高赖氨酸玉米组合物及其检测方法

专利名称:高赖氨酸玉米组合物及其检测方法
高赖氨酸玉米组合物及其检测方法
本申请在35USC§ 119(e)之下要求保护2003年12月11日递交的美国临时申请系列号的权益，特此将其全部内容并入作为参考。
发明领域
本发明涉及植物分子生物学领域。更加具体地，本发明涉及具有提高的赖氨酸的转基因玉米，并且涉及鉴定提供提高的赖氨酸的特异性外源DNA的测定和方法。
发明背景
Zea mays, 一般称作玉米和玉蜀黍，是一种广泛用于动物饲养的谷物。所述谷物， 即，谷粒，对于猪、牛和家禽来说是蛋白质，淀粉，和油的来源。在混合谷物饲料来源的据信为必需的十种氨基酸中，玉米特别限定于赖氨酸，苏氨酸和甲硫氨酸中。这些氨基酸的缺乏，特别是赖氨酸，需要饲料玉米或玉米粗粉补充这些营养成分，经常是通过添加大豆粗粉来提供。提高玉米谷粒中赖氨酸的水平作为使种子或粗粉作为动物饲料更有营养的方法对于本领域将是有益的。
为了利用分子生物学方法提高赖氨酸的水平，已经鉴定并使用了至少一种赖氨酸途径酶，即二氢吡啶二羧酸合酶(本文称作DHDPS)的反馈不敏感版本。在体外显示分离自大肠杆茵的细菌DHDPS基因对于由赖氨酸水平的提高而导致的抑制的敏感性要少大约200倍，并且当导入转基因烟草中时，大肠杆茵DHDPS基因的过表达导致叶组织中赖氨酸的水平提高(Glassman等，美国专利5，288, 300)。Falco等公开了在种子中具有提高水平的赖氨酸的转基因植物以及可用于生产这些转基因植物的基因(美国专利5，773，691 和6，459，019 ；美国专利申请公开号2003/0056242，将每一篇的全部内容并入本文作为参考)。在这些报告中，Falco等描述了来自大肠杆茵的反馈不敏感性DHDPS以及来自棒状杆菌属(Corynebacterium)的DHDPS (也称ScordapA)的分离和使用以生成在种子中具有提高水平的赖氨酸的转基因油菜籽，烟草，玉米和大豆植物。对于玉米，Falco等报道了相对于非转化谷粒用cordapA基因转化的谷粒中游离赖氨酸的大约130%的提高。
能够不仅对于转基因本身，还能够对于其在宿主植物或种子基因组中的定位来检测特定转基因在植物或种子，或这些植物或种子的后代中的存在或缺失将是有益的.对于定位的鉴定进一步提供了转基因事件的鉴定，通过所述转基因事件遗传工程技术人员将转基因插入到植物或种子祖先植物中。
发明概述
本发明提供可用于产生转基因事件的构建体以及可用于鉴定特定转基因事件的材料和方法，所述转基因事件致成转基因植物，其比不包括所述构建体的近亲植物积聚更高水平的赖氨酸。具体地，本发明包括无标记的转基因玉米品系，其含有通过标准玉米转化作用导入的特异性外源DNA，本文称为“LY038事件”或“事件LY038”。本发明进一步提供在获自玉米植物，种子或组织样品的DNA中检测LY038事件的存在或缺失的方法。相对于祖先或其它基本上相关的植物包含事件LY038的本发明的玉米植物在谷粒中显示提高的赖氨酸。此外，本发明提供外源DNA构建体，包含玉米球蛋白1启动子，水稻肌动蛋白1内含子，玉米二氢吡啶二羧酸酯合酶叶绿体转送肽编码DNA分子，棒状杆菌吡啶二羧酸酯合酶编码 DNA分子，和玉米球蛋白13’非翻译区，当在转基因植物细胞和植物中被可操作地连接和表达时，其导致在谷粒或其部分或源自所述谷粒或植物的加工产物中赖氨酸含量提高。在另一个实施方案中，所述构建体进一步包含Iox位点，呈现为去除用来鉴定成功的转化株的标记基因的机制的组分。
关于鉴定源自特定转基因事件的植物或种子，提供组合物和方法来检测来自包含事件LY038的新玉米植物的基因组插入区的存在，S卩，构建体在基因组中所处的位点。提供包含至少一部分插入到基因组中的外源DNA以及一部分来自在插入位点侧翼的玉米基因组的DNA(本文称为“连接序列”)的DNA分子。
在本发明的又一个实施方案中，提供包含SEQ ID NO :1或2的至少大约20个碱基对的新DNA分子，其中分别包含碱基对1781-1782或200-201。本发明进一步提供通过利用 SEQ ID NOs :3和4的引物进行的DNA扩增而获得的具有SEQ ID NO :6的序列的扩增子的序列的DNA分子；以及与所述扩增子互补的杂交探针，具有SEQ ID NO :5及其互补体的序列。 具有SEQ ID NO :5或6的序列的DNA分子跨越外源性DNA和侧翼玉米基因组DNA之间的连接区并且当用于合适的分析性测试中时对于事件LY038DNA具有诊断性。跨越外源DNA/事件LY038的基因组插入区的连接区的本发明的其它优选DNA分子是具有SEQ ID NOs -.1,2, 和11，及其互补体的序列的分子。本发明的另一方面是包含这些分子的稳定转化的玉米植物或种子。
当引物的长度允许引物在PCR反应中发挥功能并且特异性地扩增靶序列时就说引物“足够长”；大约11个核苷酸或更长的长度是足够的；更加优选大约18个核苷酸或更长，还要更加优选大约M个核苷酸或更长，甚至更加优选大约30个核苷酸足以进行并且特异性扩增靶序列。本领域技术人员将会知道甚至大于大约30个核苷酸长的引物能够被有用地用于PCR反应中，并且因此是足够长的。
可以用于鉴定事件LY038的PCR引物包含足够长的SEQ IDNO 1的DNA序列的转基因部分和足够长的SEQ ID NO :1的5，侧翼玉米DNA序列，或足够长的SEQ ID NO :2的 DNA序列的转基因部分和足够长的SEQ ID NO :2的3，侧翼玉米DNA序列。这些引物可以用于PCR方法中以提供对于事件LY038及其后代为诊断性的DNA扩增子产物。能够产生对于事件LY038为诊断性的扩增予或探针的与任何合适长度的SEQ ID NOs :1和2同源或互补的PCR引物是本发明的另一方面。例如，无限制地，对于事件LY038为诊断性的优选的引物包括那些具有SEQ ID NO :3或4任一种序列的至少大约18个连续核苷酸的引物。利用对于事件LY038及其后代为诊断性的DNA引物生产的扩增子是本发明的一方面。对于事件 LY038为诊断性的优选的扩增子具有SEQ ID NO 6的序列。
本发明的另一方面提供检测样品中相应于事件LY038的DNA的存在或缺失的方法。这些方法包括从玉米植物，种子或组织中获得DNA，将样品DNA与PCR引物组相接触，进行PCR并且检测扩增子的存在或缺失.对于事件LY038为诊断性的优选的PCR引物包括具有SEQ ID NO :3和4的序列的寡核苷酸引物，其产生具有例如SEQ IDNO :6的序列的LY038 事件特异性扩增予，其可以通过具有例如SEQID NO :5的序列的LY038事件特异性探针进行检测.
