专利名称:融合多核苷酸、具耐盐特性的融合多肽及表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程领域，具体涉及一种编码具耐盐特性的多肽的融合多核苷酸、其表达产物及表达载体。
背景技术：
干旱和盐渍是影响农作物产量、破坏生态环境的两个重要因素。干旱和盐渍将引起细胞体内脱水、高渗胁迫及离子失衡，导致细胞生长缓慢、发育不良，严重将使细胞和生物体死亡。植物在长期进化过程中，已发展出多种机制来适应或抵抗环境胁迫和失水反应。迄今为止，科学家们已获得了一些可表达耐盐、耐旱蛋白质的基因，如甜菜碱醛脱氢酶基因(陈受宜等人，中国专利公开号CN1221034A)，大麦HVA1基因(Xu De-ping等，Plant Physiol，1996，110249-257)，Na+/H+反向转运蛋白基因GhNHX(郑成超，中国发明专利CN1425675A)，1-磷酸甘露糖醇脱氢酶(Tarczynski，Science，1993，259508-510)，Δ`-二氢吡咯-5-羧酸还原酶(D5CR)(Kishol，P.B.K，Plant Physical，1995，1081387-1394)等。这些基因的发现为科学家们实施抗逆遗传育种工程、改善植物抗逆性，解决干旱农业问题，实现可持续发展提供了可能。迄今为止，由于植物的耐盐、耐渗透机制非常复杂，人们获得的抗旱耐盐基因数目还不多，这使得在农业生产实践中实施抗逆遗传育种工程受到了很大限制。
为了提高转基因植物的抗旱耐盐能力，人们正努力获得更多的、关键耐旱耐盐基因。然而，获得关键的耐旱耐盐基因并不是很容易的事情，需要大量的实验工作做基础。因此，研究植物耐旱耐盐基因结构和功能，不仅可揭示植物耐旱耐盐的机制，也可以利用这些基因序列中耐旱耐盐功能区序列，为进一步实施抗逆遗传育种提供基因资源。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种编码具耐盐特性的多肽的融合多核苷酸及具耐盐特性的融合多肽。
本发明的第二个目的在于提供含本发明的融合多核苷酸的表达载体。
本发明的第三个目的在于把本发明的融合多核苷酸应用于培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种。
本发明对大豆GmPM2基因(GenBank NoM80664)开放阅读框序列进行分析，推测该基因开放阅读框内的部分序列可能形成亲水的螺旋结构，该序列可能编码一个具耐盐功能的多肽，本发明根据该序列设计引物，例如序列表中SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的引物，用PCR方法扩增，获得的DNA片段与GmPM2基因相应片段的同源性达到99.8％，本发明人将该DNA序列定名为SING-22，其长度为429bp。该DNA序列SING-22具有序列表中SEQ ID NO3所示的多核苷酸序列，具体如下SEQ ID NO3所示的多核苷酸序列，具体如下GCCACGGACA ACAACAACAA CAAAACCGGT TCCAAGGTCG GAGAGTACGC AGATTACGCT 60TCTCAGAAGG CCAAGGAAAC AAAAGATGCA ACGATGGAAA AAGCTGGAGA GTACACGGAT 120
TATGCTTCGC AGAAAGCGAA GGAAGCGAAG AAGACGACCA TGGAGAAGGG TGGAGAATAC 180AAGGATTACT CTGCGGAGAA AGCTAAGGAG AGAAAAGATG CTACTGTGAA TAAGATGGGA 240GAGTATAAGG ACTATGCTGC GGAGAAAGCC AAAGAGGGGA AAGATGCTAC TGTGAATAAA 300ATGGGAGAGT ATAAGGACTA TGCTGCGGAG AAAACGAAAG AGGGGAAAGA TGCCACTGTG 360AATAAGATGG GAGAGTATAA GGATTACACT GCGGAGAAGG CGAAAGAGGG GAAAGATACG 420ACGTTGGGG 429其编码产物多肽SING-22具有序列表中SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，具体如下Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr1 5 10 15Ala Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met20 25 30Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu35 40 45Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser50 55 60Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly65 70 75 80Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala85 90 95Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr100 105 110
Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp115 120 125Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly130 135 140多肽SING-22具有17.0KD的分子量。为了表达DNA序列SING-22，本发明人用PCR方法扩增DNA序列SING-22，扩增时在DNA序列SING-22的5’端和3’端加上可连接到载体上的限制性酶切位点，例如，在5’端可加有EcoR I和XbaI位点，在3’端可加有Hind III和SpeI位点，把扩增出的DNA片段回收后，酶切，连接至表达载体，即构建了含有DNA序列SING-22的重组载体，例如图1所示的重组质粒pET28aSING-22。把获得的重组载体转化宿主，例如大肠杆菌TOP10，获得转化子。从转化子中提取重组载体再转化宿主，如大肠杆菌BL21 STAR，获得用来表达多肽SING-22的转化子，如实施例中所述的工程菌BL21/pET28aSING-22。
将扩繁后的工程菌BL21/pET28aSING-22进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导，诱导产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。经考马斯亮兰染色后，电泳板上出现一条特异的蛋白质条带。将此蛋白条带切下、酶解后用三氟乙酸洗脱。洗脱液经液质联用-电喷雾质谱(安捷伦公司)鉴定，证明此蛋白条带确为多肽SING-22。
发明人通过实验证明，多肽SING-22具有亲水性、热稳定性和耐盐特性，多肽SING-22的表达赋予重组子菌株高耐盐特性。发明人通过进一步的实验证明，DNA序列SING-22可应用于培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种中，即用来培育耐盐、耐旱、耐低温的转基因植物。
利用本领域成熟的技术手段例如实施例一中所述的方法，将上述两个相同的DNA序列SING-22头尾连接融合在一起，构建成本发明的融合多核苷酸FUS-22，它具有如序列表中SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列，其长度为864bp，序列具体如下GCCACGGACA ACAACAACAA CAAAACCGGT TCCAAGGTCG GAGAGTACGC AGATTACGCT 60TCTCAGAAGG CCAAGGAAAC AAAAGATGCA ACGATGGAAA AAGCTGGAGA GTACACGGAT 120TATGCTTCGC AGAAAGCGAA GGAAGCGAAG AAGACGACCA TGGAGAAGGG TGGAGAATAC 180AAGGATTACT CTGCGGAGAA AGCTAAGGAG AGAAAAGATG CTACTGTGAA TAAGATGGGA 240GAGTATAAGG ACTATGCTGC GGAGAAAGCC AAAGAGGGGA AAGATGCTAC TGTGAATAAA 300ATGGGAGAGT ATAAGGACTA TGCTGCGGAG AAAACGAAAG AGGGGAAAGA TGCCACTGTG 360AATAAGATGG GAGAGTATAA GGATTACACT GCGGAGAAGG CGAAAGAGGG GAAAGATACG 420ACGTTGGGGA CTAGAGCCAC GGACAACAAC AACAACAAAA CCGGTTCCAA GGTCGGAGAG 480TACGCAGATT ACGCTTCTCA GAAGGCCAAG GAAACAAAAG ATGCAACGAT GGAAAAAGCT 540GGAGAGTACA CGGATTATGC TTCGCAGAAA GCGAAGGAAG CGAAGAAGAC GACCATGGAG 600AAGGGTGGAG AATACAAGGA TTACTCTGCG GAGAAAGCTA AGGAGAGAAA AGATGCTACT 660GTGAATAAGA TGGGAGAGTA TAAGGACTAT GCTGCGGAGA AAGCCAAAGA GGGGAAAGAT 720GCTACTGTGA ATAAAATGGG AGAGTATAAG GACTATGCTG CGGAGAAAAC GAAAGAGGGG 780AAAGATGCCA CTGTGAATAA GATGGGAGAG TATAAGGATT ACACTGCGGA GAAGGCGAAA 840GAGGGGAAAG ATACGACGTT GGGG 864本发明提供的融合多核苷酸还包括可在严谨条件下与融合多核苷酸FUS-22杂交的多核苷酸序列。
本发明提供含有本发明的融合多核苷酸的重组载体，包括大肠杆菌表达载体如重组质粒pET28aFUS-22、植物表达载体如重组质粒pBI121FUS-22。使用本领域熟知的方法将本发明的融合多核苷酸FUS-22连接到工具载体上。
