一种基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针、制备方法及其应用

1.本发明涉及聚集诱导荧光探针技术领域，具体涉及一种基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针的制备及其应用。


背景技术：

2.细菌感染是引起高临床发病率及死亡率的全球公共健康问题，近年来随着耐药菌的不断出现及广泛传播，如何高效的控制细菌感染成为全球重点关注的公共卫生难题。针对细菌感染性疾病以及耐药菌的广泛传播等问题给人类带来了健康风险方面的挑战，人们亟需开发快速、可靠、实时可视化追踪的方法来诊断细菌感染、追踪细菌生存能力、评估药物抗菌性。
3.荧光成像技术是生物医学研究领域中应用较为广泛的一种技术方法和手段。然而现有的荧光成像分子在细菌等微生物成像研究中，大多数传统荧光探针具有聚集引起的淬灭(acq)效应，使用的有机荧光染料分子极易出现高浓度荧光信号消减，光稳定性差，易发生光漂白，荧光背景高，成像对比度不足等缺点，进行荧光成像前还需要进行离心、分离、清洗等多步骤以去除过量荧光分子的背景干扰，操作耗时复杂，极大的限制了其在微生物检测中的应用。
4.具有聚集诱导发光性的物质能有效的解决这一难题，聚集诱导发光(aggregation-induced emission，aie)荧光材料的特点是该类分子在分散状态下不发光，而在聚集状态下才会发出强光。目前主要的聚集诱导发光材料是以四苯基乙烯为主体结构，通过引入其它基团形成电子给受体结构调节其荧光性质，其具有优异的光稳定性和大的斯托克位移被广泛应用于生物检测和成像中。
5.现有技术中用于细菌成像的aie荧光分子功能较为单一，或不具备光动力抗菌活性，或对革兰氏阴性菌的成像效果较弱，而且也存在合成路线繁琐、耗时，成本较高的问题。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明提供一种基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针、制备方法及其应用。
7.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
8.一种基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针，具有如下的结构式：
[0009][0010]
其中，r1为碳原子数3-15的烷基基团，r2为碳原子数为2-5的烷基基团。
[0011]
一种前述的基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
s1、在低温和保护气氛下，4,4'-二羟基二苯甲酮与4-溴苯甲酰苯通过mcmurry偶联反应制得化合物(1)；
[0013]
s2、所述化合物(1)与烷基溴通过williamson醚合成反应制得化合物(2)；
[0014]
s3、在保护气氛下，所述化合物(2)与4-硼酸吡啶通过suzuki偶联反应制得化合物(3)；
[0015]
s4、在保护气氛下，所述化合物(3)与碘代烷烃通过季铵化反应，制得所述聚集诱导荧光探针；
[0016]
其中，所述化合物(1)-(3)具有如下的结构：
[0017][0018]
优选的，所述制备方法包括以下步骤：
[0019]
s1-1、在0℃和氮气保护条件下，将4,4'-二羟基二苯甲酮和4-溴苯甲酰苯加入到无水四氢呋喃中，加入锌粉并保温搅拌反应1h，随后滴加四氯化钛，滴加完毕后继续保温搅拌反应30min，再升温进行回流，反应完成后冷却至室温，将反应体系缓慢滴加到碳酸钾溶液中，分离滤液并以二氯甲烷萃取，经干燥、浓缩后过硅胶柱分离纯化，以体积比3：1的石油醚-二氯甲烷混和溶剂为洗脱液，得到化合物(1)；
[0020]
s2-1、将所述化合物(1)与烷基溴加入到二甲基甲酰胺中，加入碳酸钾，升温至120℃并保温反应，反应完成后冷却至室温，加水稀释后加入二氯甲烷萃取，经干燥、浓缩后过硅胶柱分离纯化，以体积比100：1的石油醚-乙酸乙酯混和溶剂为洗脱液，得到化合物(2)；
[0021]
s3-1、在氮气保护下，将所述化合物(2)、4-硼酸吡啶、碳酸钾和四(三苯基膦)钯加入到甲苯和水的混和溶剂中，升温回流反应，反应完成后冷却至室温，倒入到冰水中搅拌，加入乙酸乙酯萃取，经干燥、浓缩后过硅胶柱分离纯化，以体积比20：1的石油醚-乙酸乙酯混和溶剂为洗脱液，得到化合物(3)；