表示事件LY038存在的探针与含有对于事件LY038特异性的DNA的扩增子的杂交可以通过核酸操作技术现有的任何适合方法进行检测，包括TaqMan 测定，DNA印迹斑点杂交法等分子生物学领城普通技术人员已知的方法。本领域技术人员将会知道扩增子的检测可以通过不涉及探针与扩增子杂交的检测方法来进行，如丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶分析.本领域技术人员还将知道所述引物和探针的长度和序列可以由SEQ ID N0s:3，4，和 5所给出的例示性序列而变化，并且依然产生对于事件LY038为诊断性的PCR扩增子，或扩增予和探针组。
另一方面，本发明提供生产包含事件LY038DNA的后代植物的方法。所述后代植物可以是同系繁殖的或杂交的植物。在又一种应用中，本发明提供对于事件LY038进行标记辅助增殖的方法。根据本发明的另一方面，提供包含事件LY038DNA并且在谷粒或其部分中进一步包含提高的赖氨酸的稳定转化的玉米植物.
本发明另外涉及一种DNA检测试剂盒，其包含至少一种与SEQ IDNO :1或2同源或互补的足够长的连续核苷酸的DNA，其作为对于事件LY038或其后代特异性的DNA引物或探针而发挥作用。
本发明进一步涉及包含事件LY038的高赖氨酸玉米(Zea maya)的植物和种子及其经过加工的产物，以及源于其的后代，具有保藏为ATCC登记号PTA-5623(保藏日为2003 年10月四日)的代表性种子。此外本发明提供一种玉米植物或其部分，包括，例如，通过生长包含事件LY038的植物而生产的花粉或种子.包含事件LY038DNA的玉米植物和种子是本发明的其它方面，对其有用地采用本发明的DNA引物分子检测事件特异性序列。
LY038事件的经过加工的产物包含玉米谷粒的一部分，例如，胚乳。本发明的玉米粗粉可以由包含LY038转基因DNA分子的谷粒制成，其中所述粗粉相对于其它不含有所述 DNA分子的玉米粗粉来说赖氨酸含量高。
由下列详细的说明书，实施例和附图本发明的上述和其它方面将变得更加显而易见。包括了下列实施例以论证本发明的某些优选实施方案的实施例。本领域技术人员应当理解所述下列实施例中公开的技术代表着本发明人已在本发明的实践中充分发现作用的方法，并且因而能够被认为对于其实践构成了优选方式的实施例。不过，根据本说明书，本领域技术人员应当理解可以在公开的特定实施方案中作许多改变并且仍然获得同样的或类似结果，而不背离发明的精神和范围。
附图简述

图1是pM0N55221的质粒图谱。
图2A是外源DNA插入事件LY038的示意图。外源DNA和有关碱基对由斜体字体表示，玉米基因组DNA和和有关碱基对由正常字体表示。
图2B是插入事件LY038的包含SEQ ID NO 5的5，连接区上的序列。
图2C是插入事件LY038的包含SEQ ID NO 11的3，连接区上的序列。
序列简述
用于本发明上下文中的具有定义序列的分子在与本申请一起递交的序列表中给出。序列表的总结如下
SEQ ID NO :1是5，DNA的1961个碱基对(bp)多核苷酸序列，包含在插入位点5’侧侧翼的玉米基因组部分(bp 1-1781)和LY038事件DNA的转基因插入部分(bp 1782-1961)。
5[0028]SEQ ID NO 2是3，DNA的867bp多核苷酸序列，包含在插入位点3，侧侧翼的玉米基因组部分(bp 201-867)和LY038事件DNA的转基因插入序列(bp 1-200)。
SEQ ID NOs 3和4是可用于生产对于事件LY038DNA为诊断性的扩增子的PCR引物的多核苷酸序列。
SEQ ID N0:5是可用于杂交到扩增子上以检测事件LY038DNA的寡核苷酸探针的多核苷酸序列。
SEQ ID NO 6是对于事件LY038DNA为诊断性的扩增子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO :7 是玉米球蛋白 1 启动子(bp48_1440 ；Kriz, Biochem. Genet.， 27 239-251，1989 ;Belanger 和 Kriz，Genetics，129 863-872,1991 ；美国专利 6，329，574，将其全部内容并入本文作为参考)，水稻肌动蛋白1内含予(bp 1448-1928 ； McElroy 等，Plant Cell，2 :163_171，1990)，玉米 DHDPS 叶绿体转运肽(bp 1930-2100; Frisch 等，Mol. Gen. Genet.，228 287-293，1991)，棒状杆茵 DHDPS 基因(bp 2101-3003; Bonnassie Nucleic Acids Research,18 : 6421,1990) ；Richaud 等，J. Bacteriol., 166 297-300，1986)，玉米球蛋白 13，非翻译区(bp 3080-4079 ;Belanger 和 Kriz，同上)， 和 IoxP 位点(bp 4091-4124 ;Russell 等，Mol. Gen. Genet.，234 45-59，1992)的多核苷酸序列。
SEQ ID NO 8是棒状杆茵DHDPS基因的多核苷酸序列(Bonnassie等，Nucleic Acids Research,18 6421，1990 ;Richaud 等，J. BacteriOl.，166 297-300，1986)。
SEQ ID NO 9是在LY038事件插入位点5，侧侧翼的其它玉米基因组DNA的1736 个碱基对多核苷酸序列(见图2A)。