本发明的融合多核苷酸FUS-22编码融合多肽FUS-22，融合多肽FUS-22具有32KD的分子量。该融合多肽FUS-22具有如序列表中SEQID NO2所示的氨基酸序列，具体如下Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu Tyr1 5 10 15Ala Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr Met20 25 30Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu35 40 45Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ser50 55 60Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly65 70 75 80Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Ala85 90 95Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Thr100 105 110Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp115 120 125Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly Thr130 135 140
Arg Ala Thr Asp Asn Asn Asn Asn Lys Thr Gly Ser Lys Val Gly Glu145 150 155 160Tyr Ala Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys Glu Thr Lys Asp Ala Thr165 170 175Met Glu Lys Ala Gly Glu Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Gln Lys Ala Lys180 185 190Glu Ala Lys Lys Thr Thr Met Glu Lys Gly Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr195 200 205Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Arg Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met210 215 220Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp225 230 235 240Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Lys245 250 255Thr Lys Glu Gly Lys Asp Ala Thr Val Asn Lys Met Gly Glu Tyr Lys260 265 270Asp Tyr Thr Ala Glu Lys Ala Lys Glu Gly Lys Asp Thr Thr Leu Gly275 280 285本发明提供的融合多肽还包括可在严谨条件下与SEQ ID NO.2所述的序列杂交的氨基酸序列。
把重组载体转化宿主，如大肠杆菌、酵母、真核生物等，获得转化子。从转化子中提取重组载体，再转化宿主，如大肠杆菌BL21 STAR，获得工程用转化子，如实施例中所述的工程菌BL21/pET28aFUS-22。
将扩繁后的工程菌BL21/pET28aFUS-22进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，诱导产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。经考马斯亮兰染色后，电泳板上出现一条特异的蛋白质条带。将此蛋白条带切下、酶解后用三氟乙酸洗脱。洗脱液经液质联用-电喷雾质谱(安捷伦公司)鉴定，证明此蛋白条带为目的蛋白，即融合多核苷酸FUS-22。
发明人通过实验证明融合多肽FUS-22具有亲水性、热稳定性，并具有耐盐特性，而且表达融合多肽FUS-22的细菌细胞的耐盐特性明显高于表达多肽SING-22的细菌细胞。
本发明的融合多核苷酸可应用于培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种。
将本发明的融合多核苷酸通过本领域成熟的DNA重组技术连接到任何一种可在植物细胞中表达的工具载体上，如pBI121载体系列，构建成含有本发明的融合多核苷酸的重组载体，通过转化，将重组载体进一步导入宿主植物细胞、愈伤组织或植株，经PCR扩增法检测，融合多核苷酸已经整合到宿主植物细胞、愈伤组织或植株的基因组DNA中。转化的植物细胞、愈伤组织再生成小植株。将经过证明了的转基因植株接种至含1.5％(200Mm)NaCl的高盐固体培养基中培养，结果转基因植株的生长状态、叶片的颜色明显优于其对照植株。这一结果表明，转基因的植株对高盐、特别是NaCl、KCl，以及其他盐、低温/高温及其他渗透胁迫的耐受性。
