一种仿生矿化骨修复支架的制备方法

1.本发明涉及医用材料领域，具体是一种仿生矿化骨修复支架的制备方法。


背景技术：

2.天然骨是一种坚硬的结缔组织，主要由无机矿物质和有机基质构成，起到保护、运动、作为体内钙/磷酸盐储存库等重要作用。尽管骨具有自愈能力，但由于创伤、肿瘤、先天畸形等因素造成的超出临界值的骨缺损导致骨不愈合的发生率仍然较高，对功能性骨移植技术的需求也在一直不断增长。目前临床干预的方法可分为自体骨移植、同种异体骨移植和人工合成生物材料等。
3.人工合成生物支架材料在体外表现出了良好的骨传导性和生物降解性，但由于缺乏骨诱导剂，不能诱导成骨分化，以至于在修复超过临界大小的骨缺损时能力欠缺。生物体内矿物质的成核、诱导成是骨骼发育的关键过程。对支架材料进行仿生矿化是对骨组织工程支架进行改性的常用方法之一。近年来，磷酸钙(cap)被报道可以为间充质干细胞提供利于骨再生的友好环境。cap涂层的骨移植替代物因其独特的生物活性和骨传导性得到了广泛的应用。在多种类型的cap 中，羟基磷灰石(hydroxyapatite,ha)在骨再生领域中的应用潜力最大。ha是一种主要存在于骨中的矿物质，参与骨传导和骨诱导，释放的磷酸盐离子在诱导干细胞成骨分化中起关键作用。因此，研究人员一直在积极寻找将类骨羟基磷灰石(ap)混合或涂覆在生物支架表面从而提高生物活性的方法。目前，制备cap涂层的方法包括热喷涂、溅射涂层、溶胶-凝胶沉积、浸渍涂层等。但这些方法普遍存在的局限性是加工温度高，不适合天然聚合物和生物材料这些熔化温度低的聚合物。利用模拟体液(simulate body fluid，sbf)进行仿生矿化形成ap可以很好地解决这一难题。sbf具有与人体血浆相似的温度、离子浓度和ph值，有利的仿生条件可以促进ap的结晶沉积。但如何实现在天然聚合物上形成均匀、足够厚的cap涂层，还有待进一步探究。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的不足，本发明提供一种仿生矿化骨修复支架的制备方法，金属有机框架材料(mof)的沸石咪唑酯框架-8(zif-8) 在体液环境中可以以自身为成核位点，沉积钙磷，从而实现自发的矿化。将zif-8与聚己内酯(pcl)复合之后，使不具备仿生矿化性能的 pcl生物支架材料表面矿化，赋予其骨诱导能力，更好的促进骨再生。
5.本发明提供的技术方案：一种仿生矿化骨修复支架的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)将zif-8与pcl颗粒混合后，加热熔融；
7.(2)将熔融后的混合材料采用近场熔体静电直写技术进行3d打印得到zif-8/pcl生物支架；
8.(3)将zif-8/pcl生物支架依次经过cacl2溶液和去离子水浸泡后干燥，再依次经过k2hpo4溶液和去离子水浸泡后干燥进行预处理；
9.(4)将经过预处理的含有zif-8的pcl生物支架在模拟体液中进行生物矿化反应，
去离子水浸泡清洗后干燥制得仿生矿化骨修复支架。
10.进一步的，所述纳米级zif-8的制备方法如下：
11.a、将六水合硝酸锌、2-甲基咪唑分别溶于甲醇制备成六水合硝酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液，将溶解后的六水合硝酸锌溶液以平稳缓慢的速度滴加进装有2-甲基咪唑溶液中进行反应，并全程磁力搅拌；其反应体系中六水合硝酸锌、2-甲基咪唑与甲醇的摩尔比为1:10:30；
12.b、将步骤a中的反应溶液匀速搅拌4～6小时后，将得到的乳白色悬浊液倒入离心管中，在离心机中以3500～5000rpm的速度离心 5～10分钟，取出后弃掉上清液；
13.c、在步骤b中弃掉上清液后的反应物质加入等量的99.7+％甲醇溶液中，并盖上离心管，上下摇晃离心管使zif-8白色沉淀分散均匀后，再以8000～10000rpm的转速离心洗涤10～12分钟，洗涤步骤共重复三次；
14.d、弃去上清液，在离心管盖上钻取一个直径2-5mm后放入60～ 70℃烘干箱，烘干过夜后将干燥的zif-8倒出，研磨成细腻粉末即 zif-8纳米材料，常温密封储存。
15.进一步的，所述步骤(1)中纳米级沸石咪唑酯框架-8与聚己内酯颗粒按照质量比1:10混合后140-150℃加热0.5-1h，搅拌均匀后继续加热1-1.5h。
16.进一步的，所述步骤(2)中mew打印参数为：间隔1-2mm、方波次数15-20次、速度8-10mm/s、加速度48-50mm/s2、叠加层数2 层。
17.进一步的，所述步骤(2)得到zif-8的pcl生物支架剪切成圆片状，放置于孔板后采用环氧乙烷消毒后再进行预处理。
18.进一步的，所述步骤(3)中将zif-8/pcl生物支架放入0.2m的 cacl2溶液中浸泡180-200s，取出后浸泡入去离子水中5-10s，再放入烘箱中干燥，烘干后放入0.2m的k2hpo4溶液中浸泡180-200s，取出后浸泡入去离子水中5-10s，再放入烘箱中干燥，以上两个步骤循环操作三次。
19.进一步的，步骤(3)中烘箱中的干燥3-5min，温度为55-65℃
20.进一步的，每升模拟体液的配置包括以下试剂：
21.序号名称质量1nacl8.035g2nahco30.355g3kcl0.225g4k2hpo4·
3h200.231g5mgcl2·
6h200.311g61.0m hcl39ml7cacl20.292g8naso40.072g9tris6.118g101.0m hcl0-5ml
[0022] 进一步的，1lsbf模拟体液的具体制备过程如下：
[0023]
a.将1l玻璃容量瓶加入700ml去离子水后放入集热式磁力搅拌机中，升高温度并保持在36.5
±
1.5℃；按照上述表格中的顺序少量多次加入1-8号试剂，全程用玻璃棒不断
搅拌；
[0024]
b.继续在容量瓶中加dh20，定容至900ml；
[0025]
c.插入ph电极，溶液ph此时为2.0
±
1.0，并缓慢加入tris，一直到ph 7.45；
[0026]
d.交替加入1.0m hcl和tris，使ph维持在7.40～7.45之间，温度保持在36.5
±
0.2℃，至tris全部加完；
[0027]
e.取出电极，加dh20定容至1000ml得到1lsbf模拟体液，并将将配好sbf模拟体液保存于4～10℃的冰箱里，在30天内用完；
[0028]
在sbf模拟体液的配置过程中，全程用开ph计监测，在配制过程中以及保存过程中溶液出现浑浊，则丢弃重新开始配置。
[0029]
进一步的，所述生物矿化反应的温度是36-37℃，反应时间是1-28 天。
[0030]
本发明中，可自发仿生矿化的zif-8/pcl生物支架通过近场熔体静电直写技术(melt electrowritten，mew)实现。具体而言，将研磨细腻均匀的zif-8粉末与pcl颗粒在进料筒中加热搅拌均匀，即可得到用于打印纤维的熔体zif-8/pcl。随后利用mew设备，在重力的作用下打印第一层网格状材料，沉积在导电玻璃板上的纤维会因为静电自动聚焦吸引后续纤维，堆叠成两层微尺度网格结构，从而制备出含有 zif-8的pcl生物支架。
[0031]
生物体液中富含丰富的金属阳离子和无机阴离子；其中，磷酸盐已被证明zif-8骨架中的金属元素有很高的亲和力，可以改变离子配位平衡，形成不溶性磷酸锌沉淀，而且生物体液中含有比锌元素更活泼的钙元素。由于zif-8结构中存在可与体液成分中竞争结合的基础条件，结合其多孔的结构优势，使其拥有了成为生物体内矿物质成核生长、离子吸附、结晶沉积的潜力位点。
[0032]
本发明利用模拟体液进行仿生矿化形成ap，使不具备仿生矿化性能的pcl生物支架材料表面矿化，赋予其骨诱导能力，更好的促进骨再生，相对于常规的pcl生物支架，具有优异的骨再生能力，且结构更加稳定。
附图说明
[0033]
图1是mew打印的纯pcl支架(左)与zif-8/pcl支架(右)材料的外观图；
[0034]
图2是纯pcl支架与zif-8/pcl支架浸泡sbf0-14天后的电镜对比图；
[0035]
图3是zif-8/pcl支架上沉积物的元素能谱图；
[0036]
图4是种植于两组支架上的活死细胞染色图；
[0037]
图5是种植于纯pcl支架与zif-8/pcl支架上的bmscs成骨诱导后沉积钙结节染色图；
[0038]
图6是种植入大鼠颅骨缺损模型动物的纯pcl支架与zif-8/pcl 支架与空白组的体内成骨能力对比图；
具体实施方式
[0039]
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0040]
以下实施例中，配制模拟体液(sbf)的方法如下：(以配置1l为例)
[0041]
(1)所需试剂(严格按照顺序)
[0042][0043]
(2)将1l玻璃容量瓶加入700ml去离子水(dh20)后放入集热式磁力搅拌机中，升高温度并保持在36.5
±
1.5℃。按照上述顺序少量多次加入1-8号试剂，全程用玻璃棒不断搅拌。若在过程中溶液中出现浑浊，则重新开始；
[0044]
(3)在容量瓶中加dh20，定容至900ml；
[0045]
(4)插入ph电极，溶液ph此时应该为2.0
±
1.0；
[0046]
(5)缓慢加入tris，加入少量tris后，待温度与ph稳定之后再继续加，一直到ph刚好低于7.45；
[0047]
(6)交替加入1.0m hcl和tris，使ph维持在7.40-7.45之间，
[0048]
(7)温度保持在36.5
±
0.2℃，至tris全部加完；
[0049]
(8)取出电极，加dh20定容至1000ml；
[0050]
(9)将配好的sbf溶液保存于4-10℃的冰箱里，在30天内用完。出现浑浊则停止使用。
[0051]
实施例1
[0052]
一种仿生矿化骨修复支架的制备方法，其具体步骤如下：
[0053]
1.制备纳米级zif-8：
[0054]
(1)使用六水合硝酸锌、2-甲基咪唑及甲醇配置成摩尔比为1:10:30的反应体系。具体为先将六水合硝酸锌、2-甲基咪唑分别溶于甲醇，将溶解后的六水合硝酸锌溶液加入滴漏装置中，以平稳缓慢的速度滴加进装有2-甲基咪唑溶液中，全程磁力搅拌。
[0055]
(2)匀速搅拌4-6小时后，将得到的乳白色悬浊液倒入离心管中，配平后放入离心机中，以3500-5000rpm的速度离心5-10分钟，取出后小心地弃掉上清液。再倒入等量的甲醇
溶液，上下摇晃离心管使zif-8白色沉淀分散均匀后，以8000-10000rpm的转速离心10-12 分钟。洗涤步骤共重复三次；
[0056]
(3)弃去上清液，在离心管盖上钻取一个小洞后放入60-70℃烘干箱，烘干过夜。隔天将干燥的zif-8倒出，研磨成细腻粉末，常温密封储存。
[0057]
2.mew打印zif-8/pcl生物支架的制备
[0058]
(1)取已制备的纳米级zif-8，用玛瑙研钵研磨成细腻粉末，按照10％的浓度与pcl颗粒材料在烧杯中搅匀(即混合体系中zif-8的质量浓度为10％)后倒入mew机器的进料桶中，150℃加热1小时。将进料桶取下，此时混合材料已为熔融状态，用直镊再次搅拌均匀后放回继续加热1小时；
[0059]
(2)设置mew打印参数为：气压0.18mpa、间隔1mm、方波次数20次、速度8mm/s、加速度48mm/s2、叠加层数2层、喷头上升层数1层、喷头上升距离1mm、z轴起始位置-6.62mm；
[0060]
(3)打印结束后将zif-8/pcl材料取下，用病理切片刀将材料裁剪为直径5mm、1cm的圆片状；
[0061]
(4)将zif-8/pcl放在6孔板中，在孔板的盖上打气孔，环氧乙烷37℃消毒后备用。
[0062]
对照实验：同样的打印方法制备纯pcl支架
[0063]
3.zif-8/pcl生物支架的体外生物矿化
[0064]
(1)材料预处理：将zif-8/pcl生物支架放入20ml 0.2m的cacl2溶液中浸泡3分钟，取出后浸泡入去离子水(dh20)中5秒钟。再放入烘箱中干燥3分钟。烘干后放入20ml 0.2m的k2hpo4溶液中浸泡 3分钟，取出后浸泡入dh20中5秒钟。再放入烘箱中干燥3分钟。
[0065]
以上两个步骤循环操作三次；
[0066]
(2)zif-8/pcl生物支架完全浸入sbf溶液，置于37度恒温培养箱中保存，隔天换液。在3天、7天时间点取样，用dh20浸泡清洗，以去除在表面形成的氯化钠结晶，放置在空气中干燥。
[0067]
对照实验：pcl支架做相同处理。图2,3示zif-8/pcl生物支架可以在模拟体液中自发生物矿化，支架表面包覆有含钙磷的沉积层。 zif-8/pcl生物支架的体内生物活性及成骨诱导性能的检测
[0068]
3.1细胞活死染色：活细胞用calcein am(绿色)染色，死亡细胞的细胞核用pi-dna(红色)染色。每个支架表面种植bmscs细胞。初始贴壁2h后，将所有支架移入新的24孔板中。带支架的板在37℃，5％ co2的环境中孵育。孵育3和7天后，观察支架表面细胞粘附情况。
[0069]
3.2von kossa染色：在3.1同样的种植密度与方法种植细胞后，每三天更换一次成骨诱导液，第十四天进行染色。细胞在4％多聚甲醛中室温洗涤固定15分钟，在1％硝酸银溶液中紫外光下孵育20分钟。
[0070]
对照实验：pcl支架做相同处理。图4示zif-8/pcl的生物活性比 pcl组好，细胞黏附和增殖明显；图5示zif-8/pcl组有更多的钙结节沉积。
[0071]
zif-8/pcl生物支架的动物体内植入实验
[0072]
(1)选取6周龄的雄性sd大鼠，随机分为两组，空白对照组及实验组。实验组大鼠颅骨左侧孔放置体外矿化14天后的zif-8/pcl生物支架，右侧孔为在sbf溶液中浸泡过同等天数的pcl生物支架。大鼠称重，按照0.4ml/100g腹腔注射10％的水合氯醛麻醉；
[0073]
(2)对手术部位消毒后，沿sd大鼠颅骨正中矢状线切开约4cm 的纵行全厚层切口。
使用直径为5mm的环钻刺对称地制造了两个圆形(直径为5mm，厚度为2mm)的颅骨缺损，依次用生理盐水冲洗；
[0074]
(3)将无菌生物支架(直径为5mm，厚度为2mm)直接放置于颅骨缺损处。植入后缝合手术切口，筋膜层必须缝合紧密防止材料移动、脱落移位；
[0075]
(4)于术后4周处死动物。收集大鼠颅骨，在10％浓度的多聚甲醛液中固定。
[0076]
zif-8/pcl生物支架的体内骨缺损修复能力检测
[0077]
micro-ct评估：术后4周处死动物，取10％多聚甲醛固定的颅骨 (每组n＝4只)。骨组织缺损区(直径为5mm，厚度为2mm)通过micro-ct扫描评估。图6示zif-8/pcl组的骨缺损基本闭合，远高于 pcl组的新骨生成，表明可自发仿生矿化的zif-8/pcl具有优异的骨再生能力。
[0078]
以上所述仅为本发明的具体实施方案的详细描述，并不以此限制本发明，凡在本发明的设计思路上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。