SEQ ID NO 10是在LY038事件插入位点3，侧侧翼的其它玉米基因组DNA的359 个碱基对多核苷酸序列(见图2A)。
SEQ ID NO :11是由转基因插入DNA的10个连续核苷酸和图2C中所示连接区的玉米基因组DNA的10个连续核苷酸组成的20个碱基对的多核苷酸序列。
发明详述
如本文所用的，“外源”DNA指并非天然发源自发现该DNA的特定构建体、细胞或生物的DNA。外源DNA可以包括这样的DNA或RNA，其对于基因组为原生的但在所述基因组中位于新的位置或连接到其它序列元件上，所述序列元件在其原生状态中并非天然与所述外源DNA相关联。用于转化植物细胞的重组DNA构建体包含外源DNA并且经常包含如下所讨论的其它元件。如本文所用的“转基因”意为外源DNA，其已经并入到宿主基因组中或能够在宿主细胞中自主复制并且能够引发一种或多种细胞产物的表达。例示性的转基因提供由其重新生成的宿主细胞或植物，相对于相应的非转化祖细胞或植物，或包含其它转基因但不包含特定问题转基因的转化的祖细胞或植物来说，具有新的表型.转基因可以通过基因转化作用直接导入植物，或者可以由用外源DNA转化的任何先前世代的植物遗传得到。
如本文所用的，“基因”或“编码序列”意为由其转录RNA分子的DNA序列.所述RNA 可以是编码蛋白质产物的mRNA，作为反义分子起作用的RNA，或结构性RNA如tRNA，rRNA, snRNA，或其它RNA。如本文所用的“表达”为指细胞内过程的组合，包括转录和翻译，通过其利用DNA分子，如基因来产生多肽或RNA分子.例示性的编码序列是棒状杆茵二氢吡啶二羧酸合酶基因(DHDPS ；Bonnassie 等，Nucleic Acids Research, 18 :6421,1990 ；Richaud等，J. BacteriOl.，166 :297-300,1986 ；SEQ ID NOs :7 和 8 的 bp2101_3003)，可用于生产具有提高的赖氨酸的玉米谷粒。被转化以包含并表达导致谷粒组织中赖氨酸增多的玉米植物棒状杆茵DHDPS基因的玉米植物，也称为高赖氨酸玉米植物.
如本文所用的，“启动子”特意为对于DNA转录起始必需的DNA序列区域，导致与被转录DNA互补的RNA的生成；此区域还可以称为“5’调控区”。启动子位于待转录的编码序列的上游并且具有作为RNA聚合酶结合位点起作用的区域并且具有与其它因子-起作用以促进RNA转录的区域。有用的植物启动子包括那些组成性的、可诱导的、组织特异性的、暂时调节的、生理节律性调节的、干旱诱导的、胁迫诱导的、发展性调节的、冷诱导的、光诱导的等等启动子.对于本发明特别重要的是胚胎特异性启动子，如，但不限于，玉米球蛋白 1 启动子(Kriz, Biochem. Genet. ,27 :239-251,1989 ；Belanger 和 Kriz, Genetics, 129 863-872,1991 ；SEQ ID NO 7 的 bp 48-1440).
如本领域所公知的，除了启动子之外，重组DNA构建体-般还包含其它调控属于元件，如但不限于3’非翻译区(如多腺苷酰化作用位点或转录终止信号)，转运或信号肽，内含子，和标记基因元件.可用于本发明的实践的3’非翻译区(3’ UTR)为球蛋白 13' UTR(Kriz, Biochem. Genet. ,27 :239-251，1989 ；Belanger 禾口 Kriz， Genetics, 129 863-872,1991 ；SEQ ID NO :7的bp 3080-407 。特别有用的转运肽是玉米DHDPS转运肽 (Frisch 等，MoL Gen. Genet. , 228 :287-293,1991 ；SEQ ID N0:7 的 bp 1930-2100).可用于本发明上下文的内舍子为水稻肌动蛋白1内含予KMcElroy等，Plant Cell,2 :163-171, 1990 ；SEQ ID NO 7 的 bp 1448-1928)。
如本文所用的，术语-玉米转意为ka mays，还叫作玉蜀黍，包括能够用玉米繁育的全部植物变体，包括野生玉米物种。在本发明的实践中通过将外源DNA导入植物基因组中转化植物的方法和组合物可以包括任何公知的和证实的方法。到目前为止，微粒和农杆菌介导的基因递送是两种最常用的植物转化方法.微粒介导的转化指涂布到微粒上的DNA 的递送，所述微粒通过几种方法被驱入靶组织中。通过使用属于农杆茵属(Agrobacterium) 的遗传工程设计的土壤细茵实现农杆茵介导的转化。几个农杆茵物种介导称作“T-DNA” 的特定DNA的传递，其可以进行遗传工程设计以携带任何希望的DNA片段进入许多植物物种。植物转化的优选方法是如在美国专利5，015，580 ；5, 550，318 ；5, 538，880 ；6, 160，208 ； 6，399，861 和 6，403，865 中所说明的 microprojectile bombardment ；以及如在美国专利 5，635，055 ；5，824，877 ；5，591，616 ；5，981，840 ；和 6，384，301 中所说明的农杆茵介导的转化，在此将所有这些专利并入本文作为参考。
如本文所用的“转基因”力生物是-种这样的生物，其基因组已经由外源遗传物质或原生遗传物质的其它拷贝，例如通过转化或重组并入而得以改变。所述转基因生物可以是植物、哺乳动物、真茵、细茵或病毒.如本文所用的-转基因植物特意为稳定转化的植物或源于其的任何后来世代的后代植物，其中所述植物或其后代的DNA包含原先并不存在于相同品系的非转基因植物中的导入的外源DNA.所述转基因植物可以另外包含被转化植物原生的序列，但是其中外源DNA已经改变以便改变所述基因的表达水平或模式.