将携带本发明的融合多核苷酸的重组载体导入植物细胞、愈伤组织、植株内的方法，可采用本领域熟知的农杆菌转化法、基因枪法、电击融合法、显微注射法、超声波法、PEG转化法、花粉管通道法、子房注射法等。
本发明优选烟草作为融合多核苷酸转化的受体植物，也可应用于其他单子叶植物或双子叶植物。
本发明的融合多核苷酸或用其构建的融合基因，可应用于植物细胞、植物愈伤组织、种子、特别是整株转基因植株的表达，用于培育具有耐盐、耐旱、耐低温特性的植物、种子及其植物细胞及组织，均在本发明的保护范围之内。
本发明的融合多核苷酸不仅可以应用于耐受NaCl、KCl，也可用于耐受其它盐胁迫，如铝胁迫、渗透胁迫、高温/低温造成的脱水胁迫。
利用相类似的方法，本发明构建的耐盐多肽和融合多核苷酸还可以与其它抗逆基因进行重组或协同，以得到抗逆性得到提高的转基因植物，均包括在本
发明内容
之列。
本发明提供的编码耐盐融合多肽的融合多核苷酸，可作为基因资源，用于农业生物育种、转基因植物及其他有益基因重组构件商业用途的遗传重组体。
本发明所使用的耐盐多核苷酸及其耐盐基因是从大豆未成熟种子中克隆，其编码的产物应属于储藏蛋白质部分，因此，本发明的融合多核苷酸及相应的融合基因，不涉及对环境、生态和食品的安全性问题。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是实施例一中重组质粒pET28aSING-22的构建过程图。
图2是实施例一中含融合多核苷酸FUS-22的重组质粒PET28aFUS-22的构建过程图。
图3是含融合多核苷酸FUS-22的植物双元表达载体的构建过程图。
具体实施方式
实施例一含融合多核苷酸序列FUS-22的大肠杆菌表达载体的构建。
1.大豆未成熟种子cDNA的制备实验所用大豆种子取自吉林省白城市农业科学研究所。
利用Promega公司的(RNAgents)RNA提取试剂盒(Total RNAIsolation System)，按照试剂盒的说明书操作，提取大豆未成熟种子的mRNA。以提取的mRNA为模板，寡核苷酸(olig)dT为引物，利用反转录试剂盒(购自Takara公司)，进行反转录(RT-PCR)反应，获得大豆未成熟种子cDNA。
反转录反应体系为10×RNA PCR缓冲液 2μlMgCl2(25mM) 4μldNTP混合物(各10mM) 2μlAMV反转录酶XL(5U/l) 1μlRNase抑制剂(40U/μl) 0.5μl寡核苷酸dT(2.5μM) 1μl
大豆未成熟种子mRNA 1μldH2O 8.5μl总共 20μl反转录(RT-PCR)反应进行的条件是将装有上述反应体系的离心管置于PCR仪内，采用以下反应条件进行反转录反应即30℃，10分钟；45～60℃，20分钟；95℃，5分钟。即得到大豆未成熟种子cDNA。
2.DNA序列SING-22的制备根据DNA序列SING-22设计一对特异性的引物，引物序列见序列表中SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，具体如下上游引物CACCGAATTCTCTAGAGCCACGGACAACAACAACAAC，下游引物GTCCAAGCTTCCTAGCACTAGTCCCCAACGTCGTATCTTT，上游引物含EcoR I和XbaI酶切位点，下游引物含HindIII和SpeI的酶切位点。将上一步反转录制得的大豆未成熟种子cDNA作PCR反应的模板，采用上述特异性引物序列，经PCR反应，扩增出两端分别带上述酶切位点的DNA序列SING-22，该PCR反应体系如下10×Ex Taq缓冲液(加Mg2+) 10μlTaKaRa Ex Taq酶(5U/μl) 0.5μl上游特异性PCR引物(20μM) 1μl下游特异性PCR引物(20μM) 1μl大豆未成熟种子cDNA 20μldH2O 67.5μl
总体积 100μl该PCR反应条件如下将装有上述反应体系的离心管置于PCR仪内，采用以下反应条件进行30个循环94℃，30秒；45～55℃，30秒；72℃，1分钟。即得到了DNA片段SING-22。
3.含融合多核苷酸序列FUS-22的大肠杆菌表达载体的构建。
将上一步扩增出的DNA片段SING-22回收后，用EcoR I和HindIII双酶切，连接至经相同酶切处理的质粒pET28a(购自Novagen公司)，获得重组质粒pET28aSING-22，如图1所示。将重组载体pET28aSING-22进行Hind III和SpeI双酶切，同时将上一步的PCR扩增产物进行XbaI和Hind III双酶切，利用了XbaI和SpeI是同尾酶的原理，将上述两个双酶切获得的产物连接，构建成含有由两个DNA序列SING-22头尾相连组成的融合多核苷酸序列FUS-22的重组载体，即重组质粒pET28aFUS-22，构建过程如图2所示。将重组质粒pET28aFUS-22进行EcoR I和Hind双酶切，即可得到本发明的融合多核苷酸序列FUS-22。将重组质粒pET28aFUS-22转化至大肠杆菌TOP10中，提取质粒进行PCR及EcoR I和HindIII双酶切鉴定，将鉴定为阳性即含有融合多核苷酸序列FUS-22的质粒转化至大肠杆菌BL21 STAR菌株，得到大肠杆菌转化子，将此工程菌命名为BL21/pET28aFUS-22。