[0022]
s4-1、在氩气保护气氛下，将所述化合物(3)加入到乙腈中，加入三氯甲烷助溶，再
加入碘代烷烃回流过夜，反应完成后浓缩，制得所述基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针。
[0023]
前述的基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针的应用，应用于制备细菌荧光成像或光动力抗菌的材料。
[0024]
更具体的，可以用于制备指示细菌存活状态或对细菌细胞膜的抗菌活性药物的筛选材料。
[0025]
本发明的有益效果为：
[0026]
(1)本发明提供的基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针及其制备方法，以四苯基乙烯为母体，并通过接枝阳离子吡啶与长链烷基的新型aie小分子荧光探针，基于其aie特性，与目前商品化的活细菌荧光染料相比，所述荧光探针不仅操作简单，而且克服了染料的高浓度荧光削减的不足，实现细菌的免洗成像，大大降低了背景信号干扰，荧光稳定性强，成像分辨率高；基于接枝基团与细菌细胞膜间的亲和性，本发明所述荧光探针与细菌细胞膜有优异的结合性能，当结合到细胞膜后发出荧光增强的敏感信号，可用于指示细菌的存活状态，实现对细菌进行快速、实时、可视化的观察分析研究，可应用于诊断细菌感染、追踪细菌生存能力、评估药物抗菌性及高通量筛选对细菌细胞膜的抗菌活性药物等多种生物医学领域；另一方面，基于材料对不同种细菌的成像能力的差异，结合流式细胞仪可开发荧光微阵列来进行不同菌种的高效区分。
[0027]
(2)本发明所述荧光探针在具备快速、灵敏、高效的细菌荧光成像的同时具有优异的光动力学抗菌活性，是新一代高效抗菌药物的潜在替代产品，基于所述荧光探针的多功能性，其在抗菌药物的高通量筛选、细菌染色试剂盒生物医学领域有着广阔的应用前景。
[0028]
(3)本发明所述荧光探针的合成路径较短，合成方法简单，成本低廉。
附图说明
[0029]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但附图及实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
[0030]
图1是本发明实施例中聚集诱导荧光探针的结构式；
[0031]
图2是本发明实施例中化合物(1)-(3)的结构式
[0032]
图3是本发明实施例所述荧光探针tpepye-c
12
的合成流程示意图；
[0033]
图4是50μmol/l的tpepye-c
12
在不同比例的dmso/thf混合溶液中的光致发光光谱图；
[0034]
图5是水溶液中不同浓度的tpepye-c
12
的光致发光光谱图(λ
ex
＝450nm)；
[0035]
图6是水溶液中不同浓度的tpepye-c
12
在580nm处的相对荧光强度光致发光光谱图(λ
ex
＝450nm)；
[0036]
图7是e.coli与不同浓度tpepye-c
12
共同孵育后在共聚焦激光扫描显微镜下的荧光图像；
[0037]
图8是s.aureus与不同浓度tpepye-c
12
共同孵育后在共聚焦激光扫描显微镜下的荧光图像；
[0038]
图9是e.coli和s.aureus在与tpepye-c
12
作用前及作用后的细胞表面zeta电位对比图；
[0039]
图10是e.coli(a,b)和s.aureus(c,d)菌落与tpepye-c
12
共同作用后在光照处理前(a,c)后(b,d)的细菌菌落生长效果图。
具体实施方式
[0040]
结合附图及以下实施例对本发明作进一步描述。
[0041]
本发明的实施例提供的基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针(tpepye-c
12
)，具备附图1所示的结构式，其中，r1为碳原子数3-15的烷基基团，r2为碳原子数为2-5的烷基基团。
[0042]
前述的基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0043]
s1、在低温和保护气氛下，4,4'-二羟基二苯甲酮与4-溴苯甲酰苯通过mcmurry偶联反应制得化合物(1)；
[0044]
s2、所述化合物(1)与烷基溴通过williamson醚合成反应制得化合物(2)；