如本文所用的，“稳定”特转化的植物是外源DNA为可遗传的植物.所述外源DNA 可以作为保持在植物细胞中并且未插入到宿主基因组中的DNA片段而可以遗传.优选地， 稳定转化的植物包含插入到核、线粒体或叶绿体的染色体DNA中的外源DNA，最优选在核染色体DNA中的外源DNA。
如本文所用的“R。转基因植物”是这样的植物，其已经用外源DNA进行直接转化或由已用外源DNA转化的细胞或细胞集群再生。如本文所用的“后代”意为任何后来世代，包括种子及其植物，其源自特定的亲本植物或亲本植物组；可以对得到的后代品系进行近交或杂交。可以对本发明的转基因植物的后代进行，例如，自交，与转基因植物杂交，与非转基因植物杂交，和/或回交。
本发明的植物的种子可以由受精的转基因植物收集并且用于生长本发明的植物的后代世代，包括含有事件LY038的外源DNA的杂交植物品系，其提供玉米谷粒中赖氨酸增多的益处。所述玉米谷粒可以加工成粗粉和油类产品或者所述谷粒可以喂饲给动物而无需加工。所述粗粉产品具体地包含增强的农学特性，增多的赖氨酸。本发明要求保护相对于其它玉米粗粉具有增多的赖氨酸的玉米粗粉，其中所述玉米粗粉包含LY038的外源DNA。
术语“事件LY038DNA”指如图2A所示包含插入到基因组中特定位置的SEQ ID NO: 7表示的外源DNA和邻近的侧翼基因组DNA，其有望从包含外源DNA的亲本植物传递给后代植物。更加具体地，事件LY038DNA还指包括Rtl转化株基因组中基因组DNA和插入的外源 DNA的界面的每种DNA区域，例如，如SEQ ID NO :1、2、5、6和11所示在5，末端在基因组DNA 中而3，末端在外源DNA中的界面周围的区域。此外，包含一种事件DNA的外源DNA序列可以被改变，同时它的宿主基因组特定位置中的原有序列，例如所述序列的部分可以被改变、 删除或扩增，并且仍然组成所述事件DNA，条件是所述外源DNA继续驻留在基因组的相同位置以及当在植物中表达时提供增加的赖氨酸水平。
转基因“事件”通过用外源DNA构建体转化植物细胞，由外源DNA插入到植物基因组中产生的植物的再生，以及特征为事件DNA的特定植物的选择来产生“转基因事件”。一般，转化许多植物细胞，产生一群植物，从中选择特定植物。术语“事件”指起始Rtl转化株和所述转化株的后代，其包括插入到基因组特定和独特位置中的外源DNA，即，事件DNA。术语 “事件”还指有性远交、自交，或重复回交产生的后代，其中至少一种用于繁殖的植物是包含事件DNA的起始Rtl转化株的任何世代。
因此，转基因“事件”是包含“事件DNA”并由它定义的植物。以此方式，“事件 LY038”包含“LY038事件DNA”。植物可以包含两种或多种不同的事件DNAs并且因此包含两种或多种不同的事件。此外，缺少给定转基因事件X的植物不包含正在讨论的事件DNAX。 事件DNA可以通过玉米繁殖领域技术人员已知的任何繁殖方案、方案或手段从植物传递给植物，世代传递给世代。
植物的转化一般利用可选择的标记和选择方法来将培养的转化细胞与非转化细胞区别开来。在某些情况下可选择的标记基因保留在转基因植物中；在其它情况下，希望去除导入在外源DNA中的可选择的标记基因或其它序列。同源重组是一种可以用于删除位于转基因植物内的标记基因的方法(美国专利6，580，019，将其全部内容并入本文作为参考)。另一种有用的从植物中去除序列的有用手段包括使用位点特异性重组酶以及它们各自的位点特异性靶位点。
根据本发明可以使用许多不同的位点特异性重组酶系统，包括，但不限于，噬茵体 Pl的Cre/lox系统，和酵母的FLP/FRT系统。噬茵体PICre/lox和酵母FLP/FRT系统构成两种特别有用的系统进行位点特异性整合或转基因的切除。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)将特异性地与其各自位点特异性重组序列(分别为Iox或FRT)相互作用以反转或切除插入序列。这两种系统的序列都相对短(Iox为34bp而FRT为47bp)并且因此便于和转化载体一起使用。已经证明FLP/FRT和Cre/lox重组酶系统在植物细胞中有效地作用。在优选的实施方案中，采用Cre/lox重组酶系统以去除可选择的标记序列，特别是侧翼为Iox P 重组位点的 NPT II 标记基因(见图 1) (bp4091-4124SEQ ID NO :7 ;Russell 等，Mol. Gen. Genet. ，234 45-59，1992)。
显示增强的所需特性，例如“增多的赖氨酸”的转基因植物、种子或其部分是含有外源DNA的植物，与缺少所需外源DNA的基本上相同基因型的植物相比所述外源DNA赋予所需的可测量的特性变化。优选的，通过将具有与增强的所需特性相关联的外源DNA的转基因植物中的特性与基本上相同基因型但缺少该外源DNA的植物中的特性相比来测量增强的所需特性。这种缺少外源DNA的植物可以是天然的野生型植物或转基因植物，优选与所述转基因植物相同的物种。优选地，缺少外源DNA的植物是包含所需外源DNA的植物的缺少所需外源DNA的同胞。这种同胞植物可以包含其它外源DNAs.增多的赖氨酸可以通过提高量的所述氨基酸在谷粒的积聚而由植物的展示的并且可以通过任何适合的方法进行测量，如适当提取的组织的质谱分析或高效液相层析法。
如本文所用的，“探针”是一种分离的寡核苷酸，其上可以附着可检测的标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂、染料或酶。这种探针与靶核酸的链互补。在本发明的情况下，这种探针与来自事件LY038的基因组DNA，例如，来自事件LY038的玉米植物或种子或其它植物部分的基因组DNA的链互补。根据本发明的探针是包括DNA，RNAJP 聚酰胺的物质，其特异性结合靶DNA并且能够用来检测靶DNA序列的存在。
“引物”是分离的寡核苷酸，其能够通过核酸杂交退火到互补的靶DNA链上并且随后通过聚合酶，例如，DNA聚合酶的作用沿着靶DNA延伸。如本文所用的，本发明的引物用来进行靶核酸序列的DNA扩增，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)并且也可以称作“PCR引物，，。
探针和引物具有足够的核苷酸长度以便在技术人员确定的杂交条件或反应条件下特异性地结合到靶DNA序列上。这种长度可以是足以用于选择的检测方法的长度的任何长度。一般地，使用长度大约为11个或更多的核苷酸，优选地大约为18个或更多的核苷酸， 更加优选地大约为M个或更多的核苷酸，并且最优选地为大约30个或更多的核苷酸。这些探针和引物特异性地杂交到靶标上。优选地，根据本发明的探针和引物具有与靶序列完全相似性的DNA序列的连续核苷酸，尽管可以通过传统方法设计不同于靶DNA序列并且保留杂交到靶DNA序列上的能力的探针.使用在，例如，Sambrook等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual, Second Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989 ^^ 中公布的方案，制备和使用探针和引物的方法是本领域技术人员已知的。
在转基因事件插入位点周围的侧翼基因组DNA序列的鉴定允许检测方法的设计， 所述检测方法对于插入到基因组特定位置上的给定转基因事件是特异性的。这种检测方法，其可以在位于基因组中不同插入位点的相同或相似转基因之间有所不同，称作事件特异性DNA检测方法，例如，事件特异性测定法.已经描述了，例如，对于草甘膦耐受性的玉米事件nk603的事件特异性测定法(美国专利申请公开号2002/0013960，将其全部内容并入本文作为参考)。[0057]在优选的实施方案中，本发明的核酸探针特异性地杂交到具有SEQ ID NOs :3_6或其互补体，最优选SEQ ID N0s:6或其互补体的核酸序列的LY038事件特异性扩增予上.在本发明的另一方面，本发明的优选核酸探针分子与SEQ ID NOs :3-6的一种或多种中所示的核酸序列，或其互补体共有在大约80%之间，优选大约90%，更优选大约95%，还要更加优选大约98%，最优选大约99%的序列同一性。对于事件LY038具有诊断性的例示性探针具有SEQ IDNO :6的序列。这些探针分子可以被本领域技术人员用作植物繁殖方法中的标记以鉴定遗传杂交的后代。探针与靶DNA分子的杂交可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行检测。这些检测方法可以包括，但不限于，荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签.
如本文所用的，“同源的”指一种核酸序列，它将会在高度严格的条件下特异性杂交到它正在与其进行比较的核酸序列的互补体上。适合的严格条件，包括促进DNA杂交的时间、温度和盐条件是本领域技术人员已知的。温度和盐都可以变化，或者当其它变量改变时温度或盐浓度可以保持恒定。在优选的实施方案中，在强烈到中等严格条件下本发明的多聚核酸将特异性地杂交到SEQ ID NO :1或2中所示的一种或多种核酸分子，或其互补体或二者中任一种的片段上。在特别优选的实施方案中，在高度严格的条件下本发明的核酸将特异性地杂交到SEQ ID NO :1或2中所示的一种或多种核酸分子或互补体或二者中任一种的片段上。探针与靶DNA分子的杂交可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行检测，这些检测方法可以包括，但不限于，荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
如本文所用的，“扩增子”指靶核酸序列的核酸扩增产物，其是核酸模板的部分。例如，为了确定得自有性杂交的玉米植物是否包含来自含有外源性LY038DNA的玉米植物的转基因事件基因组DNA，可以对从玉米植物组织样品中提取的DNA实施核酸扩增方法，其利用DNA引物对，包括源自插入的异源DNA插入位点邻近的植物基因组中侧翼序列的第一引物，和源自插入的异源DNA的第二引物，以产生对于事件DNA的存在具有诊断性的扩增子。 所述扩增予具有对于所述事件也具诊断性的长度和序列。根据用来检测所述扩增予的方法，扩增子的长度可以是引物对加一个核苷酸碱基对的组合长度，优选加大约20个核苷酸碱基对，更加优选加大约50个核苷酸碱基对，还要更加优选加大约150个核苷酸碱基对以及更多。或者，引物对可以源自插入DNA两侧的侧翼序列以便生产包括完整插入核苷酸序列的扩增子.源自植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距离插入DNA—定的距离。 这一距离可以从一个核苷酸碱基对到扩增反应的限度，或大约20，000个核苷酸碱基。术语 “扩增子的使用”具体地排除了引物二聚体，其可以在DNA热扩增反应中形成。
核酸扩增可以通过本领城已知的多种核酸扩增方法的任何一种来完成，所述方法包括聚合酶链式反应(PCR)。异源DNA插入片段的序列或来自事件LY038的侧翼DNA序列可以通过利用源自本文提供的序列的DNA引物扩增来自从ATCC保藏号PTA-5623种子或植物提取的DNA，随后进行PCR扩增子的或克隆DNA的标准DNA测序来确证(如果必要的话进行修正)。
基于本文公开的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以用来通过传统方法，例如，通过再克隆以及对这些DNA分子进行测序来确认(如果必要的话进行修正)公开的DNA序列。[0062]通过多种技术，包括但不限于基于凝胶的分析，genetic bit分析(Nikiforov等， Nucleic Acid Res. ,22 4167—4175，1994)，焦磷酸测序(ffinge, M.，Pyrosequencing-a new approach to DNA analysis, (2000)，Innovations in Pharmaceutical Technology, vol 00，4，pl8-24)，荧光偏振(Chen 等，Genome Res. ,9 492-498，1999)，和分子信标 (Tyangi等，Nature Biotech.，14 303-308，1996)来检测由扩增方法生产的扩增子。
本发明的特定目标是通过Taqman 测定(可获自AppliedBiosystems， Foster City, California)进行检测。Taqman 测定是本领域公知的检测和量化DNA 序列存在的方法，并且在由生产商提供的说明书进行了充分描述。此方法包括使用PCR扩增和通过利用特定FRET寡核苷酸探针进行杂交来检测扩增产物.所述FRET寡核苷酸探针被设计为具有共价连接到探针’和3’末端的5’荧光报告染料和3’淬灭染料。所述探针被设计为重叠了基因组和插入DNA的连接区。在热稳定的聚合物和dNIPs存在的情况下 FRET探针和PCR引物(一个引物在外源转基因DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)被环化.FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的淬灭部分分裂并且释放出去。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交存在侧翼/转基因插入序列。
优选用于Taqman 测定的pcr引物被设计为(a)具有18-25个碱基大小的长度和侧翼基因组DNA中的匹配序列以及转基因插入，(b)具有大约57-大约60°C的计算的解链温度，例如，对应于大约52-大约55°C的最佳PCR退火温度，和(c)产生包括侧翼基因组DNA和转基因插入片段之间连接区并且具有大约75-大约250个碱基对长度的产物.所述PCR引物优选位于这样的位点，从而使得连接序列离每个PCR引物的3’端至少-个碱基远。PCR引物必须不包含高度自体或相互之间互补的区域.
FRET探针被设计为横跨连接序列的序列。在优选的实施方案中，FRET探针在它们的3’端上并入了化学部分，其当探针退火到模板DNA上时结合到DNA次级槽上，由此提高探针-模板复合物的稳定性。所述探针优选地具有大约12-大约17个碱基的长度，并且具有3’次级槽结合部分，具有高于PCR引物大约5-大约7°C的计算的解链温度.引物设计公开于美国专利 5，538，848 ；6，084，102 ；和 6，127，121 中。
另一种使用本发明序列的测定法是接合性测定法.接合性测定法可以用于确定含有事件的植物对于所述事件DNA是否为纯合的，即在染色体对的每个染色体上的相同位置含有外源DNA，或对于事件DNA是否为杂合的，即只在染色体对的-个染色体上舍有外源 DNA.在一个实施方案中，采用三引物测定法，其中引物1特异性地与插入的外源DNA杂交并延伸，引物2特异性地与插入的外源DNA的5，侧侧翼的DNA杂交并延伸，而引物3特异性地与插入的外源DNA的3’侧侧翼的DNA杂交并延伸.所述三条引物对于所述事件具有诊断性.一般，外源DNA是这样的大小，例如，大约3-大约7千碱基或更大，从而使引物1和引物3不再在PCR反应中产生扩增子。当所述三条引物在PCR反应中与从对于给定事件纯合的植物中提取的DNA混合在一起时，由引物1和引物2产生单一的扩增子，其大小和序列对于所述事件DNA将是指示性的和诊断性的。当所述三条引物在PCR反应中与从不含有给定事件的植物中提取的DNA混合在一起时，由引物1和引物3产生单一的扩增子，其大小和序列对于缺少外源DNA的玉米基因组DNA将是指示性的和诊断性的。当所述三条引物在PCR 反应中与从对于给定事件杂合的植物中提取的DNA混合在一起时，产生2种扩增子1)由引物1和引物3产生的扩增子，其大小和序列对于缺少外源DNA的玉米基因组DNA将是指示性的和诊断性的，和2)由引物1和引物2产生的扩增子，其大小和序列对于所述事件DNA 将是指示性的和诊断性的。通过接合性测定法检测各种扩增子的方法是本领域技术人员已知的，包括，但不限于，凝胶电泳、Taqman 测定法、DNA斑点印迹、Invader技术、测序、 分子信标、焦磷酸测序等等。
利用本文公开的组合物和本领域公知的DNA检测方法可以开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒可以用于鉴定样品中的玉米事件LY038DNA并且可以应用到繁殖含有事件 LY038DNA的玉米植物的方法中。所述试剂盒包含可用作引物或探针并与SEQ ID NO :1或2 的任何部分同源或互补，或与包含在PM0N55221 (图1)的任何转基因遗传元件中的DNA同源或互补的DNA序列，所述pM0N55221已被插入玉米植物基因组中以形成事件LY038 (图 2)。这些DNA序列可以用于DNA扩增方法(PCR)中或用作多聚核酸杂交方法，即DNA印迹分析，或RNA印迹分析中的探针。包含在事件LY038基因组中的DNA分子(SEQ ID NO 7) 含有异源转基因遗传元件，其包括玉米球蛋白1启动子(P-ZM globl)，水稻肌动蛋白1内含子(I-Os肌动蛋白)，编码玉米二氢吡啶二羧酸合酶叶绿体转运肽的DNA分子( DHDPS CTP)，编码棒状杆菌二氢吡啶二羧酸合酶叶绿体转运肽的DNA分子(DHDPS)，玉米球蛋白 13’非编码区(T-Sii globl)，和Iox P位点并且可以用作DNA扩增的模板，或者用来选择可以在DNA检测方法中用作DNA引物或探针的同源性或互补性DNA分子。本发明考虑DNA检测领域的技术人员可以选择一种或多种与SEQ ID NO :7的转基因DNA同源或互补的DNA 分子，其可用于检测LY038及其后代基因组中的转基因DNA的方法。
下列实施例被包括来阐明本发明某些优选实施方案的例子。本领域技术人员应当理解下列实施例中公开的技术代表发明人所发现的在本发明实践中作用良好的方法，并且因而可以被认为构成了其实践优选方式的实施例。不过，根据本说明书，本领域技术人员应当理解可以在公开的具体实施方案中可以进行许多改变并且仍然获得同样或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
转基因植物的制备
分离玉米品系H99的不成熟胚进行转化。将分离自含有玉米球蛋白1启动子的载体 pM0N55221 (见图 1)的盒DNA(Kriz (1989)，同上；Belanger and Kriz (1991)，同上；美国专利号6，329，574，将其全部内容并入本文作为参考；SEQ ID NO 7的bp 48-1440)，水稻肌动蛋白1内含子(McElroy等(1990)，同上；SEQ ID NO 7的bp 1448-19 )，编码玉米 DHDPS 叶绿体转运肽的DNA分子(Frisch等(1991)，DHDPS ；SEQ ID NO :7 的bp 1930-2100)， 编码棒状杆茵二氢吡啶二羧酸合酶叶绿体转运肽的DNA分子(Bormassie等(1990)，同上；Richaud等(1986)，同上；SEQ IDNO :7的bp 2101-3003)，玉米球蛋白13，非编码区 (Belanger 和 Kriz (1991)，同上；SEQ ID NO :7 的 bp 3080-4079)，Iox P 位点(美国专利 5，658，772，特别将其全部内容并入本文作为参考；SEQ IDNO :7的bp 4091-41 )，以及!35S 启动子(Kay 等，Science, 236 1299-1302，1987 ；美国专利 5，164，316)，编码 NPTII 可选择标记的 DNA 分子(Potrykus 等(1985)，同上)，nos 3，UTR(Fraley 等，Proc. Natl. Acad, ki· (U. S. Α.), 80 4803-4807(1983)，同上)，和 Iox P 位点(美国专利 5，658，772，特别将其全部内容并入本文作为参考)粘附于金粒上。利用本领域技术人员已知的方法使用微粒轰击(microprojectile bombardment)将外源DNA导入不成熟的玉米胚胎中。利用卡那霉素选择方案选择转化的细胞。获得卡那霉素抗性calli并利用标准方法再生成几个可繁殖的Rtl转基因植物。
实施例2
繁殖方案和赖氨酸分析
表1总结了用于发展玉米事件LY038的繁殖方案和游离的赖氨酸数据，其展示在玉米谷粒组织中的高赖氨酸。最初利用PCR对通过实施例1中所述转化方法生产的植物筛选棒状杆菌DHDPS序列的存在或缺失。利用Taqman 测定技术确定转基因插入片段的拷贝数.包含具有如实施例1和图1中所述进行可操作连接的棒状杆菌DHDPS序列的DNA 分子的植物，被允许达到成熟并产生Fia种子。为了进行Fia种子生产，将最初的转基因Rtl 植物与非转基因elite玉米近交系杂交。
通过利用野外可计分卡那霉素抗性测试对Fia植物筛选NPTII序列的存在或缺失。 对于卡那霉素的不敏感性表明植物包含并且正在表达如图1中所示和实施例1中所述的 NPTII标记基因；这些植物在下文中称作NPTII+。
将NPTII+植物与表达细茵Cre重组酶的转基因玉米品系杂交以生产Fib种子。 对从每一穗收集的得到的Fib种子的样品中的游离赖氨酸水平进行测定。将展示大于大约 IOOOppm游离赖氨酸的同胞Fls谷粒升级到野外苗圃中。通过PCR和/或DNA斑点印迹对 Fib后代植物进行测定以确定DHDPS基因序列，编码Cre重组酶的序列和NPTII可选择标记基因序列的存在或缺失。所述NPTII可选择标记基因侧翼为Iox P位点(重组位点)，由此，Cre重组酶的活性导致NPTII编码序列的切除。包含DHDPS和Cre重组酶序列并且缺少NPTII序列的植物，下文中称作标记切除植物，被允许进行自花授粉以产生F2a种子。测定阳性和阴性F2a种子中的游离赖氨酸。
已经获得了包含目标外源DHDPS基因并且缺少NPTII可选择标记基因的F2a种子， 现在必需繁殖除去Cre重组酶序列。将来自标记切除植物的F2a种子种植在野外并且通过 PCR和/或DNA斑点印迹再次进行测定以确定DHDPS基因序列，编码Cre重组酶的序列和 NPTII可选择标记基因序列的存在或缺失。选择包含DHDPS序列并且缺少Cre重组酶和 NPTII序列的植物作为“阳性”植物。选择缺少DHDPS，Cre重组酶和NPTII序列的同胞植物作为“阴性”植物以作为阴性对照而起作用.将包含DHDPS序列的植物进行自花授粉以生成F3种子并在野外升级到下一代。同样地，将缺少DHDPS，Cre重组酶和NPTII序列的阴性植物进行自花授粉以生成F3种子。测定阳性和阴性F3种子中的游离赖氨酸。
由F3种子在野外生长阳性植物。选择通过Taqman 测定确定为纯合性的单个植物并命名为LY038。将&植物进行A)自花授粉以产生F4J穗，或B)与近交系杂交以产生阳性和阴性选择的F4_38A穗。测定阳性和阴性F4_38种子中的游离赖氨酸。
将事件LY038的F1^种子进行野外生长并让它进行自花授粉以产生 ^2Β种子，对其测定游离的赖氨酸。
将事件LY038的F4_38种子进行野外生长以产生F4_38植物并且进行A)自花授粉以产生Fm8种子，或B)与近交系杂交以产生杂种F1,种子，用于农学评估。将事件LY038的 Fm8种子进行野外生长并且进行A)自花授粉以产生&
种子，或B)与近交系玉米变种杂交以产生另外的杂种种子，用于另外的农学评估。
通过F5_38植物的自花授粉以产生F6_38种子和F6_38植物的自花授粉以产生F7_38种子来生成上面公开的Monsanto公司的事件LY038玉米种子的保藏物。事件LY038的美国典型培养物中心(Manassas，VA)编号为PTA-5623。
在事件LY038玉米品系的发育过程中监测游离赖氨酸的积聚。赖氨酸积聚值总结在表ι中并且以部分-每-百万个的形式代表在干重基础上存在于成熟谷物中游离赖氨酸的量。
不同的方法可用于评估含有事件LY038的成熟谷粒的赖氨酸含量。本发明的发明人考虑可用于检测和量化赖氨酸的本领域已知的其它方法以提供LY038的种子的赖氨酸含量提高的类似发现。
利用液相色谱-质谱分析/质谱分析(LC-MS/MQ分析事件LY038的玉米谷粒中游离的赖氨酸。首先将个别的事件LY038成熟玉米谷粒样品称重，研磨成精细的均勻粉末并且用含有甲醇、水和甲酸的抽提溶剂进行抽提。在谷粒为大块的情况下，使用大约30mg 的研磨粉末。利用液相色谱和多反应监测性(MRM)质谱分析技术分离样品提取物中的赖氨酸。分离后，相对于其相应的标准曲线利用其质谱分析峰区对赖氨酸进行量化，所述标准曲线是利用含重氢的d4-赖氨酸内部标准(1 制备的。
在另一种方法中，玉米谷粒的赖氨酸含量是在通过高效液相层析(HPLC)评估游离赖氨酸的基础之上的。如所述将事件LY038的单个玉米谷粒或谷粒集合研磨成精细的均勻粉末，并且在此情况下，使用大约30mg的粉末进行分析.用5%的三氯乙酸抽提氨基酸并且通过用邻苯二醛(OPA)进行柱前伯胺衍生化来实现氨基酸检测.得到的氨基酸加合物， 异吲哚，是疏水性的并且具有极好的荧光特性，其随后能够在荧光检测器上进行检测。利用反相色谱，通过位于每个氨基酸上的R基团的疏水性实现分离。为了帮助稳定荧光团，添加诸如2-巯基乙醇(SHOl2CH2OH)或3-巯基丙酸(SHCH2CH2C00H)的巯基。
表1.用来鉴定高赖氨酸玉米事件LY038的繁殖方案和赖氨酸分析
权利要求
1.一种包含SEQ ID NO 7的DNA构建体。
2.权利要求
1的DNA构建体，进一步包含重组位点。
3.权利要求
2的DNA构建体，其中所述重组位点是IoxP位点。
4.稳定转化的单子叶植物细胞，其在它的基因组中包含权利要求
1的DNA构建体。
5.权利要求
4的稳定转化的单子叶植物细胞，进一步包含IoxP位点。
6.权利要求
4的稳定转化的单子叶植物细胞，其中所述植物细胞是玉米细胞。
7.权利要求
4的稳定转化的单子叶植物细胞，其中所述植物细胞与不包括所述DNA构建体的相同物种的第二植物细胞相比生成更多的赖氨酸。
8.权利要求
6的稳定转化的单子叶植物细胞，其中所述转基因玉米植物细胞的基因组包含选自下列的序列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :11ο
9.权利要求
6、7或8的稳定转化的单子叶植物细胞，其中所述植物细胞是玉米植物细胞，并且包含SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :11，其中包含所述玉米植物细胞的种子的代表性样本已经在美国典型培养物中心(ATCC)以保藏号ΡΤΑ-5623保藏。
10.一种包含权利要求
1的DNA构建体的玉米粗粉。
11.权利要求
10的玉米粗粉，其中所述玉米粗粉包含得自植物的组织，所述植物是由 ATCC种子保藏物ΡΤΑ-5623或其后代生长的，并且其中所述玉米粗粉在DNA扩增方法中产生包含 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 11 的扩增子。
12.一种包含权利要求
1的构建体的玉米胚乳。
13.权利要求
12的玉米胚乳，其中所述玉米胚乳包含得自植物的组织，所述植物是由 ATCC种子保藏物ΡΤΑ-5623或其后代生长的，并且其中所述胚乳在DNA扩增方法中产生包含 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 11 的扩增子。
专利摘要
本文公开了检测提高赖氨酸的转基因事件存在的测定法，所述测定法是基于插入到玉米基因组中的外源DNA构建体和所述插入位点侧翼的基因组序列的DNA序列之上的。还提供了具有表达二氢吡啶二羧酸合酶的新型外源DNA构建体的转基因植物，所述二氢吡啶二羧酸合酶的活性导致植物或植物产品中赖氨酸增多。
文档编号A01H5/10GKCN1950509 B发布类型授权 专利申请号CN 200480036889
公开日2012年3月14日 申请日期2004年12月3日
发明者D·A·沃伊尔斯, K·P·马罗伊, M·A·迪兹甘, M·H·吕蒂, R·A·凯利, T·马尔瓦 申请人:孟山都技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan