专利名称：：灯盏花素氨基酸输液及其生产方法
技术领域：
：本发明涉及一种具有生物活性的灯盏花素氨基酸输液及其生产方法。
背景技术：
：灯盏花，现正式名称为灯盏细辛，为菊科飞蓬属植物灯盏花[Erigeronbreviseapus(Vant.)Hand.-Mazz]的干燥全草。云南民间习称灯盏花、灯盏细辛、土细辛。已收载于国家标准。所说的灯盏花素就是从灯盏细辛中分离提取出来的黄酮类化合物，主要成分为灯盏花乙素，尚含有少量灯盏花甲素。灯盏花素及其注射液、片剂、粉针剂等品种均已为国家标准。执行标准为WS3-B-3822-98、WS3-B-3879-98等，是云南省在1970～1972年间大搞中草药时发掘出来的一种植物药。经过三十多年的开发应用，该产品已被社会认可。目前已有或正在开发的有片剂、胶囊剂、水针剂、粉针剂、缓控释制剂等。但是由于技术等方面的原因，迄今仍没有临床上用量最大的大容量输液剂，使用时仍然将上述注射液或粉针剂大量加到输液中。这种用法存在的问题是加大护士的工作量，增加污染的机会，费时，不利于危急重症病人的抢救等。有关灯盏花素的专利申请也是近年医药领域的一个热点，已有十多项专利申请，与本申请较相关的专利有灯盏花大输液系列制剂(CN1191730A)、灯盏花素注射液稳定的处方和工艺过程(CN1187356A)。CN1191730A公开的是灯盏花的葡萄糖或氯化钠的大输液。由于技术方面的原因，该专利迄今未能实施。CN1187356A公开了在灯盏花素注射液制备中加入络合剂、抗氧化剂等，旨在增加产品的稳定性能。自L-谷氨酸钠开始应用以来，人们对氨基酸的利用日新月异，特别是近十年来，氨基酸产品备受人们的关注，其应用更加广泛。在医药方面，氨基酸是构成蛋白质的基本单位，参与体内代谢和各种生理功能活动，既可作为营养剂用于肌体的营养补充，又可用于防治多种疾病。氨基酸输液就是当代医药领域中的重要成就，对于危急重症患者和特殊病人具有极其重要的意义。但是氨基酸输液只能作为一种营养支持或补充剂，而心脑血管疾病的危急重症患者往往非常需要及时给予活血化瘀的药物，同时需要输入营养支持剂。
发明内容本发明的目的是提供一种质量稳定、疗效好并具有活血化瘀及营养支持双重功效的灯盏花素氨基酸大容量输液剂，以便节约抢救病人的宝贵时间，简化操作。根据临床病理研究，在发病早期1～48小时内，必须分阶段进行对症及个体化治疗，48小时后则需给病人补充足够的营养和支持成分，以利病人康复。发病早期某些氨基酸(如精氨酸等)、维生素C等均在临床实践中联合应用于不同阶段，并取得较好的效果。对脑卒中患者而言，由于脑水肿严重，因此需要用脱水剂(如甘露醇、甘油等)脱水。若心脑缺血和再灌均会对心脑造成严重的损伤。灯盏花素能直接清除自由基，抵抗缺血损伤及再灌损伤，改善血液循环和血流动力学，抗血栓等，可直接或间接用于治疗疾病。根据人体的正常需求，复合氨基酸能维持身体内正常的酸碱平衡，提供最佳的能量，纠正体内负氮平衡，维持肌体正氮平衡。从配伍组方上，灯盏花素在普通溶液中的稳定性较差，但在具有络合、抗氧化、屏蔽等多种作用的氨基酸的存在下，灯盏花素的稳定性很好，与原植物体内等同，加之生产工艺的严格控制(如氮气保护下操作)和相对温和(旋转灭菌器灭菌等)的工艺条件，保障了产品的稳定性。所以，本发明能提供一个针对性较强，适用于心脑缺血性疾病患者的技术方案。本发明提供的技术方案是每瓶灯盏花素氨基酸输液含有灯盏花素0.02～0.20g，以及能提供营养的氨基酸、能量剂和药用辅料。所述氨基酸为必需氨基酸中L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸醋酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸中的一种或几种，和/或为半必需氨基酸中L-精氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸中的一种或几种，和/或为非必需氨基酸中L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬氨酸，以及牛磺酸中的一种或几种。所述能量剂为山梨醇、L-苹果酸、丁二酸、马来酸、延胡素酸、葡萄糖、卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂等中的一种或几种，以便提供部分热量，防止氨基酸作为能源消耗，同时有利于提高氨基酸的利用率。所述药用辅料为不影响输液及其稳定性的维生素核黄素5′-磷酸酯钠盐、烟酰胺、甘油、维生素C、B1、P、肌醇中的一种或几种，和/或为能提高药物疗效的人参皂苷、西洋参皂苷、三七皂苷、绞股蓝皂苷中的一种或几种，和/或为不影响输液且能提高稳定性的抗氧剂中亚硫酸纳、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸纳、半胱氨酸中的一种或几种。所述灯盏花素氨基酸输液通过下列工艺步骤制得1、先将微量的氨基酸溶于注射用水，并注意使其完全溶解；2、再在灯盏花素中加入适量注射用水，再加入上述注射用氨基酸及其他辅料，并注意使其完全溶解；3、加入抗氧剂，调节等渗，补加注射用水至最终所需体积；4、经粗滤，精滤后，将精滤液进行分装，按每瓶所需ml分装，盖上盖子，制剂预热，在121℃灭菌(15分钟)，或用旋转灭菌器灭菌，冲热水逐渐冷却，得产品，阴凉处保存。操作注意事项1、在整个过程中注意通氮或在氮气保护下操作，以防氨基酸氧化；2、抗氧剂尽量在后期加入；3、灭菌时温度要保持均匀。具体操作是在1万级和氮气保护的条件下，先将处方中微量的氨基酸溶于注射用水，并注意使其完全溶解，在灯盏花素中加入适量注射用水，用稀碱调pH致碱性(7.0～8.0)，将灯盏花素溶解，加入注射用水稀释至所需体积，再加入注射用氨基酸及其他辅料，并注意使其完全溶解，加入抗氧剂，调节等渗，补加注射用水至最终所需体积，过滤，滤液经过滤纸及0.4μm的滤膜粗滤后，在100级的条件下，用0.2μm以下的滤膜精滤，精滤液按每瓶所需ml分装，盖上盖子，对制剂进行预热，在121℃灭菌15分钟，或用旋转灭菌器灭菌，冲热水逐渐冷却后，阴凉处保存。用本法制备的灯盏花素输液剂，经实验表明1、稳定性在常温下灯盏花素氨基酸输液放置1年，产品稳定可靠，各项指标均合格，完全符合注射用的要求；2、刺激性用大白兔做刺激性实验，灯盏花素氨基酸输液的刺激性为0级，即无明显变化；3、活血化瘀灯盏花素氨基酸输液和灯盏花素注射液在活血化瘀方面的作用基本一致。实施例1制备灯盏花素八种氨基酸输液，配方(1000ml)灯盏花素0.08gL-异亮氨酸3.82gL-亮氨酸5.03gL-赖氨酸醋酸盐4.52gL-甲硫氨酸2.34gL-苯丙氨酸5.65gL-苏氨酸2.78gL-色氨酸1.0gL-缬氨酸3.98g甘露醇70g制备工艺在1万级和氮气保护的条件下，先将微量的L-色氨酸溶于20ml注射用水，并注意使其完全溶解，待用；在灯盏花素中加入20ml注射用水，用碳酸氢钠饱和溶液调节pH至7.0～8.0，使灯盏花素完全溶解，过滤，待用；再将其他氨基酸溶于500ml注射用水，加入上述溶好的色氨酸液和灯盏花素液，加入甘露醇并用注射用水稀释至800ml，加入抗氧剂，调节等渗，补加注射用水至最终所需体积1000ml，过滤；滤液经过滤纸及0.4μm的滤膜粗滤后，在100级的条件下，用0.2μm以下的滤膜精滤；精滤液送入分装机，按每瓶所需250ml分装，盖上丁基橡胶盖子，对制剂进行预热，在121℃灭菌15分钟，冲热水逐渐冷却后，阴凉处保存，包装、检验、合格得4瓶250ml∶20mg之规格的灯盏花素八种氨基酸输液成品。实施例2制备灯盏花素及十一种氨基酸输液，配方(1000ml)灯盏花素0.20gL-异亮氨酸3.72gL-亮氨酸5.00gL-赖氨酸醋酸盐4.32gL-甲硫氨酸2.30gL-苯丙氨酸5.60gL-苏氨酸2.71gL-色氨酸0.90gL-缬氨酸3.98gL-盐酸精氨酸5.10gL-酪氨酸0.27gL-组氨酸2.10g山梨醇60g制备工艺同实施例1，制得2瓶500ml∶100mg之规格的灯盏花素十一种氨基酸输液成品。实施例3制备灯盏花素及十八种氨基酸输液，配方(1000ml)灯盏花素0.40gL-异亮氨酸3.52gL-亮氨酸4.8gL-赖氨酸醋酸盐4.12gL-甲硫氨酸2.10gL-苯丙氨酸5.22gL-苏氨酸2.40gL-色氨酸0.80gL-缬氨酸3.63gL-盐酸精氨酸4.90gL-酪氨酸0.24gL-组氨酸2.00gL-丙氨酸1.95gL-脯氨酸1.00gL-丝氨酸1.00g甘氨酸7.56gL-胱氨酸0.10gL-谷氨酸0.75gL-天门冬氨酸2.50g山梨醇50.00g制备工艺同实施例1，制得2瓶500ml∶200mg之规格的灯盏花素十八种氨基酸输液成品。实施例4制备灯盏花素及十八种氨基酸和三七总皂苷输液，配方(1000ml)灯盏花素0.20gL-异亮氨酸3.52gL-亮氨酸4.80gL-赖氨酸醋酸盐4.12gL-甲硫氨酸2.10gL-苯丙氨酸5.22gL-苏氨酸2.40gL-色氨酸0.80gL-缬氨酸3.63gL-盐酸精氨酸4.90gL-酪氨酸0.24gL-组氨酸2.00gL-丙氨酸1.95gL-脯氨酸1.00gL-丝氨酸1.00g甘氨酸7.56gL-胱氨酸0.10gL-谷氨酸0.75gL-天门冬氨酸2.50gL-苹果酸4g三七皂苷0.80g葡萄糖60g制备工艺同实施例1，制得2瓶500ml∶100mg之规格的灯盏花素十八种氨基酸三七皂苷输液成品。实施例5制备灯盏花素及氨基酸和维生素输液，配方(1000ml)灯盏花素1.00gL-天门冬氨酸钾镁20g甘露醇70g核黄素5′-磷酸酯钠盐0.4g制备工艺同实施例1，制得10瓶100ml∶100mg之规格的灯盏花素一种氨基酸维生素输液成品。实施例6制备灯盏花素及二种氨基酸输液，配方(1000ml)灯盏花素0.20gL-赖氨酸盐酸盐4.32g卵磷脂1.00gL-半胱氨酸盐酸盐1.07g山梨醇66g延胡素酸3.25g制备工艺同实施例1，制得10瓶100ml∶20mg之规格的灯盏花素二种氨基酸输液成品。本发明提供的灯盏花素氨基酸输液经药学研究及部分药理研究，其结果报告如下1、灯盏花素氨基酸输液的稳定性实施例六个样品在室温下避光保管，放置1、2、3、6、12个月，按时检查，每瓶外观基本不变，有效成分经检验也未发生变化。因此，初步认为该灯盏花素输液各种处方制得的产品均可达到1年左右的保质期。质量标准中含量测定和鉴别等参照现行国标，结果见表1下。2、灯盏花素氨基酸输液的刺激性试验取健康家兔4只，W2.0～2.2kg，雌雄各半，分为两组，分别在其左右腿股四头肌上注射灯盏花素输液1ml，药后48h处死兔子，剖检股四头肌，纵向切开观察注射局部肌肉刺激反应，并按表2换算出相应的反应级。表1、灯盏花素氨基酸输液稳定性试验结果样品样品含量、鉴别1月2月3月6月12月例1合格合格合格合格合格例2合格合格合格合格合格例3合格合格合格合格合格例4合格合格合格合格合格例5合格合格合格合格合格例6合格合格合格合格合格结果表明该发明制备的样品，经过初步稳定性考察，产品质量基本稳定，可达一年以上。表2、局部肌肉刺激反应级表反应级刺激反应0无明显变化1轻度充血，其范围小于0.51.0cm2中度充血，其范围小于0.51.0cm3重度充血，伴有肌肉变性4出现坏死，有褐色变性5出现广泛性坏死结果灯盏花素输液的刺激性为0级；3、灯盏花素氨基酸输液的脑功能改善作用给ICR小鼠球后注射D-半乳糖造成衰老动物模型，分组灌胃给予不同剂量的灯盏花素氨基酸输液(2.5、5、10ml/kg)，每日一次，连续二周，然后测试其对衰老动物智力的影响，结果显示，产品能提高小鼠跳台和走迷宫试验的学习成绩，增强对其记忆的保持。此外，产品还能明显提高衰老模型动物血浆超氧化物岐化酶(SOD)的含量，降低脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量，具有较好的抗氧化功能。1、材料1.1、实验动物ICR小鼠，体重20±2g，雌雄各半。1.2、药物及试剂1.2.1、供试品灯盏花素十八种氨基酸三七皂苷输液(试制品)1.2.2、对照品灯盏花素片，临用时，用1％的羧甲纤维钠配制成5％的混悬液。1.2.3、其它试剂D-半乳糖，上海试剂二厂出品，批号990102。邻苯二甲醛，中国上海五联化工厂出品，批号20010517。5-羟色胺硫酸肌肝，瑞士进口，上海化学试剂采购供应站分装。重酒石酸去甲肾上腺素，上海禾丰制药有限公司出品，批号010908。盐酸多巴胺，广州明兴制药厂生产，批号9901001。其余化学试剂均为AR级。1.3、主要试验仪器1、JN-A型精密扭力天平，上海第二天平仪器厂出品。2、7520型分光光度计，上海分析仪器厂生产。3、MPF-4型萤光分光光度计，日本产。4、超氧化物歧化酶测试盒和丙二醛测定试剂盒，南京建成生物工程研究所出品。2、实验方法和结果先将小鼠分为空白对照组和衰老模型组。衰老模型组小鼠每天眼球后注射D-半乳糖0.12mg/g，连续一月[1]。小鼠造型后根据需要再分若干小组。实验时小鼠随机作如下分组(1)空白对照组(动物不造型)，灌胃N.S。(2)造型对照组(动物造型)，灌胃N.S。(3)阳性药对照组，动物造型、灌胃健脑胶囊溶液(0.5g/kg，为临床二倍成人剂量)。(4)-(6)组为试验组低、中、高剂量组，分别灌胃2.5、5、10ml/kg，各组小鼠灌胃容积均为10ml/kg，每日一次，连续两周。于末次给药后作下列各项指标测定。2.1、产品对衰老模型小鼠的学习和记忆维持的影响2.1.1、跳台试验仿文献方法[2]，先将小鼠放入跳台反应箱内适应环境3分钟，然后给反应箱底的铜栅通以36V交流电，动物受到电击后，往往会跳至平台，以避伤害性刺激。由于平台窄小，不便停留，迫使其再次或多次跳至铜栅，但受到电击后又会迅速地跳回平台，如此训练5分钟，记录每鼠受到电击的次数，以此作为该鼠的学习成绩。24小时后重作测试。试验时，先将小鼠放在平台上，记录小鼠第一次跳下平台的时间(潜伏期)和3分钟内因跳下平台而受电击的次数(即错误次数)，以此作为记忆维持的指标。结果见表1。表1产品对衰老模型小鼠学习记忆的影响(跳台法)x±SD，n＝20剂量学习成绩记忆维持组别(g/kg.d)5min错误次数跳台潜伏期(秒)5min错误次数空白对照组N.S10ml3.2±1.2**82.6±14.6**3.9±1.5**造型对照N.S10ml4.8±1.350.4±12.28.9±2.6阳性药对照0.53.7±1.2**63.2±15.5**△△5.5±1.7**△△产低剂量2.53.6±1.4**70.1±15.6**5.3±1.7**△△品中剂量5.03.8±1.3**78.7±17.6**4.3±1.6**高剂量10.03.5±1.0**85.0±19.0**5.2±2.1**△注与造型对照组比较*P＜0.05**P＜0.01。与空白对照组比较△P＜0.05；△△P＜0.01以上结果显示，产品显著延长小鼠跳台潜伏期，同时明显减少跳台的错误次数(P＜0.01)。2.1.2、矩型迷宫试验取造型合格小鼠一批，按上述试验进行分组及给药(或N.S)。给药至第11天，禁食12小时后作迷宫取食训练。小鼠放入起步区，经矩形迷宫到达目标区。途中走错，帮助其纠正。达目标区后让其进食5分钟。每天如此练习10次，连续三天。第四天(即给药的第十四天)正式实验。各组选取灵活性较一致的小鼠20只，记录小鼠从起步区到达目标区的时间以及中途走错的次数[3]。连续作两次，两次数据合并取平均值作为小鼠的学习成绩。动物继续给药，一周后重复上述试验，所得数据即表示记忆的维持，结果见表2表2产品对衰老模型小鼠学习记忆的改善作用(迷宫法)x±SDn＝20剂量学习期到达目标区记忆维持到达目标区组别(g/kg.d)所需时间(秒)错误次数所需时间(秒)错误次数空白对照组N.S10ml31.2±6.5**3.5±1.3**39.9±9.8**3.9±1.5**造型对照组N.S10ml46.9±10.34.9±1.552.5±9.85.9±1.4阳性药对照0.538.9±7.1*3.0±1.0**39.1±5.2**34±0.8**低剂量2.540.1±6.3*△△3.1±0.9**43.4±6.8**3.7±1.2**产中剂量5.037.7±7.2**△△3.1±0.8**40.3±6.6**3.8±0.8**品高剂量10.034.3±5.3**2.5±1.1**△37.7±4.6**2.9±0.8**△注与造型对照组比较*P＜0.05**P＜0.01。与空白对照组比较△P＜0.05；△△P＜0.0l以上结果显示，产品明显提高衰老模型小鼠走迷宫的学习成绩，减少记忆维持期走迷宫发生的错误次数，即增强小鼠对记忆的保持效应。2.2产品对衰老模型小鼠血清MDA和SOD含量的影响取小鼠一批，分组及给药剂量和方法同上述1.2.1实验。但给药(或N.S)时间为两个疗程(28天)，于末次给药后一小时从股动脉取血并取小鼠全脑。按南京建成生物工程研究所提供的测试盒所述方法分别测定各组小鼠血清中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量[4]。用萤光分光光度法测定小鼠脑组织中单胺类神经递质的含量。操作方法及结果如下血清丙二醛(MDA)的含量测定，按下表操作混匀(摇动几下试管架)旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，刺一小孔，于95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，然后离心(4000rpm)10分钟，取上清液，532nm处1cm光径，蒸馏水调零比色，测各管吸收光度值，再按下列计算血清中MDA的含量血清超氧化物歧化酶(SOD)的活力测定，按下表操作用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="751">显色剂(ml)22</table></tables>混匀，10分钟后倒入1cm光径比色杯中，蒸馏水调零，于波长550nm处比色，按下式计算SOD活力(nu/ml)结果见表3表3产品对小鼠血浆MDA和SOD的影响x±SD给药剂量组别nMDA(nmol/ml)SOD(nu/ml)(g/kg.d)空白对照N.S10ml207.1±0.8**87.9±21.0**模型对照N.S10ml2010.6±1.137.5±15.0阳性药对0.5207.9±0.8**50.8±11.5**△△通低剂量0.5207.7±0.9**55.1±10.3**△△舒中剂量1.0207.4±0.9**57.6±13.3**△△胶高剂量2.0207.2±1.0**68.0±12.6**△△囊注与造型对照组比较*P＜0.05**P＜0.01。与空白对照组比较△P＜0.05；△△P＜0.01以上结果显示产品能明显减少血浆脂质过氧化产物MDA的含量和提高血浆超氧化物歧化酶(SOD)的活性。权利要求1.一种灯盏花素氨基酸输液，其特征在于每瓶灯盏花素氨基酸输液含有灯盏花素0.02～0.20g，以及能提供营养的氨基酸、能量剂和药用辅料。2.根据权利要求1所述的输液，其特征在于所述氨基酸为必需氨基酸中L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸醋酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸中的一种或几种，和/或为半必需氨基酸中L-精氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸中的一种或几种，和/或为非必需氨基酸中L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬氨酸，以及牛磺酸中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的输液，其特征在于所述能量剂为山梨醇、L-苹果酸、丁二酸、马来酸、延胡素酸、葡萄糖、卵磷脂、脑磷脂、大豆磷脂中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的输液，其特征在于所述药用辅料为不影响输液及其稳定性的维生素核黄素5’-磷酸酯钠盐、烟酰胺、甘油、维生素C、B1、P、肌醇中的一种或几种，和/或为能提高药物疗效的人参皂苷、西洋参皂苷、三七皂苷、绞股蓝皂苷中的一种或几种，和/或为不影响输液且能提高稳定性的抗氧剂中亚硫酸纳、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸纳、半胱氨酸中的一种或几种。5.根据权利要求1所述的输液，其特征在于所述灯盏花素氨基酸输液通过下列工艺步骤制得A、先将微量的氨基酸溶于注射用水，并注意使其完全溶解；B、再在灯盏花素中加入适量注射用水，再加入上述注射用氨基酸及其他辅料，并注意使其完全溶解；C、加入抗氧剂，调节等渗，补加注射用水至最终所需体积；D、经粗滤，精滤后，将精滤液进行分装，按每瓶所需ml分装，盖上盖子，制剂预热，在121℃灭菌(15分钟)，或用旋转灭菌器灭菌，冲热水逐渐冷却，得产品，阴凉处保存。全文摘要本发明提供一种灯盏花素氨基酸输液，其特征在于每瓶灯盏花素氨基酸输液含有灯盏花素0.02～0.20g，以及能提供营养的氨基酸、能量剂和药用辅料。它质量稳定，无刺激，疗效好，同时还具有活血化淤及营养支持双重功效，能够为抢救危急重症病人赢得宝贵的时间，简化医护人员的操作，降低劳动强度，对及时救治危急重症的心脑血管患者和特殊病人具有极其重要的意义。文档编号A61K31/7042GK1615898SQ20031011096公开日2005年5月18日申请日期2003年11月15日优先权日2003年11月15日发明者王京申请人:昆明紫健生物技术有限公司