实施例二大肠杆菌转化子BL21/pET28aFUS-22中耐盐融合多肽FUS-22的表达、鉴定及特性分析。
1.大肠杆菌转化子BL21/pET28aFUS-22中融合多肽FUS-22的表达及质谱鉴定。
(1)大肠杆菌转化子BL21/pET28aFUS-22中融合多肽FUS-22的表达。
挑取工程菌BL21/pET28aFUS-22的单克隆，接种至含50ug/ml卡那霉素的LB培养基中培养，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。菌体经沸水煮沸并离心，取上清液进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，即SDS-PAGE电泳。结果显示，与对照菌相比，工程菌BL21/pET28aFUS-22在38kD处有一条较浓的特异蛋白条带，此条带与预期的融合多肽FUS-22的分子量大小接近。
(2)大肠杆菌转化子BL21/pET28aFUS-22中融合多肽FUS-22的质谱分析。
从步骤(1)的SDS-PAGE电泳板上切下此特异蛋白条带，经胰蛋白酶消化，洗脱。洗脱液经液质联用-电喷雾质谱(安捷伦)分析。分析结果经基因数据库比较，可知该特异蛋白条带为融合多肽FUS-22。
2.融合多肽FUS-22的亲水性和热稳定性分析。
将工程菌BL21/pET28aFUS-22裂解后离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳。结果显示上清液中存在融合多肽FUS-22的条带，表明工程菌中融合多肽FUS-22以水溶性的形式存在。
将工程菌BL21/pET28aFUS-22的菌液经85℃热处理后离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳，结果显示几乎所有的大肠杆菌蛋白条带均消失，而工程菌BL21/pET28aFUS-22表达的特异性融合多肽FUS-22条带仍明显存在，表明融合多肽FUS-22具有良好的热稳定性。
实施例三融合多肽FUS-22的耐盐性分析。
为确定融合多肽FUS-22的耐盐性，我们以含空载体的工程菌(具体为菌株BL21/pET28a)作为对照组1，以含DNA序列SING-22的工程菌(具体为菌株BL21/pET28aSING-22)作为对照组2，以含融合多核苷酸FUS-22的工程菌(具体为菌株BL21/pET28aFUS-22)作为实验组1。采用平板计数法，通过观察上述三种菌株在高盐固体培养基上的生长状况，研究融合多核苷酸序列FUS-22编码的多肽在提高菌株耐盐力上的作用。
统计结果显示与对照组1(菌株BL21/pET28a)和对照组2(菌株BL21/pET28aSING-22)相比较，实验组1的菌株(菌株BL21/pET28aFUS-22)在700mMNaCl培养基上的存活率比前二者分别高3.88倍和1.98倍，在500mM KCl培养基上的存活率比前者高5.49倍和4.84倍。可见，与前二者相比，融合多肽FUS-22的表达赋予重组菌株(BL21/pET28aFUS-22)以较高的耐盐特性。
实施例四含FUS-22融合基因的植物表达载体的构建。
根据融合多核苷酸序列FUS-22设计的上游引物带有起始密码子ATG和BamH I酶切位点，以及下游引物带有终止密码子TGA和Sac I酶切位点的引物，以pET28aFUS-22质粒为模板进行PCR反应，获得FUS-22基因。引物序列见序列表中SEQID NO7和SEQ ID NO8，具体如下
上游引物CTGTGGATCCATGGCCACGGACAACAACA，下游引物CATCGAGCTCACTAGTGCCCCAACGTCGT，扩增产物经BamH I和Sac I双酶切后，连接至经相同酶切处理的植物表达载体pBI121，获得pBI121FUS-22质粒。将pBI121FUS-22质粒转化至农杆菌LBA4404(购自CAMBIA公司)中，获得农杆菌LBA4404/pBI121FUS-22。构建过程见图3。
实施例五含FUS-22基因的表达载体向烟草植株的转化。
将无菌的烟草叶盘放入上述农杆菌(LBA4404/pBI121FUS-22)菌液中侵染。暗培养3天后，将侵染后的烟草叶盘转移至含有卡那霉素和头孢霉素的分化培养基中。培养20天，在烟草叶盘的边缘分化出具有卡那霉素抗性的幼芽。此时即得到待鉴定的转FUS-22基因的烟草幼苗。
实施例六FUS-22基因在转基因植物中的分子生物学鉴定。
提取待鉴定的转FUS-22基因烟草幼苗的叶片的基因组DNA。以此为模板，以融合多核苷酸FUS-22的引物(见SEQ ID NO7和SEQID NO8)和卡那霉素基因引物进行PCR反应，经电泳检测，以出现双阳性反应结果，证明目的基因FUS-22已经整合到转基因烟草植株的基因组中。
实施例七转FUS-22基因的植物的耐盐功能分析。
将经过DNA水平鉴定的转基因烟草植株幼苗转移至含有1.5％NaCl的培养基中，以不含融合多核苷酸FUS-22的空载体pBI121烟草植株作对照，比较二者在高盐培养基中的叶子的颜色及植株生长状况。
结果表明，在1.5％NaCl的培养基中20天时，对照组的叶片颜色变黄，叶片较窄，较薄，对其相比，转基因烟草叶片颜色仍呈深绿色，叶片较厚，仍显饱满。由此可见，转FUS-22基因烟草对高盐的耐受性明显高于不含外源基因的对照组。
序列表<110>深圳大学<120>融合多核苷酸、具耐盐特性的融合多肽及表达载体<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>864<212>DNA<213>大豆(Glycine Max.L)<400>1gccacggaca acaacaacaa caaaaccggt tccaaggtcg gagagtacgc agattacgct 60tctcagaagg ccaaggaaac aaaagatgca acgatggaaa aagctggaga gtacacggat 120tatgcttcgc agaaagcgaa ggaagcgaag aagacgacca tggagaaggg tggagaatac 180aaggattact ctgcggagaa agctaaggag agaaaagatg ctactgtgaa taagatggga 240gagtataagg actatgctgc ggagaaagcc aaagagggga aagatgctac tgtgaataaa 300atgggagagt ataaggacta tgctgcggag aaaacgaaag aggggaaaga tgccactgtg 360aataagatgg gagagtataa ggattacact gcggagaagg cgaaagaggg gaaagatacg 420acgttgggga ctagagccac ggacaacaac aacaacaaaa ccggttccaa ggtcggagag 480tacgcagatt acgcttctca gaaggccaag gaaacaaaag atgcaacgat ggaaaaagct 540ggagagtaca cggattatgc ttcgcagaaa gcgaaggaag cgaagaagac gaccatggag 600aagggtggag aatacaagga ttactctgcg gagaaagcta aggagagaaa agatgctact 660gtgaataaga tgggagagta taaggactat gctgcggaga aagccaaaga ggggaaagat 720
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权利要求
1.一种融合多核苷酸，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，或可在严谨条件下与SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.如权利要求
1所述的融合多核苷酸在培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种中的应用。
3.如权利要求
2所述的融合多核苷酸在培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种中的应用，其特征在于将所述融合多核苷酸转化到植物细胞或愈伤组织，转化的植物细胞或愈伤组织再生成小植株。
4.如权利要求
3所述的融合多核苷酸在培育耐盐、耐旱、耐低温植物新品种中的应用，其特征在于所述植物选双子叶或单子叶植物。
5.一种具耐盐特性的融合多肽，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列，或可在严谨条件下与SEQ ID NO.2所述的序列杂交的氨基酸序列。
6.一种重组载体，含有权利要求
1所述的任何一种融合多核苷酸。
7.如权利要求
6所述的重组载体，为大肠杆菌表达载体。
8.如权利要求
6所述的重组载体，为植物表达载体。
专利摘要
本发明涉及融合多核苷酸、具耐盐特性的融合多肽及表达载体。本发明提供的融合多核苷酸具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，或可在严谨条件下与SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列即融合多核苷酸FUS－22是由两个相同的DNA序列SING－22头尾连接融合在一起而成。本发明提供的融合多肽具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列，或可在严谨条件下与SEQ ID NO.2所述的序列杂交的氨基酸序列，融合多肽具有亲水性、热稳定性和耐盐特性，且具有比单一耐盐多肽SING－22更高的耐盐特性；本发明提供的重组载体含有本发明的融合多核苷酸。本发明的融合多核苷酸可应用于培育抗逆植物新品种。
文档编号C12N15/70GKCN1618973SQ200410051868
公开日2005年5月25日 申请日期2004年10月15日
发明者郑易之 申请人:深圳大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan