通过发酵生产l-氨基酸的方法

专利名称：:通过发酵生产l-氨基酸的方法
技术领域：
：本发明涉及使用属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌生产L-氨基酸的方法。具体地说，本发明涉及生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的方法。L-苏氨酸和L-异亮氨酸都是必需氨基酸，而且L-苏氨酸被用作医疗用途的各种营养制剂的组分或用作动物饲料。L-异亮氨酸不仅用作药物，如营养制剂，还用作饲料添加剂。
背景技术：
：L-氨基酸如L-苏氨酸和L-异亮氨酸工业上是使用生产氨基酸的细菌如棒杆菌(coryneformbacteria)和属于埃希氏菌属的细菌通过发酵生产的，其中所述细菌具有生产这些L-氨基酸的能力。生产L-氨基酸的细菌包括从自然分离的菌株或其人工突变的菌株，L-氨基酸生物合成酶活性增强的重组菌株等等被用来提高这些L-氨基酸的产量。报道了利用埃希氏菌属细菌突变株生产L-苏氨酸的方法，包括利用6-二甲基氨基嘌呤抗性菌株的方法(日本专利公开(Kokai)号5-304969，和利用疏螺旋体素抗性菌株的方法(国际专利出版物W098/04715)。报道了利用埃希氏菌属细菌的重组菌株生产L-苏氨酸的方法，包括利用用质粒扩增苏氨酸操纵子的菌株的方法(日本专利公开号05-227977)和利用用质粒扩增磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因或天冬氨酸酶基因的菌株的方法(美国专利申请公开号2002/0110876)。已经报道了利用埃希氏菌属细菌突变株生产L-异亮氨酸的方法，包括利用6-二甲基氨基嘌呤抗性菌株的方法(日本专利公开号5-304969)，利用L-异亮氨酸异羟肟酸抗性菌株的方法(日本专利公开号5-130882)，和利用硫代异亮氨酸抗性菌株的方法(日本专利公开号5-130882)。已经报道了利用重组埃希氏菌属细菌生产L-异亮氨酸的方法，包括使用以质粒扩增苏氨酸脱氨酶基因或苏氨酸乙酰羟酸合成酶基因的菌株的方法(日本专利公开号2-458，欧洲专利号0593729)。已经报道了使用属于埃希氏菌属的细菌生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的方法，其中增强了编码L-苏氨酸或L-异亮氨酸的生物合成中涉及的酶的基因表达。已经报道了编码在大肠杆菌生物合成L-苏氨酸中涉及的酶的基因，包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)、苏氨酸合酶基因(thrC)等等。thrABC序列-大肠杆菌的苏氨酸生物合成途径的一部分形成操纵子，称为苏氨酸操纵子。苏氨酸操纵子的表达受细胞内L-苏氨酸和L-异亮氨酸浓度造成的转录降低的调节，这种降低被称为"弱化作用(attenuation)"。此外，已经报道了例如苏氨酸操纵子在大肠杆菌中的表达是通过位于苏氨酸启动子和苏氨酸操纵子的结构基因thrA之间的调节序列调节的(Xy皿S.P.eta1.，"JournalofMolecularBiology(J.Mol.Biol)"，AcademicPress,vol.183(1985)卯.529-541)。此外，也已报道了这个调节序列含有包含几十个核苷酸的前导序列和位于启动子区和起始密码子之间的衰减子(attenuator)。3[0009]许多苏氨酸和异亮氨酸密码子包括在前导序列中，当培养基中存在苏氨酸或异亮氨酸时，前导序列的翻译顺利地进行。这允许衰减子形成三维结构，因此降低转录和由此降低苏氨酸生物合成途径基因的表达。当培养基中不存在苏氨酸和异亮氨酸时，核糖体在前导序列上的运动减慢，而且由于mRNA三维结构的改变，苏氨酸生物合成途径基因的表达增加。已经尝试了通过解除(release)弱化作用以允许苏氨酸操纵子的高表达，在高浓度异亮氨酸和苏氨酸存在下有效生产L-苏氨酸。已经报道了苏氨酸操纵子受弱化作用轻微调节，而且当缺乏衰减子的苏氨酸操纵子与允许操纵子高表达的强有力的异源启动子连接时，它的表达增加。也已经报道了含有这种苏氨酸操纵子的细菌具有增加的L-苏氨酸生产能力(日本专利公开号05-227977)。此外，已经公开了将疏螺体素抗性赋予细菌改变了苏氨酰tRNA合酶活性，并因此苏氨酸操纵子被弱化作用轻微调节。因此可以提高L-苏氨酸生产能力(国际专利出版物W098/04715)。然而，当仅仅除去衰减子时，通过向培养基中添加L-异亮氨酸或L-苏氨酸，发生转录减少，而且尽管解除弱化作用，苏氨酸操纵子的表达仍然不足。因此，在L-苏氨酸和L-异亮氨酸浓度增加的培养基中发酵L-苏氨酸和L-异亮氨酸的过程中，期望苏氨酸操纵子的表达进一步增加。反之，当异源启动子用于指导苏氨酸操纵子表达时，下列因素如启动子和转录起始位点之间的距离、SD序列和起始密码子之间的距离和起始密码子的序列显著地影响表达。因此，难以获得最大量和稳定的表达。因此，产生具有稳定的L-异亮氨酸或L-苏氨酸生产能力的菌株是长久以来所期望的(DalbogeH.etal.，"DNA"，NewYorkNyMaryA皿Liebert，JulyandAugust,1988，Vol.7，No.6，pp.399-405)。发明概述本发明的目的是通过增强细菌中的苏氨酸生物合成途径，提高属于埃希氏菌属的细菌生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸和L-异亮氨酸的能力。为了达到上述目的，本发明的发明人勤勉地进行了研究，结果他们通过除去至少弱化作用区中的前导序列和衰减子，成功构建了不受培养基中异亮氨酸和苏氨酸介导的弱化作用调节的苏氨酸操纵子。他们还发现具有这种苏氨酸操纵子的菌株在通过发酵生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸中显示出优越的性能，并由此完成本发明。本发明的目的是提供属于埃希氏菌属并具有生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸能力的细菌，其中通过天然启动子指导所述操纵子的表达，并且其中已经从所述操纵子除去了至少前导序列和衰减子，所以弱化作用的调节被解除。本发明的又一目的是提供如上所述的埃希氏菌属细菌，其中所述苏氨酸操纵子在质粒上。本发明的又一目的是提供如上所述的埃希氏菌属细菌，其中所述苏氨酸操纵子在染色体上。本发明的又一目的是提供如上所述的埃希氏菌属细菌，它具有生产L-异亮氨酸的能力，并且其中L-异亮氨酸生物合成酶的活性增强。本发明的又一目的是提供包含涉及弱化作用的区域、天然启动子和thrABC结构基因的苏氨酸操纵子，其中从涉及弱化作用的区域(regioninvolvedinattenuation)中除去了至少前导序列和衰减子。[0021]本发明的又一目的是提供如上所述的苏氨酸操纵子，其包含SEQIDN0:1所示的序列，其中至少相应于核苷酸号188至310的序列已经被缺失。本发明的又一目的是提供如上所述的苏氨酸操纵子，其包含SEQIDN0:1所示的序列，其中至少相应于核苷酸号168至310的序列已经被缺失。本发明的又一目的是提供如上所述的苏氨酸操纵子，其包含SEQIDNO:1所示的序列，其中至少相应于核苷酸号148至310的序列已经被缺失。本发明的又一目的是提供生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的方法，包括在培养基中培养如上所述的细菌，并从该培养基中收集积累的L-苏氨酸或L-异亮氨酸。附图简述图1显示了扩增缺乏衰减子的苏氨酸操纵子的质粒构建图。图2显示了扩增缺乏涉及弱化作用的区域的苏氨酸操纵子的质粒构建图。图3显示了将缺乏涉及弱化作用的区域的苏氨酸操纵子引入染色体的温度敏感质粒的构建图。优选实施方案详述在下文中将详细解释本发明。〈1〉本发明的细菌本发明的细菌是属于埃希氏菌属的细菌，具有生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的能力，并具有修饰的苏氨酸操纵子，由此该苏氨酸操纵子的天然启动子调节表达。该苏氨酸操纵子从其中除去了至少前导序列和衰减子，所以弱化作用引起的调节被解除。下文此苏氨酸操纵子被称为"本发明的苏氨酸操纵子"。本发明的细菌可以具有生产L-苏氨酸和L-异亮氨酸的两种能力。本发明的细菌可以通过下述方法获得，将本发明的苏氨酸操纵子引入属于埃希氏菌属并且具有L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力的细菌，或给具有本发明的苏氨酸操纵子的细菌赋予L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力。此外，本发明的细菌也可以是具有L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力的细菌，因为已被修饰而具有本发明的苏氨酸操纵子。尽管用于获得本发明细菌的属于埃希氏菌属的细菌亲本菌株没有特别限制，但可以使用Neidhardtetal.(Neidhardt，F.C.etal.，EscherichiacoliandSalmonellaTyphimurium，AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.，1029，Table1)中描述的菌株。那些包括例如大肠杆菌(Escherichiacoli)。大肠杆菌的具体实例包括由原型野生型菌株K12菌株获得的大肠杆菌W3110菌株(ATCC27325)，和大肠杆菌MG1655(ATCC47076)。这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(地址12301ParklawnDrive,Rockville，Maryland20852，美国)获得。每个菌株赋予了唯一登记号，其列于美国典型培养物保藏中心的目录中。使用这个登记号可以订购菌株。〈1>-1.赋予L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力下文将描述给属于埃希氏菌属的细菌赋予L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力的方法。在本发明中，术语"L-苏氨酸生产能力(生产L-苏氨酸的能力)"是指当在培养基中培养本发明的细菌时，它在培养基中生产和引起L-苏氨酸积累的能力。在本发明中，术语"L-异亮氨酸生产能力(生产L-异亮氨酸的能力)"是指当在培养基中培养本发明的细菌5时，它在培养基中生产和引起L-异亮氨酸积累的能力。为了赋予L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力，可以使用通常用于培养属于埃希氏菌属或棒杆菌的L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产细菌的方法。例如，可以使用获得具有L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力的营养缺陷突变菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株的方法，产生L-苏氨酸生物合成酶或L-异亮氨酸生物合成酶活性增强的重组菌株的方法。当使用这些方法饲养L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产细菌时，可以赋予营养缺陷、类似物抗性和代谢调节突变的一个或多个性能。当产生了重组菌株，一个或多个L-苏氨酸或L-异亮氨酸生物合成酶的活性可以增强。此外，赋予营养缺陷、类似物抗性和代谢调节突变的方法可以与增强L-苏氨酸或L-异亮氨酸生物合成酶活性的方法组合。下面将举例说明通过增强L-苏氨酸或L-异亮氨酸生物合成酶活性，给属于埃希氏菌属的细菌赋予生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸能力的方法。增强酶的活性可以通过下列方法获得，例如通过将突变引入编码该酶的基因，使得该酶的细胞内活性增加，或通过利用基因重组技术。编码L-苏氨酸生物合成酶的基因包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)等等。编码各个酶的基因名称在该酶的名称后的括号中示出。可将两类或更多类这些基因引入属于埃希氏菌属的细菌中。可将编码L-苏氨酸生物合成酶的这些基因引入苏氨酸降解途径被抑制的属于埃希氏菌属的细菌。苏氨酸降解途径被抑制的细菌的实例包括TDH6菌株，它缺乏苏氨酸脱氢酶活性(日本专利公开号2001-346578)。编码L-异亮氨酸生物合成酶的基因实例包括苏氨酸脱氨酶基因(ilvA)、乙酮醇酸还原异构酶(ketol-acidreductoisomerase)基因(ilvC)、乙酰乳酸合酶基因(ilvl)、二羟酸脱水酶基因(dad)和转氨酶基因(ilvE)。编码它们各个酶的基因名称在该酶的名称后的括号中示出。可以引入两类或更多类这种基因。上述ilvA和ilvE基因包含在ilvGMEDA操纵子中(日本专利公开号2002-051787)，因此它们可以以ilvGMEDA操纵子的形式引入。此外，L-苏氨酸是L-异亮氨酸的前体。因此，为了增加L-异亮氨酸生产能力，优选增加L-苏氨酸的供应。因此，增加L-异亮氨酸生产能力可以通过增强L-苏氨酸生物合成途径和L-异亮氨酸生物合成途径，以及单独增强L-异亮氨酸的生物合成途径而获得。以这种方式赋予L-苏氨酸生产能力的细菌的实例包括日本专利公开号2002-51787和9-121872中描述的那些细菌。可以通过例如使用可在属于埃希氏菌属的细菌中自主复制的质粒扩增基因来增强由上述基因编码的任何酶的活性。此外，也可将编码生物合成酶的基因引入染色体。此外，通过将含有突变的基因引入细菌也可以增强活性，所述突变导致由基因编码的酶的细胞内活性增强。这种突变的实例包括增加基因转录量的启动子序列突变，和增加由基因编码的酶的比活性的编码区突变。用更强的表达调节序列替换染色体DNA或质粒上的表达调节序列，如启动子，也可以增强基因表达(国际专利出版物W000/18935)。这种启动子的实例包括但不限于来源于A噬菌体的lac启动子、trp启动子、trc启动子和PK启动子等等。修饰启动子的方法可以与增加基因拷贝数的方法结合。下面将举例说明被赋予L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力且可以用于本发明的属于埃希氏菌属的细菌的具体实例。然而，该细菌不限于这些实例，而是包括具有L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力的任何细菌。被赋予L-苏氨酸生产能力的细菌的实例包括6-二甲基氨基嘌呤抗性菌株(日本专利公开号5-304969)、以质粒扩增引起酶过量生产的苏氨酸生物合成酶的突变基因的菌株(日本专利公告(Publication)(Kokoku)号1-29559和日本专利公开号5-2227977)，和编码丙酮酸羧化酶的基因和编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因扩增的菌株(日本专利公开号2002-51787)。此外，也可以使用大肠杆菌VKPMB-3996(参照美国专利号5，175，107)。大肠杆菌VKPMB-3996于1987年4月7日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPMGNIIGenetika地址Dorozhnyproezd1，莫斯科113545，俄罗斯)，保藏号VKPMB_3996。VKPMB-3996菌株含有质粒pVIC40(国际专利出版物W090/04636)，它是通过将苏氨酸操纵子基因(thrABC)引入具有链霉素抗性标记基因的质粒pAYC32获得的(参考Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)。在pVIC40中，L_苏氨酸介导的由thrA编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的反馈抑制被解除。被赋予L-异亮氨酸生产能力的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括6-二甲基氨基嘌呤抗性菌株(日本专利公开号5-304969)、L-异亮氨酸异羟肟酸(hydroxamete)抗性菌株(日本专利公开号5-130882)、硫代异亮氨酸抗性菌株(日本专利公开号5-130882)、DL-乙基硫氨酸抗性菌株(日本专利公开号5-130882)、精氨酸异羟肟酸抗性菌株(日本专利公开号5-130882)，以及用质粒的扩增编码苏氨酸脱氨酶或其为L-异亮氨酸生物合成酶的乙酰羟酸合酶的基因的菌株(日本专利公开号2-458、2-42988、8-47397)。〈l>-2.本发明的苏氨酸操纵子已知在高浓度异亮氨酸或苏氨酸存在下，被称为"弱化作用"的转录调节降低苏氨酸操纵子的转录(J.Mol.Biol.(1985)183,529-541)。这个弱化作用的解除对于这些氨基酸的产量增加很重要。苏氨酸操纵子含有thrABC结构基因、该结构基因上游的天然启动子、和涉及弱化作用的区域，该区域包括前导序列和调节结构基因thrABC表达的被称为"衰减子"的特定序列。前导序列的实例包括但不限于SEQIDNO:6所示的序列。这个序列编码由SEQIDNO:2所示的21个氨基酸残基组成的前导肽，并且由编码8个苏氨酸密码子和4个异亮氨酸密码子的区域和含有终止密码子的区域组成。衰减子的实例包括但不限于具有SEQIDNO:7所示序列的区域。这个序列含有彼此互补使得它们可以在DNA分子中杂交的两个序列(J.Mol.Biol.(1985)183,529-541)。该衰减子具有类似于终止转录的终止子的结构。衰减子中的互补序列彼此相互杂交形成称为"茎_环结构"的三维结构，且转录终止于这个区域。根据下列机制在高浓度苏氨酸和异亮氨酸存在下发生由弱化作用引起的转录降低。当异亮氨酸和苏氨酸的细胞内浓度高时，培养基中苏氨酰tRNA(threoninyl-tRNA)和异亮氨酰tRNA(isoleucyl-tRNA)浓度增加。因此，tRNA-氨基酸复合物以足够用于翻译编码许多苏氨酸和异亮氨酸密码子的前导序列的量存在于细胞中。因此，前导序列被顺利地转录和翻译，且翻译终止于前导序列本身的终止密码子处。然后，衰减子内互补序列彼此杂7交形成茎_环结构，而茎_环结构发挥作用以终止转录。因此，转录难以进行至苏氨酸操纵子的结构基因，由此编码苏氨酸生物合成酶的基因表达降低。反之，当苏氨酸和异亮氨酸的细胞内浓度低时，苏氨酰tRNA和异亮氨酰tRNA的细胞内浓度降低。因此，tRNA-氨基酸复合物没有以足够用于翻译前导序列区的量存在，由此核糖体终止于前导序列中的苏氨酸密码子或异亮氨酸密码子。结果，前导序列没有被顺利翻译，而且就在前导肽的编码区中的终止密码子上游的区域和就在衰减子上游的区域形成配对以抑制衰减子内互补序列的杂交。因此，不能形成终止子，并且转录没有终止。因此，转录进行至操纵子的thrABC结构基因，导致苏氨酸操纵子的结构基因转录最高和苏氨酸生物合成酶的产量最大。当L-苏氨酸和L-异亮氨酸的产量增加时，L-苏氨酸和L-异亮氨酸的细胞内浓度变得高，而弱化作用引起的调节发挥作用以降低苏氨酸操纵子的结构基因的表达。结果，苏氨酸生物合成酶的活性降低，和因此生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的能力不能发挥到最大程度。如果弱化作用引起的这种调节可以解除，则苏氨酸操纵子将以高水平表达。此外，弱化作用的解除可以与如上所述的L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力的增强联合进一步改善生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的能力。本发明的苏氨酸操纵子是"包括涉及弱化作用的区域、对苏氨酸操纵子天然的启动子和thrABC结构基因，其中从涉及弱化作用的区域中除去了至少前导序列和衰减子的苏氨酸操纵子"。本发明中使用的术语"弱化作用(attenuation)"是指由于苏氨酸和异亮氨酸的细胞内浓度增加引起的苏氨酸操纵子结构基因的转录减少。"衰减子(attenuator)"是指具有分子中互补序列之间可以形成茎环结构以终止结构基因转录的序列的区域。来源于属于埃希氏菌属的细菌的这种序列的实例包括SEQIDN0:7所示的序列。"前导序列"是指含有大量异亮氨酸密码子和苏氨酸密码子的序列，而来源于属于埃希氏菌属的细菌的这种序列的实例包括SEQIDNO:6所示的序列，它编码SEQIDNO:2所示的含有4个异亮氨酸残基和8个苏氨酸残基的前导肽(J.Mol.Biol.(1985)183，529-541)。"天然启动子"是指苏氨酸操纵子本身的启动子，而来源于属于埃希氏菌属的细菌的这种启动子的实例包括具有SEQIDNO:1的核苷酸号71至99的序列，和/或核苷酸号104至132的序列的启动子。此夕卜，短语"thrABC结构基因"是指含有编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶(thrA)的结构基因、编码高丝氨酸激酶的结构基因(thrB)和编码苏氨酸合酶的结构基因(thrC)的多顺反子。来源于属于埃希氏菌属的细菌的thrABC结构基因的实例包括SEQIDNO:1的核苷酸号337至5020的序列。"thrABC结构基因"可以被修饰，只要它们编码具有天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶活性的蛋白。例如，像如上所述pVIC40中含有的thrABC基因，thrABC结构基因可以被修饰，使得L_苏氨酸介导的反馈抑制被消除。在本发明中，短语"涉及弱化作用的区域"是指位于启动子和thrA起始密码子之间的区域，并含有至少前导序列和衰减子。也将其称为"弱化作用区域(attenuationregion)"而且来源于属于埃希氏菌属的细菌的这种区域的实例包括具有SEQIDNO:1的核苷酸号148至310的区域(J.Mol.Biol.(1985)183，529-541)。在本发明中，短语"弱化作用的调节被解除(regulationbyattenuationisreleased)"是指由于从苏氨酸操纵子除去了至少前导序列和衰减子，衰减子变得不能形成茎环结构，因此在高浓度异亮氨酸或苏氨酸存在下，苏氨酸操纵子的结构基因表达与野生型菌株或非突变菌株相比增加。此外，短语"从涉及弱化作用的区域除去至少前导序列和衰减子的苏氨酸操纵子"是指苏氨酸操纵子具有缺乏至少前导序列和衰减子的序列。只要解除弱化作用，该序列可以是也缺乏前导序列上游的序列和/或前导序列和衰减子之间的序列的序列。例如，可以除去前导序列、衰减子、前导序列和衰减子之间的序列和前导序列5'侧(上游)的序列。前导序列和衰减子之间的序列实例包括SEQIDN0:1的序列中核苷酸号256至272的序列等等。前导序列5'侧的序列实例包括SEQIDNO:1的第168个至第189个核苷酸的序列、SEQIDN0:1的第148个至第189个核苷酸的序列，等等。只要解除弱化作用，可以进一步除去在这些序列5'侧的序列。通过修饰来源于属于埃希氏菌属的细菌的苏氨酸操纵子而获得的苏氨酸操纵子优选作为"本发明的苏氨酸操纵子"。本发明的苏氨酸操纵子的实例包括具有至少SEQIDNO:6和SEQIDN0:7的序列被缺失的SEQIDNO:1的序列及其同源物的苏氨酸操纵子。具体地说，优选其中至少核苷酸号188至310的序列被缺失的SEQIDNO:1的序列；更优选其中至少核苷酸号168至310的序列被缺失的SEQIDNO:1的序列；并特别优选至少核苷酸号148至310的序列被缺失的SEQIDNO:1的序列。用于本发明的苏氨酸操纵子同源物可以是具有序列的苏氨酸操纵子，该序列包括从SEQIDN0:1取代、缺失或插入一个或几个核苷酸，从中缺失了至少SEQIDNO:6和SEQIDNO:7序列，只要苏氨酸操纵子不被弱化作用调节并表达酶活性的thrA、B和C蛋白。在此使用的术语"几个"意图是指2至50，优选2至10，更优选2至5。此外，用于本发明的苏氨酸操纵子同源物也可以是在严格条件下可与DNA杂交的苏氨酸操纵子，该DNA具有SEQIDNO:1的核苷酸序列，从中缺失了至少SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的序列，只要苏氨酸操纵子不被弱化作用调节并表达酶活性的thrA、B和C蛋白。严格条件的实例包括例如杂交后在6(TC，lxSSC和O.1%SDS，优选O.lxSSC和0.1%SDS的盐浓度，洗涤一次，优选两次或三次。此外，上述序列可以含有在被缺失区域的位点不能起前导序列或衰减子作用的序列。不能起前导序列或衰减子作用的序列实例包括其中全部或一部分苏氨酸密码子或异亮氨酸密码子被其它氨基酸密码子或终止密码子取代的前导序列，被修饰以致不能形成茎环结构的衰减子等等。在本发明中，短语"苏氨酸操纵子的结构基因表达增加"是指由于弱化作用的解除，结构基因mRNA转录增加，并由此翻译的thrABC蛋白量增加。在本发明中，短语"由苏氨酸操纵子编码的苏氨酸生物合成酶的比活性增加"是指由于苏氨酸操纵子的结构基因表达增加，由结构基因，即thrABC基因编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)或苏氨酸合酶(thrC)的比活性与野生型菌株或亲本菌株相比增加。用作进行对比的菌株的大肠杆菌野生型菌株的实例包括大肠杆菌W3110(ATCC27325)、MG1655(ATCC47076)。含有如上所述的本发明苏氨酸操纵子的属于埃希氏菌属的细菌可以通过如下方法获得，通过定点诱变等制备含有"至少前导序列和衰减子已被除去的涉及弱化作用的区域"的DNA，并根据在此描述的方法将产生的DNA引入染色体苏氨酸操纵子的涉及弱化作用9的区域。此外，这种细菌还可以通过在属于埃希氏菌属的细菌中扩增携带本发明的苏氨酸操纵子的载体DNA来获得。可用于这个目的的载体DNA的实例包括可在属于埃希氏菌属的细菌中自主复制的质粒，如在此描述的。缺失突变的引入可以通过例如组合使用市场上可买到的遗传诱变试剂盒、限制性内切酶、PCR等等而获得。苏氨酸操纵子的涉及弱化作用的区域还可以通过如下方法修饰，使属于埃希氏菌属并具有生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸能力的细菌受到诱变处理如紫外线照射、X射线照射、射线照射(radiatione邓osure)，或用诱变剂，如N_甲基_N，-亚硝基胍(NTG)或EMS(乙基甲磺酸盐)处理、并选择弱化作用被解除的细菌。由于本发明的细菌中弱化作用的解除，苏氨酸操纵子结构基因表达的增加可以通过在高浓度L-苏氨酸或L-异亮氨酸存在下培养的细菌中测定thrABC基因编码的一种或多种苏氨酸生物合成酶的酶活性来证实。在这个方法中，优选通过测定已在L-苏氨酸和L-异亮氨酸耗尽的培养基中培养的本发明细菌中的酶活性进行比较，因为在这个环境下不发生弱化作用。高丝氨酸脱氢酶的酶活性可以通过Truffa-BachiP.，LeBrasG.，CohenG.N.，Biochem.Biophys.Acta.，128:450(1966)描述的方法来测定，而高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的酶活性可以通过ParsotC.，EMB0J.1986Nov.，5(11):3013-9描述的方法来测定。此外，细胞蛋白可以用蛋白测定法(ProteinAssay)(Bio-Rad)使用例如牛血清白蛋白作为标准来定量。当根据高丝氨酸脱氢酶(以下称为HD)的活性评价本发明的细菌时，例如，优选的是在高浓度苏氨酸或异亮氨酸存在下，显示出25nmol/min/mg细胞蛋自或更高的HD活性的细菌、在高浓度苏氨酸或异亮氨酸存在下，显示出比野生型细菌高2至3倍的HD活性的细菌、或当在高浓度苏氨酸或异亮氨酸存在下培养时，显示出不少于在缺少苏氨酸或异亮氨酸下培养的相同细菌HD活性的三分之一的细菌。然而，本发明的细菌不局限于这些。当在高浓度苏氨酸或异亮氨酸存在下培养细菌时，优选添加50mg/L或更高浓度的L-异亮氨酸或L-苏氨酸。作为用于将本发明的苏氨酸操纵子引入属于埃希氏菌属的细菌的DNA载体，优选使用质粒DNA，而对于大肠杆菌的质粒的实例包括pSTV29(TakaraBio)、RSF1010(Gene，vol.75(2)，pp.271-288,1989)、pUC19、pBR322、p丽119。此外，也可以使用噬菌体DNA载体。携带本发明苏氨酸操纵子的质粒的实例包括从质粒pVIC40(国际专利日本公开号3-501682)除去涉及弱化作用的区域而获得的质粒，pVIC40携带反馈抑制抗性类型苏氨酸操纵子并包含在L-苏氨酸生产微生物VKPMB-3996中。将本发明的苏氨酸操纵子引入细菌的染色体可以通过例如使用基因重组技术进行同源重组而获得(ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1972);Matsuyama，S.andMizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))。例如，通过用具有弱化作用解除型序列的片段取代染色体上包括野生型苏氨酸操纵子的弱化作用区的区域实现引入。在此使用的短语"弱化作用解除型序列"是指从中除去了至少前导序列和衰减子的涉及弱化作用的区域的序列。同源重组的机制如下。当将具有与染色体序列显示出同源性的序列的质粒引入细胞时，它在同源性序列的位点以某种频率引起重组，而且引入的质粒整个并入染色体。如果在同源序列的位点进一步引起重组，那么又从染色体除去质粒。然后，在引起重组的一些位点，可将引入的基因并入染色体并可将原来的染色体的基因与质粒一起从染色体切除。通过选择这种菌株，可以获得染色体上的野生型弱化作用区被具有弱化作用解除型序列的片段取代的菌株。已经建立了这种基于同源重组的基因重组方法，并且可以使用利用线状DNA、温度敏感的质粒等等的方法。可以在属于埃希氏菌属的细菌中起作用的温度敏感质粒的实例包括pMAN997(国际专利出版物W099/03998)、pMAN031(Yasueda，H.etal.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，36,211(1991))、pHSG415，pHSG422(Hashimoto,Gotoh，T.etal，16,227-235(1981))等等。耙基因的取代可以通过用Southern印迹或PCR分析染色体上的基因来确认。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1.21(1989)中描述了本发明中使用的制备基因、杂交、PCR、制备质粒DNA、DNA的消化和连接和转化的方法。当引入本发明的苏氨酸操纵子时，通过将多个操纵子引入染色体，可以增加苏氨酸操纵子的拷贝数。例如，可以使用Mu噬菌体(日本专利公开号2-109985)、转座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Techno1.，1-147)等将本发明的苏氨酸操纵子引入染色体。〈2>生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的方法L-苏氨酸或L-异亮氨酸可以通过下述方法生产，在培养基中培养属于埃希氏菌属并且具有生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸能力的细菌，其中通过除去弱化作用区或通过将突变引入如上所述的区域，苏氨酸操纵子结构基因的表达增加，从而在培养基中生产和引起L-苏氨酸或L-异亮氨酸积累，并从培养基中收集L-苏氨酸或L-异亮氨酸。L-苏氨酸和L-异亮氨酸可以同时生产。可以使用本发明的细菌以常规方式，用含有碳源、氮源、无机盐和，如果需要的话，其它有机痕量营养素的典型培养基，生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸。可以使用合成培养基和/或天然培养基。任何碳源和氮源可以用于培养基，只要它们可以被待培养的菌株利用。作为碳源，可以使用糖如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解产物和糖蜜，和有机酸类如乙酸和柠檬酸和醇如乙醇可以单独或组合使用。氨，铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵，硝酸盐等等可以用作氮源。氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、含有这些的物质如蛋白胨、酪蛋白氨基酸和大豆蛋白的分解产物等等可以用作痕量有机营养物。当使用生长必需的氨基酸等的营养缺陷突变菌株时，优选补充需要的营养物。尤其是，显示出异亮氨酸营养缺陷的生产苏氨酸的细菌期望补充生长所需要的异亮氨酸进行培养。磷酸盐、镁盐、*丐盐、铁盐、锰盐等等可以用作微量有机营养素。培养优选在需氧条件下、在25t:至45t:和pH5至9进行。当培养过程中pH值降低时，可以添加碳酸钙，或可以用碱性物质如氨气来中和培养基。在这种条件下，培养优选大约10至120小时后，显著量的L-苏氨酸或L-异亮氨酸在培养基中积累。培养后，可以用任何常规收集方法完成从培养基中收集积累的L-苏氨酸或L-异亮氨酸。例如，通过离心从培养基中除去细胞和随后通过浓縮结晶可以收集氨基酸。11实施例将参考下列非限制性实施例更具体地解释本发明。实施例1:含有用于扩增除去了衰减子的苏氨酸操纵子的质粒的菌株的构建和评估〈1>除去衰减子的质粒的制备用限制性内切酶HindiII和BamHI消化可在大肠杆菌中自主复制并且携带苏氨酸操纵子的质粒pVIC40(国际专利日本公开号3-501682)以获得含有该苏氨酸操纵子的大约6kbp的片段。然后，用限制性内切酶HindIII和BamHI消化pBR322(购自TakaraBio)，并将上述含有苏氨酸操纵子的大约6kbp的片段插入消化的pBR322中以获得pBRT3240A。用Mlul处理此pBRT3240A，并将具有限制性内切酶Xbal识别位点、通过将SEQIDNO:8所示的寡核苷酸与其互补链杂交获得的接头插入pBRT3240A的MluI位点以获得质粒pBR3240A。然后，使用pVIC40作为模板通过PCR扩增含有苏氨酸启动子和编码高丝氨酸脱氢酶的thrA基因的片段。将获得的片段插入pHSG399(购自TakaraBio)的HincII位点以获得pHSGthrA。将用限制性内切酶Xbal和SnaBI消化pBRT3240A获得的片段和用Xbal和SnaBI消化pHSGthrA获得的编码thrA区域的片段连接以获得质粒pBRAT3。然后，将通过用Pstl和BamHI处理pBRAT3获得的含有thrABC的片段引入pVIC40的用Pstl-和BamHI消化的片段以获得质粒PVICAT3。质粒pVICAT3可在大肠杆菌中自主复制并且具有包括涉及弱化作用的区域的苏氨酸操纵子，从中仅仅除去了衰减子(图1)。根据C.T.Chung(C.T.Chung，S.L.Niemela，R.H.Miller，Proc.Natl.Acad.Sci.(1989)Vol.86，PP.2172-2175)的方法，使用如上所述质粒pVICAT3和具有野生型衰减子的对照质粒PVIC40转化高丝氨酸脱氢酶缺陷型大肠杆菌Gif33菌株(AK-I，ThezeJ.，Saint-GironsI.，J.Bacteriol.，118(3):990(1974))。选择pVICAT3扩增的转化体和对照野生型苏氨酸操纵子扩增的转化体的链霉素抗性。通过引入pVICAT3获得的转化体命名为Gif33/pVICAT3，而通过引入pVIC40获得的转化体命名为Gif33/pVIC40。从如上所述选择的Gif33/pVICAT和Gif33/pVIC40菌株提取质粒，证实目标质粒分别在每个菌株中扩增。〈2〉培养含有用于扩增除去了衰减子的苏氨酸操纵子的质粒的菌株和高丝氨酸脱氢酶活性的测定如下所述分别培养扩增含有无衰减子的苏氨酸操纵子的质粒pVICAT3的转化体Gif33/pVICAT3和扩增含有野生型衰减子的pVIC40的转化体Gif33/pVIC40，并在每个菌株中测定高丝氨酸脱氢酶(自此以后称为HD)活性。将在含有20iig/ml链霉素的LB培养基中预培养的Gif33/pVIC40和Gif33/pVICAT3的细胞分别在每1L纯水含有40g葡萄糖、16g硫酸铵、lg磷酸二氢钾、0.Olg七水合硫酸亚铁、0.Olg四水合氯化锰、2g酵母提取物、lg七水合硫酸镁、50mg或250mg异亮氨酸和30g碳酸钙的生产培养基中，在37t:以大约115rpm振荡培养22至27小时。培养完成后，从培养基中收集细胞，并根据Truffa-BachiP.，LeBrasG.，CohenG.N.，Biochem.Biophys.Acta.，128:450(1966)中描述的方法测定HD活性，其中将粗酶溶液添加至含有200mMTris-HCl(pH9.Q)、500mMKCl、25mML-高丝氨酸和0.8mMNADP的反应混合物，并测定在340nm的吸光度增加。作为对照，使用含水而不是高丝氨酸的反应溶液。如下制备粗酶溶液，从上述培养基通过离心分离细胞，用0.1MKP缓冲液(0.01MDTT、pH7.0)洗涤细胞，然后通过超声处理破碎细胞，然后离心除去未破碎的细胞。粗酶溶液中的蛋白用蛋白测定法(Bio-Rad)使用牛血清白蛋白作为标准来定量。结果示于表l。[0100]表1[0101]<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果，观察到菌株Gif33/pVICAT和Gif33/pVIC40之间HD酶活性没有差异。这个结果证明仅仅作为除去衰减子的结果苏氨酸操纵子的表达不增加。实施例2:具有去除包括衰减子和前导序列的不同序列区段的苏氨酸操纵子的菌株的构建和评估〈1>除去衰减子和前导序列的质粒的构建如上所述，作为除去衰减子的结果，由添加异亮氨酸所引起的弱化作用不能解除。因此，尝试了不仅除去衰减子，而且除去前导序列。首先，使用pVIC40作为模板进行PCR获得具有启动子和随后区域的片段。使用与位于启动子上游区的序列互补的SEQIDNO:9所示的寡核苷酸和具有SEQIDN0S:10至14的序列的寡核苷酸中的任一种进行PCR。以常规方式纯化每一获得的DNA片段并与已经用Hindi消化的pHSG398(TakaraBio)连接。因此，获得了含有用寡核苷酸SEQIDN0S:9和10扩增的片段的质粒pHPBthr、含有用寡核苷酸SEQIDNOS:9和11扩增的片段的质粒pHPCthr、含有用寡核苷酸SEQIDNOS:9和12扩增的片段的质粒pHPDthr、含有用寡核苷酸SEQIDNOS:9和13扩增的片段的质粒pHPEthr和含有用寡核苷酸SEQIDNOS:9和14扩增的片段的质粒pHPFthr。然后，用限制性内切酶HindIII和BamHI消化这五个质粒，并将获得的含有thrA上游区域的片段引入HindIII-BamHI消化的pBR322(NipponGene)获得质粒pBRBthr、pBRCthr、pBRDthr、pBREthr禾口pBRFthr。然后，用XbaI和BamHI消化用于扩增缺乏衰减子的苏氨酸操纵子的上述质粒pBRAT3，并将获得的含有thrABC的片段引入Xbal-BamHI消化的pBRBthr、pBRCthr、pBRDthr、pBREthr和p服Fthr获得质粒pBAT3、pCAT3、pDAT3、pEAT3和pFAT3，每个质粒携带不同区段的序列包括前导序列和衰减子被除去的苏氨酸操纵子。用Pstl和BamHI消化的质粒pBAT3、pCAT3、pDAT3、pEAT3和pFAT3获得的片段中的每个被引入pVIC40的Pstl-BamHI位点，产生pBAT3、pCAT3、pDAT3、pEAT3和pFAT3(图2)。获得的质粒pBAT3、pCAT3、pDAT3、pEAT3和pFAT3可在大肠杆菌中自主复制，并且弱化作用区的衰减子和前导序列被完全除去，而前导序列上游的序列以不同程度被除去。也就是说，pBAT3中具有SEQIDN0:1的核苷酸号188至310的序列被除去，pCAT3中具有核苷酸序列号178至310的序列被除去，pDAT3中具有核苷酸序列号168至310的序列被除去，pEAT3中具有核苷酸序列号158至310的序列被除去，和pFAT3中具有核苷酸序列号148至310的序列被除去。[0107]〈2>引入除去弱化作用区的每个质粒的菌株的构建和评估对于一些获得的质粒，检测除去前导序列和衰减子的有效性。将缺乏不同长度的包括前导序列和衰减子的序列的每个质粒pDAT3和pFAT3和对照质粒pVIC40分别引入HD有缺陷的Gif33菌株，并选择链霉素抗性的转化体。引入质粒pDAT3或pFAT3的菌株分别命名为Gif33/pDAT3或Gif33/pFAT3。从Gif33/pDAT3、Gif33/pFAT3和对照Gif33/pVIC40提取质粒，并证实目标质粒在每个菌株中扩增。用实施例1的〈2〉中描述的方法培养这些转化体，并测定HD活性。结果示于表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>Gif33/pVIC40菌株中HD活性降低至异亮氨酸存在下的大约六分之一，该菌株含有扩增的含野生型弱化作用区的苏氨酸操纵子。在具有扩增的缺乏衰减子和前导序列的苏氨酸操纵子的Gif33/pDAT3和Gif33/pFAT3菌株中，在存在异亮氨酸的菌株中，HD活性不降低。从实施例1和实施例2的结果可知，含有用于扩增缺乏衰减子以及前导序列的苏氨酸操纵子的质粒的菌株Gif33/pDAT3和Gif33/pFAT3不受由于添加异亮氨酸所引起的弱化作用的影响。在缺少异亮氨酸时，Gif33/pDAT3菌株的HD活性是17.7nmol/min/mg，它低于对照Gif33/pVIC40菌株的HD活性(20.Onmol/min/mg)。然而，认为这应归于培养过程中质粒的消除(curing)。然后，用携带含弱化作用解除序列的苏氨酸操纵子的pBAT3、pCAT3、pDAT3、pEAT3、pFAT3中的每个质粒或用对照质粒pVIC40转化通过从生产L-苏氨酸的VKPMB-3996中消除pVIC40而获得的TDH6菌株(日本专利号3239903)，并选择链霉素抗性的转化体。TDH6菌株已通过插入转座子Tn5(日本专利公开号2001-346578)而被修饰，以致它缺乏苏氨酸脱氢酶活性。TDH6菌株于1985年8月8日保藏在国立工业微生物的遗传和选择研究所(ResearchInstituteofGeneticsandSelectionofIndustrialMicroorganism)(VNIIGenetika，地址Dorozhnyproezd1，莫斯科113545，俄罗斯)，保藏号VKPMB_3420。[0114]引入质粒pBAT3、pCAT3、pDAT3、pEAT3、pFAT3或pVIC40的菌株分别命名为TDH6/pBAT3菌株、TD朋/pCAT3菌株、TD朋/pDAT3菌株、TD朋/pEAT3菌株、TD朋/pFAT3菌株或TDH6/pVIC40菌株。从如上所述选择的转化体提取质粒并证实目标质粒在每个菌株中扩增。用实施例1的〈2>描述的方法培养这些转化体，并在异亮氨酸存在或缺少的条件下测定它们的L-苏氨酸生产能力。培养完成后，用液相色谱法对适当稀释的培养液分析每个培养液中积累的L-苏氨酸量。结果示于表3。对于每个转化体，生产的L-苏氨酸量以相对于缺少异亮氨酸的条件下生产的L-苏氨酸量的相对值表示，后者作为100。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>而与缺少异亮氨酸的条件下TDH6/pVIC40菌株中获得的产量相比，在L-异亮氨酸存在下苏氨酸的产量降低至55%，在培养基中存在异亮氨酸的条件下TDH6/pDAT3菌株、TDH6/pEAT3菌株和TDH6/pFAT3菌株得到的产量分别是76%、320%和79%。也就是说在异亮氨酸存在下生产的L-苏氨酸的量略微降低或甚至增加。因此，证实了具有缺乏弱化作用区的衰减子和前导序列的序列的苏氨酸操纵子不发生弱化作用，而且在高浓度L-异亮氨酸存在下L-苏氨酸的产量提高。如表3所示，对于TDH6/pCAT3菌株，在L-异亮氨酸存在下生产的L-苏氨酸的量相对于缺少异亮氨酸时生产的量是39%，低于对照菌株TDH6/pVIC40的值。然而，认为这个较低值是质粒消除的结果，而且由于弱化作用的消除，这个菌株中生产的L-苏氨酸实际上增加。实施例3:从染色体的苏氨酸操纵子除去衰减子和前导序列的菌株的构建和该菌株苏氨酸产量的评估〈1〉引入thrC基因的TDH6菌株的构建将来源于质粒pDAT3的弱化作用解除型序列引入染色体，并测定其影响。TDH6菌株-L-苏氨酸生产菌株，缺乏编码苏氨酸合酶的thrC基因。因此，使用大肠杆菌野生型W3110菌株(ATCC27325)作为供体细菌通过采用Pl转导的常规方法获得具有野生型thrC的TDH6菌株。具体地说，如下获得这个菌株。将大肠杆菌W3110菌株和Pl噬菌体稀释物的培养物一起添加至维持在某一温度的软琼脂培养基，将培养基在LB平皿中铺开。培养基固化后，细胞在37t:培养6至7小时以允许噬菌体形成噬菌斑，然后收集噬菌体。将收集的噬菌体添加至受体TDH6菌株，在2.5mMCaCl2存在下将细胞在37。C静置大约20分钟以允许噬菌体的吸附，然后与10mM拧檬酸钠在37t:反应大约30分钟以终止吸附反应。缺乏thrC的TDH6菌株不能在无苏氨酸的基本培养基中生长，而通过Pl转导引入thrC的菌株可以在基本培养基中生长。然后，将上述反应溶液接种入每1L纯水含有0.5g葡萄糖、2mM硫酸镁、3g磷酸二氢钾、0.5g氯化钠、lg氯化铵和6g磷酸氢二钠(disodiumphosphate)的基本培养基。将来自在基本培养基中生长24小时后的菌落的菌株选为引入thrC的菌株并命名为W13。〈2〉将具有弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子引入染色体的质粒的构建用HindIII和PvuII消化携带缺乏弱化作用区的衰减子和前导序列(缺乏具有SEQIDNO:1中的核苷酸号168至310的区域)的苏氨酸操纵子的质粒pDAT3，并将获得的含有启动子、截短的弱化作用区和thrA的片段引入HindIII-HincII消化的质粒pUC18(购自TakaraBio)以构建质粒pUC18D。然后，为了进行同源重组，用PCR克隆染色体苏氨酸操纵子的启动子的5'上游序列，如图3所示。具体地说，克隆具有GENBANK登记号AE000510的序列中的核苷酸号4454至6127的DNA。作为5'引物，使用相应于覆盖第4458位A和第4469位C的区域，并用T取代第4458位A和用T取代第4469位C用于引入HindIII和EcoRI位点的寡核苷酸。作为3'引物，使用与GENBANK登记号AE000510的序列中的HindIII位点(核苷酸号6122至6127)3'侧的区域互补的寡核苷酸。通过使用这些引物，获得苏氨酸操纵子启动子上游区域的片段。用HindlII消化这个片段并将其插入pUC18D的HindlII位点以构建质粒pUC18DD。然后，构建将突变引入染色体的温度敏感质粒。用HindIII和Pstl消化pBR322(购自NipponGene)，并将获得的片段引入pMAN031(Yasueda，H.etal.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，36,211(1991))的HindIII位点和PstI位点之间，以构建温度敏感的pTSl。然后，构建具有取代的抗生素抗性基因的质粒pTS2。也就是说，将四环素GenBlock(购自Amersham)插入pTSl的氨苄青霉素抗性基因内的Seal位点以构建温度敏感质粒pTS2。然后，如下构建将具有弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子引入染色体的温度敏感质粒。用EcoRI消化pUC18DD，获得的具有包含苏氨酸操纵子弱化作用区上游和下游的序16列的片段引入pTS2的EcoRI位点以构建用于同源重组的质粒pTS2DD。〈3〉染色体上具有含弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子的菌株的构建将温度敏感质粒pTS2DD引入W13菌株，即引入thrC的TDH6菌株。用温度敏感质粒。15200转化￥13菌株，在301:丄8+四环素平皿上选择菌落。将选择的克隆在3(TC培养过夜，并将培养液稀释103倍并接种到LB+四环素平皿上，在42t:选择菌落。将选择的克隆铺在LB+四环素平皿上，3(TC培养，然后转移到液体培养基中并在42t:摇动培养4至5小时。适当地稀释培养液并接种在LB平皿上。选择获得的菌落中的几百个菌落并接种到LB平皿以及1^+四环素平皿上，并选择四环素敏感的菌株。对几个四环素敏感的菌株进行菌落PCR以证实是否已经引入了具有弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子。用这种方法构建了W13112菌株，它是通过将thrC和苏氨酸操纵子的弱化作用解除型引入TDH6获得的菌株。在上述操作中，也获得了染色体上具有野生型弱化作用区的Wl325菌株，除了引入thrC以外。〈4>由染色体上引入具有弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子的菌株产生的L-苏氨酸的评估通过实施例1的〈2>中描述的方法分别培养缺乏染色体苏氨酸操纵子的弱化作用区中的前导序列和衰减子的W13112菌株，和具有含野生型弱化作用区的苏氨酸操纵子的对照W1325菌株。用实施例2的〈2〉描述的方法测定产生的L-苏氨酸的浓度。对于每个转化体，在异亮氨酸存在下生产的L-苏氨酸量以相对于缺少异亮氨酸下生产的L-苏氨酸量的相对值表示，后者作为100。结果示于表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>[0136]在染色体的苏氨酸操纵子具有弱化作用解除型序列的W13112菌株中，在异亮氨酸存在下积累的L-苏氨酸的量与对照菌株相比较要高，因此证实了在具有含弱化作用解除型序列的染色体苏氨酸操纵子的菌株中，L-苏氨酸产量几乎不受添加到培养基中的异亮氨酸的影响。实施例4:染色体上引入具有弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子的菌株和也具有含野生型苏氨酸操纵子的质粒的菌株的构建和评估如实施例3所示，在染色体的苏氨酸操纵子被弱化作用解除型序列取代的菌株中，甚至在高浓度异亮氨酸存在下，积累的L-苏氨酸量亦没有降低。然后，为了证实从染色体的苏氨酸操纵子除去弱化作用区的作用，将含有具有野生型弱化作用区的苏氨酸操纵子的质粒pVIC40引入W13112菌株。[0139]用pVIC40转化W13112,并选择链霉素抗性的转化体。将选择作为pVIC40扩增的菌株的转化体命名为W13112/pVIC40，并提取质粒。证实了目标质粒在菌株中扩增。根据实施例1的〈2>描述的方法，测定W13112/pVIC40菌株的L-苏氨酸生产能力并与含有野生型染色体苏氨酸操纵子的对照TDH6/pVIC40菌株的能力相比较。对于每个转化体，生产的L-苏氨酸量以相对于缺少异亮氨酸的条件下生产的L-苏氨酸量的相对值表示，后者作为100。结果示于表5。表5菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>[0143]在具有染色体苏氨酸操纵子的野生型弱化作用区的TDH6/pVIC40菌株中，随异亮氨酸的加入，生产的苏氨酸的量显著降低。反之，在染色体苏氨酸操纵子是弱化作用解除型的W13112/pVIC40菌株中，在异亮氨酸存在下生产的苏氨酸量的减少与TDH6/pVIC40菌株相比不如其显著。实施例5:染色体上引入具有弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子的菌株的L-异亮氨酸生产能力的测定〈1>来自W13112/pVIC40菌株的L-异亮氨酸生产菌株的建立及其评估L-异亮氨酸是通过L-苏氨酸作为前体产生的，因此L-异亮氨酸生产菌株可以通过增强L-苏氨酸生产细菌中的L-异亮氨酸生物合成酶活性而获得(日本专利公开号09-121872和2002-051787)。因此，为了增强L-异亮氨酸生物合成酶的活性，将用于扩增L-异亮氨酸生物合成酶基因的质粒p丽D5分别引入实施例5中使用的TDH6/pVIC40菌株和W13112/pVIC40菌株。质粒p丽D5含有异亮氨酸操纵子，其中异亮氨酸操纵子本身弱化作用所需的区域被缺失(日本专利公开号09-121872)。通过如实施例5所述的转化将质粒p丽D5引入TDH6/pVIC40和W13112/pVIC40中的每一个，并选择氨节青霉素抗性的转化体。将具有P丽D5的TDH6/pVIC40菌株命名为TDH6/pVIC40p丽D5，并将具有p丽D5的W13112/pVIC40菌株命名为W13112/pVIC40p丽D5。〈2>染色体上引入具有弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子的菌株的L-异亮氨酸生产能力的评估从TDH6/pVIC40p丽D5菌株和W13112/pVIC40p丽D5菌株提取质粒并证实目标质粒在每个菌株中扩增。将在含有20iig/ml链霉素的LB培养基中预培养的TDH6/pVIC40p丽D5菌株和W13112/pVIC40p丽D5菌株的细胞分别在每1L纯水含有40g葡萄糖、16g硫酸铵、lg磷酸二氢钾、0.Olg七水合硫酸亚铁、0.Olg四水合氯化锰、2g酵母提取物、lg七水合硫酸镁和30g碳酸钙的L-异亮氨酸生产培养基(用K0H调节至pH7.0)中在37t:培养22至27小时，以大约115转/分摇动。培养完成后，用液相色谱法对适当稀释的培养分析每个培养液中积累的L-苏氨酸量。结果示于表6。由W13112/pVIC40p丽D5菌株获得的L-异亮氨酸的产量与对照TDH6/pVIC40p丽D5菌株比较提高了，W13112/pVIC40p丽D5菌株是染色体上引入具有弱化作用解除型序列的苏氨酸操纵子的菌株，因此证实了从苏氨酸操纵子除去弱化作用区对于L-异亮氨酸生产也有效。表6菌株产生的L-异亮氨酸(g/L)TDH6/pVIC40pMWD510.1W13112/pVIC40p丽D511.3工业实用性根据本发明，使用属于埃希氏菌属的细菌在发酵过程中可以提高L-苏氨酸和/或L-异亮氨酸的产量。此外，本发明提供了培养新的L-苏氨酸和/或L-异亮氨酸生产细菌的方法。序列表〈110〉味之素株式会社(AjinomotoCo.，Inc.)〈120〉通过发酵生产L-氨基酸的方法〈130〉C3120PC4203〈150>JP2003-391826〈151>2003-11-21〈160>14〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>5040〈212>DNA〈213>大肠杆菌(Escherichiacoli)〈220〉〈221〉启动子〈222>(71).(99)〈223〉因子sigma70;预测第106位为+1起始〈220〉〈221〉启动子〈222〉(104)(132)[0175]〈223〉因子sigma70;预测第139位为+1起始〈220〉〈221〉启动子〈222〉(139).(219)〈223〉因子sigma70;预测第219位为+1起始〈220〉〈221>CDS〈222〉(190).(255)〈223〉前导肽〈220〉〈221〉衰减子〈222〉(273).(307)〈223〉〈220〉〈221>CDS〈222〉(337)(2799)〈223>thrA〈220〉〈221>CDS〈222〉(2801)(3733)〈223>thrB〈220〉〈221>CDS〈222〉(3734)(5020)〈223>thrC〈400〉1agcttttcattctgactgcaacgggcaatatgtctctgtgtggattaaaaaaagagtgtc60tgatagcagcttctgaactggttacctgccgtgagtaaattaaaattttattgacttagg120tcactaaatactttaaccaatetaggcatagcgcacagacagataaaaattacagagtac180acaacatccatgaaacgcattageaccaccattaccaccaccateaccatt231MetLysArglieSerThrThrlieThrThrThrlieThrlie1510accseaggt朋cggtgcgggctgacgegtecaggaaacacagaa朋朋gcccgc285ThrThrGlyAsnGlyAlaGly1520acctgacagtgcgggctttttttttcgaccaaaggtaacgaggtaacaaccatgcga342MetArggtgttgaagttcggcggtacateagtggcaaatgcagaacgttttctg390ValLeuLysPheGlyGlyThrSerValAlaAsnAlaGluArgPheLeu说明书19/34页[0214]253035cgtgttgccgatattctgg朋age朋tgcc￡lggCElggggCElggtggcc438ArgValAlaAsplieLeuGluSerAsnAlaArgGinGlyGinValAla404550553CCgtcetctctgcccccgccate3CC朋cC3CctggtggcgEltg486ThrValLeuSerAlaProAlaLyslieThrAsnHisLeuValAlaMet606570attg朋3CCattageggccaggatgetttaccc朋tateagegat534lieGluLysThrlieSerGlyGinAspAlaLeuProAsnlieSerAsp758085gccg朋cgtatttttgccg朋cttttg3Cggg￡ietcgccgccgccCElg582AlaGluArgliePheAlaGluLeuLeuThrGlyLeuAlaAlaAlaGin9095100ccggggttcccgctggcgc朋ttgaaaactttcgtcgatCElgg朋ttt630ProGlyPheProLeuAlaGinLeuLysThrPheValAspGinGluPhe105110115gccc朋atecatgtcctgcatggcattElgtttgttggggCElgtgc678AlaGinlieLysHisValLeuHisGlylieSerLeuLeuGlyGinCys120125130135ccggatageate朋cgetgcgctgatttgccgtggcgagEltgteg726ProAspSerlieAsnAlaAlaLeulieCysArgGlyGluLysMetSer140145150ategccattEltggccggcgt￡lttag朋gcgcgcggtC3Cgttact774lieAlalieMetAlaGlyValLeuGluAlaArgGlyHisAsnValThr155160165gttategatccggtcg朋ctgctggCElgtggggcattacetcg朋822VallieAspProValGluLysLeuLeuAlaValGlyHisTyrLeuGlu170175180tct3CCgtcgatattgetgagtec3CCcgccgtattgcggCElagecgc870SerThrValAsplieAlaGluSerThrArgArglieAlaAlaSerArg185190195attccggetgatC3CEltggtgctgEltggCElggtttc3CCgccggt朋t918lieProAlaAspHisMetValLeuMetAlaGlyPheThrAlaGlyAsn200205210215g朋aaaggcg朋ctggtggtgcttcgc朋cggttecg￡lCtactct966GluLysGlyGluLeuValValLeuGlyArgAsnGlySerAspTyrSer220225230getgcggtgctggetgcctgtcgcgccgattgttgcgagatttgg1014AlaAlaValLeuAlaAlaCysLeuArgAlaAspCysCysGlulieTrp21[0253]2352402453Cgg￡lCgttg￡lCggggtctat3CCtgcgacccgcgtcaggtgcccgat1062ThrAspValAspGlyValTyrThrCysAspProArgGinValProAsp250255260gcg￡iggttgttg朋gtegEltgtectaccaggaagcgatggagctttec1110AlaArgLeuLeuLysSerMetSerTyrGinGluAlaMetGluLeuSer265270275tacttcggcgetgttcttC3Cccccgcaccattacccccategcc1158TyrPheGlyAlaLysValLeuHisProArgThrlieThrProlieAla280285290295CElgttcCElgateccttgcctgatt3朋朋t3CCgga朋tcctc朋gca1206GinPheGinlieProCysLeulieLysAsnThrGlyAsnProGinAla300305310CC3ggteegetcattggtgccagecgtgatg朋gacg朋tteccggtc1254ProGlyThrLeulieGlyAlaSerArgAspGluAspGluLeuProVal315320325朋gggcatttec朋tctg朋t朋catggcaatgttcagegtttctggt1302LysGlylieSerAsnLeuAsnAsnMetAlaMetPheSerValSerGly330335340ccggggEltgaaagggEltggtcggcatggcggcgcgcgtctttgcagcg1350ProGlyMetLysGlyMetValGlyMetAlaAlaArgValPheAlaAla345350355Eltgteacgcgcccgtatttecgtggtgctgattacgcaateatcttec1398MetSerArgAlaArglieSerValValLeulieThrGinSerSerSer360365370375g朋tacageateElgtttctgcgttccacaaagegactgtgtgcgaget1446GluTVrSerlieSerPheCysValProGinSerAspCysValArgAla38038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MetValLeuMetAlaGlyPheThrAla180185190GlyAsnGluLysGlyGluLeuValValLeuGlyArgAsnGlySerAsp195200205TyrSerAlaAlaValLeuAlaAlaCysLeuArgAlaAspCysCysGlu210215220lieTrpThrAspValAspGlyValTyrThrCysAspProArgGinVal225230235240ProAspAlaArgLeuLeuLysSerMetSerTyrGinGluAlaMetGlu245250255LeuSerTyrPheGlyAlaLysValLeuHisProArgThrlieThrPro260265270lieAlaGinPheGinlieProCysLeulieLysAsnThrGlyAsnPro275280285GinAlaProGlyThrLeulieGlyAlaSerArgAspGluAspGluLeu29029530029[0565]ProValLysGlylieSerAsnLeuAsnAsnMetAlaMetPheSerVal305310315320SerGlyProGlyMetLysGlyMetValGlyMetAlaAlaArgValPhe325330335AlaAlaMetSerArgAlaArglieSerValValLeulieThrGinSer340345350SerSerGluTyrSerlieSerPheCysValProGinSerAspCysVal355360365ArgAlaGluArgAlaMetGinGluGluPheTyrLeuGluLeuLysGlu370375380GlyLeuLeuGluProLeuAlaValThrGluArgLeuAlalielieSer385390395400ValValGlyAspGlyMetArgThrLeuArgGlylieSerAlaLysPhe405410415PheAlaAlaLeuAlaArgAlaAsnlieAsnlieValAlalieAlaGin420425430GlySerSerGluArgSerlieSerValValValAsnAsnAspAspAla435440445ThrThrGlyValArgValThrHisGinMetLeuPheAsnThrAspGin450455460VallieGluValPheVallieGlyValGlyGlyValGlyGlyAlaLeu465470475■LeuGluGinLeuLysArgGinGinSerTrpLeuLysAsnLysHislie485490495AspLeuArgValCysGlyValAlaAsnSerLysAlaLeuLeuThrAsn500505510ValHisGlyLeuAsnLeuGluAsnTrpGinGluGluLeuAlaGinAla515520525LysGluProPheAsnLeuGlyArgLeulieArgLeuValLysGluTyr530535540HisLeuLeuAsnProVallieValAspCysThrSerSerGinAlaVal545550555560AlaAspGinTyrAlaAspPheLeuArgGluGlyPheHisValValThr565570575ProAsnLysLysAlaAsnThrSerSerMetAspTyrTyrHisGinLeu580585590ArgTyrAlaAlaGluLysSerArgArgLysPheLeuTyrAspThrAsn595600605ValGlyAlaGlyLeuProVallieGluAsnLeuGinAsnLeuLeuAsn<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>[0682]151015GinAlaValThrGinGlyLeuGlyLysAsnGinGlyLeuPhePhePro202530HisAspLeuProGluPheSerLeuThrGlulieAspGluMetLeuLys354045LeuAspPheValThrArgSerAlaLyslieLeuSerAlaPhelieGly505560AspGlulieProGinGlulieLeuGluGluArgValArgAlaAlaPhe65707580AlaPheProAlaProValAlaAsnValGluSerAspValGlyCysLeu859095GluLeuPheHisGlyProThrLeuAlaPheLysAspPheGlyGlyArg100105110PheMetAlaGinMetLeuThrHislieAlaGlyAspLysProValThr115120125lieLeuThrAlaThrSerGlyAspThrGlyAlaAlaValAlaHisAla130135140PheTyrGlyLeuProAsnValLysValVallieLeuTyrProArgGly145150155160LyslieSerProLeuGinGluLysLeuPheCysThrLeuGlyGlyAsn165170175lieGluThrValAlalieAspGlyAspPheAspAlaCysGinAlaLeu180185190ValLysGinAlaPheAspAspGluGluLeuLysValAlaLeuGlyLeu195200205AsnSerAlaAsnSerlieAsnlieSerArgLeuLeuAlaGinlieCys210215220TyrTyrPheGluAlaValAlaGinLeuProGinGluThrArgAsnGin225230235240LeuValyalSerValProSerGlyAsnPheGlyAspLeuThrAlaGly245250255LeuLeuAlaLysSerLeuGlyLeuProValLysArgPhelieAlaAla260265270ThrAsnValAsnAspThrValProArgPheLeuHisAspGlyGinTrp275280285SerProLysAlaThrGinAlaThrLeuSerAsnAlaMetAspValSer290295300GinProAsnAsnTrpProArgValGluGluLeuPheArgArgLyslie305310315320[0721]TrpGinLeuLysGluLeuGlyTyrAlaAlaValAspAspGluThrThr325330335GinGinThrMetArgGluLeuLysGluLeuGlyTyrThrSerGluPro340345350HisAlaAlaValAlaTyrArgAlaLeuArgAspGinLeuAsnProGly355360365GluTyrGlyLeuPheLeuGlyThrAlaHisProAlaLysPheLysGlu370375380SerValGluAlalieLeuGlyGluThrLeuAspLeuProLysGluLeu385390395400AlaGluArgAlaAspLeuProLeuLeuSerHisAsnLeuProAlaAsp405410415PheAlaAlaLeuArgLysLeuMetMetAsnHisGin420425〈210>6〈211>66〈212>DNA〈213〉大肠杆菌〈220〉〈221>〈222〉(1).(66)〈223〉前导序列〈400>63tg朋3CgC3-ttagcaccaccattaccaccaccatcaccattaccacaggtaacggtgcg60[0745]ggctga66〈210>7<211〉34〈212>DNA〈213〉大肠杆菌〈220〉〈221〉〈222>(1)..(34)〈223>衰减子〈400>7gcacctgacagtgcgggctttttt34〈210>8〈211>12〈212>DNA〈213〉人工序列[0760]〈220〉〈223〉人工序列的说明连接thrA和衰减子的Xbal接头〈400>8gactctegagtc<210>9〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的说明扩增thr操纵子下大肠杆菌前导序列的引物〈400〉9tggttacctgccgtgagtaaat22〈210>10〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的说明扩增thr操纵子下大肠杆菌前导序列的引物〈400>10atgttgtgtactctgtaatttttatc26〈210>11〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>人工序列的说明扩增thr操纵子下大肠杆菌前导序列的引物〈400>11ctctgtaatttttatctgtctgtgc25〈210>12〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的说明扩增thr操纵子下大肠杆菌前导序列的引物〈400>12tttatctgtctgtgcgctatgcc23〈210〉13〈211>21〈212>DNA35[0799]〈213〉人工序列〈220〉〈223>人工序列的说明扩增thr操纵子下大肠杆菌前导序列的引物〈400〉13tgtgcgctatgcctatattgg21〈210〉14<211〉15〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的说明扩增thr操纵子下大肠杆菌前导序列的引物〈400〉14gcctatattggttaa1536权利要求属于埃希氏菌属的细菌，其具有生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸能力，其中所述细菌具有苏氨酸操纵子，并且其中所述操纵子的表达由天然启动子指导，而且其中所述苏氨酸操纵子的前导序列和衰减子具有选自SEQIDNO1的核苷酸148-310和核苷酸168-310的缺失，使得弱化作用被解除。2.根据权利要求1的细菌，其中所述苏氨酸操纵子在质粒上。3.根据权利要求1的细菌，其中所述苏氨酸操纵子在染色体上。4.根据权利要求l的细菌，它具有生产L-异亮氨酸的能力，并且其中L-异亮氨酸生物合成酶的活性增强。5.—种苏氨酸操纵子，包含涉及弱化作用的区域、天然启动子和thrABC结构基因，其中所述苏氨酸操纵子的前导序列和衰减子具有选自SEQIDN0:1的核苷酸148-310和核苷酸168-310的缺失。6.—种生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的方法，包括在培养基中培养根据权利要求1至4任一项的细菌，并从该培养基中收集积累的L-苏氨酸或L-异亮氨酸。专利摘要L-苏氨酸或L-异亮氨酸可以通过下述方法生产，在培养基中培养细菌，并从培养基中收集L-苏氨酸或L-异亮氨酸，该细菌属于埃希氏菌属，具有生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸能力，并且具有由它的天然启动子指导表达和除去了至少前导序列和衰减子使得弱化作用被解除的苏氨酸操纵子。文档编号C12N15/70GKCN1954065B发布类型授权专利申请号CN200480034289公开日2010年4月28日申请日期2004年11月18日发明者中井勇太,伊藤久生,桥口贤一申请人:味之素株式会导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan专利引用(2),非专利引用(1),