(gus)报告基因的ptf102质粒加入到100μl发根农杆菌(k599菌株)感受态细胞中，迅速混匀，冰上静置5min，液氮处理5min，37℃水浴5min，再冰浴5min，加入800μl lb液体培养基，混匀，在28℃、220rpm摇床中培养1h后，取100μl菌液涂到含有50mg/l链霉素的ty固体培养基中，于28℃倒置培养2～3d直至长出单菌落，挑取单菌落于100ml加有50mg/l链霉素的ty液体培养基中，于28℃、220rpm摇床培养4～5h。
44.(2)重组发根农杆菌的检测
45.利用pcr检测引物检测gus基因以筛选阳性克隆。
46.所述pcr检测引物为：gus-f：gtcccgctagtgccttgtccagtt，gus-r：gccgatgtcacgccgtatgttatt；pcr反应体系为：10μl 2
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rapid taq master mix，1μl正向引物gus-f，1μl反向引物gus-r，1μl dna，7μl ddh2o；反应程序为94℃ 4min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 0.5min，35个循环反应，72℃ 10min；pcr扩增片段大小为540bp。
47.(3)重组发根农杆菌的培养
48.取0.2ml筛选所得阳性克隆菌液加入10ml含50mg/l链霉素的ty液体培养基中，摇床中培养至发根农杆菌菌液od600值达到0.8～1时，取0.2ml菌液涂布于加有50mg/l链霉素的ty固体培养基，于28℃倒置培养2d备用。
49.3、柱花草的遗传转化
50.将正常生长9d的柱花草幼苗转移至无菌培养皿中，用11号无菌手术刀在柱花草距离子叶节下0.7cm处斜切断下胚轴(图1b、c)；取地上部，在地上部的下胚轴斜切面涂布提前准备好的发根农杆菌菌体(即取0.2ml od600值为0.8～1的发根农杆菌菌液在ty固体培养基上倒置培养2d后收集所得菌体)(图1d、e)，随后将柱花草地上部幼苗小心移植于土壤基质中，在土壤移植位置加入0.5ml od600值为1的发根农杆菌菌液(图1f)，即完成侵染过程；最后用保鲜膜封好完成浸染后的柱花草地上部幼苗(图1g)，转移至光照培养箱中，在24～26℃，光照强度80μmol m-2
s-1
和16h光照/8h黑暗的条件下培养至第二对三出复叶完全展开，并长出新的根系(图1h)，新长出的地下部部分即为转化后的柱花草；本实施例培养20d后获得了长3～6cm的转基因柱花草根系(图1i)。
51.实施例2转化后的柱花草根系中gus报告基因的检测
52.1、gus报告基因的pcr检测
53.参照dna提取试剂盒说明书提取实施例1中转化所得柱花草根系的基因组dna，以所得dna为模板，通过pcr检测转化后的柱花草根系中是否存在gus基因。所用pcr引物为：gus-f：gtcccgctagtgccttgtccagtt，gus-r：gccgatgtcacgccgtatgttatt；pcr反应体系为：10μl 2
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rapid taq master mix，1μl正向引物gus-f，1μl反向引物gus-r，1μl dna，7μl ddh2o。反应程序为94℃ 4min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 0.5min，35个循环反应，72℃ 10min。
54.结果如图2a所示，由图可知，扩增所得条带大小与预期相符(pcr扩增片段大小为540bp)，表明利用本发明所述柱花草遗传转化方法可以将目的基因成功转入柱花草中。
55.2、gus报告基因的表达情况检测
56.提取转化后柱花草根系的rna并反转录为cdna，通过pcr检测gus基因是否可在柱花草转基因株系中表达。
57.(1)rna提取：取0.1g柱花草根系样品，加入1ml trizol提取液中，充分研磨，4℃ 12000rpm离心10min，吸上清至新的1.5ml离心管中，加入200μl三氯甲烷，充分震荡混匀；4℃ 12000rpm离心15min，取上清，加入等体积异丙醇，上下充分混匀，室温放置10min；4℃ 12000rpm离心10min，用移液枪吸出上清，加入1ml 75％乙醇；4℃ 7500rpm离心5min，弃上清，并用枪头吸出管内的残留液体，风干沉淀，最后加入无rnase ddh2o溶解rna。
58.(2)cdna合成：cdna合成参考hiscript iii 1st strand cdna synthesie kit试剂盒方法。在pcr管中加入5μl rnase ddh2o、3μl total rna混匀，65℃反应5min，迅速置于冰上；加入2μl 5
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gdna wiper mix充分混匀，42℃反应2min；最后加入2μl 10
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rt mix、2μl hiscript iii enzyme mix、1μl oligo(dt)、5μl rnase ddh2o，总反应体积为20μl，充分混匀后，25℃反应5min，37℃反应45min，85℃反应5sec，最终获得cdna，置于-80℃保存备用。
59.以所得cdna为模板进行pcr扩增，pcr反应体系和程序同上。结果如图2b所示，pcr能扩增出目的片段条带，表明目的基因可在柱花草转基因株系中表达。
60.实施例3不同处理对柱花草遗传转化效率的影响
61.本发明利用实施例1所述柱花草遗传转化方法，通过gus染色，比较分析了采用不同苗期柱花草、不同下胚轴浸染部位以及不同发根农杆菌菌株对柱花草遗传转化效率的影响。本实施例所用柱花草品种为“热研5号”。
62.(1)采用不同苗期柱花草对柱花草遗传转化效率的影响
63.采用不同苗期柱花草(3、6、9和12d)进行遗传转化，使用k599发根农杆菌菌株，浸染部位为0.7cm下胚轴处。将转化后的柱花草根系从土壤基质中小心取出，用去离子水反复清洗3次后，将根系浸没于gus染色液中，于37℃反应24～36h后，统计根系被染为蓝色的植株数量，计算遗传转化效率。
64.实验数据采用microsoft excel 2021进行计算和作图，采用spss软件(spss institute，美国)进行统计分析。遗传转化效率(％)＝(gus染色阳性植株数/用于gus染色的总植株数)
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100％。
65.采用不同苗期柱花草对柱花草遗传转化效率的影响结果如图3a所示，由图3a可知，使用9d苗期柱花草进行遗传转化时，柱花草的遗传转化效率最高，为85％，6d次之，3d最低，可使用6～9d柱花草幼苗进行诱导转化。
66.(2)不同下胚轴浸染部位对柱花草遗传转化效率的影响
67.以9d苗期柱花草为材料，结合使用k599发根农杆菌菌株，比较不同下胚轴浸染部位(斜切距柱花草子叶节下0.7和1.5cm处后侵染)对柱花遗传转化效率的影响，gus染色和计算方法同上。
68.结果如图3b所示，由图3b可知，斜切侵染下胚轴0.7cm处的遗传转化效率最高，而侵染下胚轴1.5cm处的遗传转化效率显著降低。
69.(3)使用不同发根农杆菌菌株对柱花草遗传转化效率的影响
70.以9d苗期的柱花草为材料，浸染部位为0.7cm下胚轴处，使用6种不同的发根农杆菌菌株(k599、ara4、ar1193、arqual、msu440和c58c1)进行柱花草的遗传转化，比较使用不同发根农杆菌菌株对柱花草遗传转化效率的影响。结果如图3c所示，由图3c可知，使用k599、arqual和c58c1发根农杆菌进行遗传转化时，遗传转化效率均为85％以上，使用msu440时的遗传转化效率只有32.1％，而ara4和ar1193不能诱导获得转基因柱花草植株。
71.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。