[0045]
s3、在保护气氛下，所述化合物(2)与4-硼酸吡啶通过suzuki偶联反应制得化合物(3)；
[0046]
s4、在保护气氛下，所述化合物(3)与碘代烷烃通过季铵化反应制得所述聚集诱导荧光探针；
[0047]
其中，所述化合物(1)-(3)具有附图2所示的结构式。
[0048]
该基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针(tpepye-c
12
)，是通过4步化学合成法合成得到，其合成路线参见附图3，具体制备方法如下：
[0049]
(1)在冰水浴和氮气保护的条件下，先将4,4'-二羟基二苯甲酮(10.0g，46.7mmol)和4-溴苯甲酰苯(14.7g，56.3mmol)加入到无水四氢呋喃(200ml)中，随后加入锌粉(13.4g，205.0mmol)，于此温度下剧烈搅拌1h，随后缓慢滴加四氯化钛(11.4ml，104.0mmol)，滴加完毕，于此温度下搅拌30min，随后升温进行回流反应直到4,4'-二羟基二苯甲酮反应完全，冷却到室温，将反应体系缓慢滴加到10％k2co3(200ml)溶液中并剧烈搅拌，过滤，滤液加入二氯甲烷进行萃取，干燥，浓缩，得到粗产品，用石油醚/二氯甲烷(v/v＝3：1)为洗脱液过硅胶(200～300目)柱得到化合物1(6.1g)；
[0050]1h-nmr：(cdcl3,400mhz),9.31(t,2h,14.8hz,-oh),7.28(s,1h),7.02～7.09(m,4h),6.89(d,7.6hz,2h),6.81(d,j＝8.4hz,2h),6.70(t,j＝8.4hz,4h),6.49(dd,j＝8.4hz,2h),6.45(d,j＝8.4hz,2h)；
[0051]
(2)将所述化合物1(443mg,0.1mmol)和十二烷基溴(748mg，3mmol)加入到二甲基甲酰胺(10ml)中，随后加入碳酸钾(1.38g，10.0mmol)，升温到120℃反应直到主原料反应完全，反应完后冷却到室温，向反应体系加入水，加入二氯甲烷进行萃取，干燥，浓缩，得到粗产品，用石油醚/乙酸乙酯(v/v＝100：1)为洗脱液过硅胶(200～300目)柱得到化合物2(660mg)；
[0052]1h-nmr(cdcl3，500mhz)7.21(d,j＝7.0hz,2h),7.09～7.10(m,3h),6.99～7.00(m,2h),6.87～6.91(m,5h),3.85～3.90(m,4h),1.70～1.74(m,4h),1.39～1.41(m,4h),1.25(m,33h),0.85～0.88(m,6h)；
[0053]
(3)在氮气保护下，先将所述化合物2(1.0g，1.28mmol)、4-硼酸吡啶(315.2mg，2.56mmol)、碳酸钾(354.4mg，2.56mmol)、四三苯基膦钯(68mg，0.064mmol)加入到甲苯
(50ml)和水(5ml)中，升温至回流温度直到主原料反应完全，反应结束后冷却到室温，将反应体系倒入到冰水溶液中搅拌，加入乙酸乙酯进行萃取，干燥，浓缩，得到粗产品，用石油醚/乙酸乙酯(v/v＝20：1)为洗脱液过硅胶(200～300目)柱得到化合物3(300mg)；
[0054]1h-nmr(cdcl3,500mhz)8.59～8.60(m,2h),7.45(d,j＝5hz,2h),7.39(d,j＝7.0hz,2h),7.10～7.12(m,5h),7.03(d,j＝7hz,2h),6.94(d,j＝7.5hz,2h),6.91(d,j＝7.5hz,2h),6.61～6.64(m,4h),3.86(m,4h),1.70～1.74(m,4h),1.40(m,4h),1.24(m,32h),0.85～0.88(m,6h)；
[0055]
(4)在氩气保护下，加入所述化合物3(250mg)到乙腈(20ml)中搅拌，加入三氯甲烷(5ml)助溶，再加入碘乙烷(10eq)并回流过夜，薄层色谱分析反应完全，进行产物纯化分离，浓缩得到棕红色半粘稠状物质250mg，可用刮刀刮下。
[0056]1h-nmr(d
6-dmso,500mhz)9.05(d,j＝5.5hz,2h),8.45(d,j＝5.5hz,2h),7.91(d,j＝7.0hz,2h),7.17～7.19(m,4h),7.14(t,j＝6hz,1h),6.99(d,j＝6hz,2h),6.91(d,j＝7hz,2h),6.85(d,j＝7.5hz,2h),6.71(d,j＝7hz,2h),6.67(d,j＝7hz,2h),4.59(m,j＝6hz,2h),4.86(m,4h),1.64(m,4h),1.54(t,3h),1.35(m,4h),1.23(m,32h),0.83～0.86(m,6h)。
[0057]
实验与应用例
[0058]
1、聚集荧光性质
[0059]
本发明实施例所合成的分子具有较长的烷基链，表现出疏水性的特征，因此在thf中的分散效果比在dmso中更好；高浓度的tpepye-c
12
在thf中表现为溶解态，而在dmso中表现为聚集状态，参见附图4，随着dmso在混合液中的比例增加，tpepye-c
12
会表现出逐渐增强的荧光效果；参见附图5、6，在水溶液中，当tpepye-c
12
浓度小于1μm时不会表现出荧光发光性能，当浓度超过5μm时荧光强度会发生指数倍的增长。
[0060]
2、细菌成像
[0061]
将大肠埃希式菌(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)与3种浓度的tpepye-c
12
溶解在缓冲液(dmso：tbs＝1：100)，细菌浓度为5
×
107cfu/ml，共同孵育30min后在共聚焦激光扫描显微镜下观察(500nm-550nm)成像效果，参见附图7、8，从荧光图像的结果可以看出，tpepye-c
12
能够在免洗的条件下很好的结合在细菌表面，且对革兰氏阴性菌具有更好的结合效果。
[0062]
细菌主要包括革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌两大类，它们在细胞微观结构上存在着明显的差异。革兰氏阳性菌细胞壁由厚厚的肽聚糖层组成，在肽聚糖下方有一层聚合物磷壁酸和细胞质膜，而革兰氏阴性菌细菌壁是由夹在细胞质膜和细胞外膜之间的肽聚糖薄层组成，这使得荧光材料更难进入到革兰氏阴性菌的内部，因此导致了大多数的荧光材料对革兰氏阳性菌的成像效果更好。目前已经报到的用于细菌荧光成像的聚集诱导荧光材料中，对革兰氏阴性菌成像效果比对革兰氏阳性菌成像效果更好的荧光材料数量较少。本实施例合成的tpepye-c
12
可以通过静电作用吸附在负电性的细菌细胞膜表面，zeta电位的测试结果证实了这一特点(参见附图9)，分子上携带的长烷基侧链更有利于荧光分子插入到细菌膜的内部，从而在细菌表面表现出聚集诱导荧光特性，相比革兰氏阳性菌，本实施例合成的tpepye-c
12
对革兰氏阴性菌表现出更优越的成像效果。
[0063]
3、光动力抗菌
[0064]
大肠埃希式菌(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)菌落与tpepye-c
12
在缓冲液中共同作用30min后，再经过光强为100mw/cm2光照30min，分别进行平板涂布培养12h(37℃)，观察细菌菌落生长效果，参见附图10，本实施例合成的tpepye-c
12
具备优异的光动力学抗菌活性，是新一代高效抗菌药物的潜在替代产品；细菌与tpepye-c
12
共同孵育后在太阳光的照射下即可生成活性氧物种，活性氧物种通过氧化细菌细胞膜破坏细菌结构从而达到抗菌的作用，这种光动力学抗菌的方式避免了产生细菌耐药性的问题，而且tpepye-c
12
在光照后能够在环境中分解，降低二次污染的发生。
[0065]
本发明提供的基于四苯基乙烯的聚集诱导荧光探针、制备方法及其应用，所述聚集诱导荧光探针具有附图1所示的结构式，其中，r1为碳原子数3-15的烷基基团，r2为碳原子数为2-5的烷基基团；其是以四苯基乙烯为母体，并通过接枝阳离子吡啶与长链烷基制备得到的一种新型aie小分子荧光探针。基于该荧光探针aie特性的应用，不仅操作简单，而且克服了染料的高浓度荧光削减的不足，实现细菌的免洗成像，大大降低了背景信号干扰；基于接枝基团与细菌细胞膜间的亲和性。本发明提供的荧光探针与细菌细胞膜有优异的结合性能，当结合到细胞膜后发出荧光增强的敏感信号，可用于指示细菌的存活状态，实现对细菌进行快速、实时、可视化的观察分析研究。
[0066]
需要特别指出的是，在本发明记载的范围内，具体选择不同的组分、工艺参数，所得到的其他技术方案，均可以达到本发明的技术效果，故不再一一将其列出。
[0067]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。