专利名称：构建产生氨基酸的细菌的方法,及通过发酵该经构建的产生氨基酸的细菌以制备氨基酸 ...的制作方法
背景技术：
本发明是关于构建一种具有高产量的产生氨基酸能力的细菌突变株的方法，以及经发酵作用由此突变株产生L-氨基酸的方法。
构建经由发酵而产生氨基酸的突变株的方法大致可分为两种。一种是应用化学突变剂将突变随机导入DNA中，另一种是通过基因重组作用。就后者方法而言，可经由加强关于此物质生物合成代谢路径的基因，或通过减弱一会破坏此物质的酶基因，从而得到目的物质生产能力增强的菌株。基于此观点，为加强目的基因而在细胞中利用一个其染色体能独立复制的质粒。
然而利用质粒加强目的基因的方法有一些问题，特别是目的基因的加强程度由所用质粒的拷贝数而测定。因此有一些种类的目的基因拷贝数过多而导致表达过度进而严重抑制生长，反而所要物质的产生力较低。在此种情况下虽然使用低拷贝数的质粒对目的基因的加强程度较低，但对质粒的种类有多种限制，且对目的基因的表达程度不能进行自由调整。
另一问题是质粒的复制通常不稳定，且质粒常被移除。
举例来说，特开昭61-26818公开了一来源于产生谷氨酸的棒状菌的重组DNA，此重组DNA包含-DNA片段，它具有产生谷氨酸脱氢酶(GDH)的基因(glutamate dehydrogenase gene)，以及含有细胞内自动复制的必要基因的-DNA片段。本文也公开了导入此重组DNA到-细胞内，而形成GDH强化株，通过微生物生长而促进物质(譬如氨基酸和蛋白质等)的产生。
另一方面，在日本专利2,520,895中，将上述的重组DNA导入棒状杆菌中得到一具有增强酶活性的菌株，且通过发酵此菌株而产生L-谷氨酸。然而L-谷氨酸的产生及产量并不令人满意。因此，需要进一步增强L-谷氨酸的产生力。而增强方法已达成，亦即将含有衍生自产生谷氨酸的棒状菌的产生谷氨酸脱氢酶基因和异柠檬酸合成酶基因(ICDH)两种基因的重组DNA转入产生谷氨酸的棒状菌内。
更进一步，特表平6-502548公开棒状杆菌的表达，和含有一棒状杆菌菌株和一分泌匣的分泌系统；此分泌匣包含用于在此菌株中表达的第一功能性DNA序列，用于编码氨基酸多肽和/或蛋白质的第二DNA序列，以及插入介于第一DNA序列和第二DNA序列间的第三DNA序列，其中的第三DNA序列编码的蛋白质要素是选自PS1和PS2可保证由该棒状杆菌进行此氨基酸，多肽和/或蛋白质的分泌。具体而言，多肽的分泌已公开于文中。特别的是诱发棒状杆菌菌株的NTG突变作用，且筛选一具有4-氟谷氨酸(4FG)抗性的突变株，由于4FG类似谷氨酸，因此以PCGL141转化之。文中也公开可从类似抗性细菌中取得加强表达GDH的菌株。文中也公开观察到GDH启动子核苷酸序列251到266的突变作用。
发明的公开本发明目标是提供一方法构建一突变株，使其不需使用质粒就能适当加强控制目的基因的表达，且可通过重组作用或突变作用产生高产量的氨基酸。
本发明的另一目标是提供一GDH启动子，在棒状杆菌菌株中不需要严重增加副产物天冬氨酸和丙氨酸的量就具有产生高产量谷氨酸的能力。
本发明的另一目标是提供一具有上述GDH启动子序列的GDH基因。
本发明的进一步目标是提供一具有上述基因的棒状杆菌菌株，且能产生L-谷氨酸。
本发明的进一步目标是提供一方法，通过发酵作用产生氨基酸，其中应用所构建的产生氨基酸的微生物。
本发明的进一步目标是提供一产生谷氨酸的发酵方法，通过利用产生谷氨酸棒状菌在低成本下增加谷氨酸的产量。
本发明已有效的解决上述问题，在染色体上改变氨基酸生物合成基因的启动子而控制目的基因的表达量。特别的是本发明已有效解决上述问题，是通过在启动子的特异区域-35区域或-10区域导入一特殊的突变。
亦即本发明提供一产生具有增强的氨基酸或核酸产生力的棒状菌的方法，步骤包括在棒状菌染色体上的氨基酸或核酸生物合成基因的启动子序列引起突变而使其接近共有序列，或以重组作用在棒状菌染色体上的氨基酸或核酸生物合成基因的启动子序列中导入一变化而使其接近共有序列，得到棒状细菌的突变株，培养此突变株，并筛选能大量产生指定的氨基酸或核酸的突变株。
本发明也提供一产生谷氨酸脱氢酶(GDH)基因的启动子，其中该启动子具有选自位于-35区域的CGGTCA,TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一种DNA序列和/或-10区域TATAAT序列或ATAAT已被其它碱基取代序列，且此序列不抑制启动子功能。
本发明也提供一具有上述启动子的谷氨酸脱氢酶基因。
本发明也提供一具有上述基因的产L-谷氨酸棒状菌。
本发明也提供一通过发酵生产氨基酸和核酸的方法，包括培养通过上述方法所构建的氨基酸和核苷酸生产能力增强的棒状菌，在培养基中培养，以及在培养基中累积目的氨基酸和核酸，并从培养基中收集此氨基酸。
本发明也提供一通过发酵生产L-谷氨酸和核酸的方法，包括在液态培养基中培养产L-谷氨酸的对4-氟谷氨酸抗性的棒状菌，以及在培养基中累积L-谷氨酸，并从培养基中收集此氨基酸。
附图简述
图1显示含有突变启动子的GDH基因的构建流程。
图2显示含有突变启动子的CS基因的构建流程。
图3显示携带lacZ为报告基因的穿梭载体的构建流程。
实施本发明的最佳方式本发明中的“产生谷氨酸的棒状菌”包括以往归类为短杆菌属而现在统归于棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1981))，或包括与棒状杆菌属非常接近的短杆细菌属。因此本发明中应用的突变株可从如下所述的属于棒状杆菌属或短杆菌属的棒状谷氨酸生产菌来进行诱导。另外，本说明书中未提及谷氨酸生产性的时候，将棒状杆菌属细菌及短杆菌属细菌仅叫做棒状菌。嗜乙酰乙酸棒状杆菌 ATCC 13870醋谷棒状杆菌 ATCC 15807美棒状杆菌 ATCC 15991谷氨酸棒状杆菌 ATCC 13032分叉短杆菌 ATCC 14020乳酸发酵短杆菌 ATCC 13869百合棒状杆菌 ATCC 15990黄色短杆菌 ATCC 14067梅拉司克棒状杆菌 ATCC 17965糖短杆菌 ATCC 14066伊马瑞短杆菌 ATCC 14068蔷薇短杆菌 ATCC 13825嗜硫短杆菌 ATCC 19240嗜氨微杆菌 ATCC 15354产热氨棒状杆菌 AJI 2310(FERM 9246)所产生的氨基酸并没有特别限制，只要是由相关合成基因及其启动子可证实的即可。关于生物合物的有效酶实施例包括谷氨酸发酵作用中的GDH，柠檬酸合成酶(CS)，异柠檬酸合成酶(ICDH)，丙酮酸脱氢酶(PDH)和乌头酸酶(ACO)。
赖氨酸发酵过程所用的酶包括生物合成酶，譬如天冬氨酸激酶(AK)，二氢吡啶二羧酸合成酶；二氢吡啶二羧酸还原酶，二氨基庚二酸脱氢酶和二氢基庚二酸脱羧酶。涉及赖氨酸薄膜排出的赖氨酸排出蛋白质(lysE基因)也是有效的。
精氨酸发酵过程所用的酶包括N-乙酰谷氨酸合成酶，N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酸磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸转氨酶，N-乙酰鸟氨酸酶；鸟氨酸转氨基甲酰酶，精氨基琥珀酸合成酶，和精氨基琥珀酸酶。，通过这些酶进行催化反应形成氨基酸。这些酶是有效用的。这些酶是依序分别由argA,argB,argC,argD,aegE,argF,argG和argH所编码的酶。
丝氨酸发酵过程所用的有效酶包括3-磷酸甘油酸脱氢酶，磷酸丝氨酸转氨酶，磷酸丝氨酸磷酸酶等等。
苯丙氨酸发酵过程所用的有效酶包括生物合成酶，譬如脱氧阿拉宾庚酸磷酸合成酶(deoxyarabinohepturonic acid phosphoric acid syntheticenzyme),3-去氢奎尼酸合成酶，3-去氢奎尼酸脱水酶，莽草酸脱氢酶，莽草酸激酶，5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶，分支酸(chorismic acid)合成酶，分支酸变位酶，代丙酮酸脱水酶(prephenatedehydroratase)等等。糖代谢酶譬如转酮醇酶，转醛醇酶，磷酸烯醇丙酮酸合成酶等等亦有效。
除了上述苯丙氨酸发酵所需的各种有效酶及上述丝氨酸发酵所需的各种有效之外，色氨酸发酵过程所用的有效酶包括属于色氨酸操纵子的酶。
脯氨酸发酵过程所用的有效酶包括γ-谷氨酸激酶，γ-谷氨酸半醛脱氢酶，吡咯啉-5-羧化还原酶，和上述谷氨酸发酵所需的各种有效酶。
谷氨酸发酵过程所用的有效酶包括谷酰氨酸合成酶，和上述谷氨酸发酵所需的各种有效酶。
在肌苷的产生中，加强5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸转氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧酰氨转甲酰基酶等等的表达被认为是有用的。
在鸟苷的产生中，加强5′-肌苷酸脱氢酶和5′-黄苷酸氨基酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸转氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧酰氨转甲酰基酶等等的表达被认为是有用的。
在腺苷的产生中，加强腺苷琥珀酸合成酶和5-磷酸核糖基1-二磷酸合成酶，5-磷酸核糖基1-二磷酸转氨基酶，磷酸核糖基氨基咪唑羧酰氨转甲酰基酶等等的表达被认为是有用的。
在核苷酸的产生中，加强磷酸核糖基转移酶，肌苷激酶，鸟苷激酶和腺苷激酶的表达被认为是有用的。
在本发明中产生氨基酸的棒状菌突变株的取得，是在一产生氨基酸的棒状菌的染色体上的所要的氨基酸-生物合成基因的启动子序列造成突变而得，此类启动子序列如上述的GDH，以化学剂导致突变，或通过基因重组导入一突变而使其接近共有序列。
“共有序列”一词是指在各种启动子序列中出现频率最高的碱基序列。共有序列包括那些位于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的序列。大肠杆菌的共有序列叙述于Diane K.Hawley and William R.McClure Nuc.Acid.Res.11:2237-2255(1983)，枯草杆菌的共有序列叙述于Charles etal.Mol.Gen.Genet 186:339-346(1982)。
突变可如GDH般只在一启动子造成，或如GDH，柠檬酸合成酶(CS)和异柠檬酸合成酶(ICDH)在两个或更多启动子序列造成突变。
在本发明中所得到的突变株，经培养能产生大量所指定的氨基酸。
目前已证明谷氨酸的发酵作用中，衍生自产生谷氨酸的棒状杆菌微生物的GDH在其上游部分具有其启动子序列[Sahm et al.,MolecularMicrobiology(1992),6,317-326]。
例如，如下可得到本发明的GDH启动子、具有该GDH启动子序列的GDH基因以及具有该基因的生产L-谷氨酸的棒状杆菌菌株。
以UV，X-射线或放射线等处理，或以突变诱发剂处理以得到一可在包含4-氟谷氨酸的琼脂板培养基中生长的抗4-氟谷氨酸菌株。也就是突变作用处理过的菌株涂于包含4-氟谷氨酸琼脂平板上生长，因4-氟谷氨酸的浓度可抑制亲代生长而分离出可生长的突变株。
更进一步，GDH基因的启动子序列可用各种突变序列通过定位突变的方法置换之，而各序列和GDH活性间的关系可检查其L-谷氨酸高克隆力。
本发明中特别优选位于产生GDH基因启动子-35区域的DNA序列，至少有-DNA序列是选自CGGTCA,TTGTCA,TTGACA和TTGCCA和/或位于启动子-10区域TATAAT的DNA序列，或以其它碱基置换TATAAT中的ATAAT碱基而不抑制启动子功能者。位于-10区域的TATAAT中的ATAAT以其它碱基置换而不抑制启动子功能者可以选择使用的理由如下因为观察到只以“T”置换野生型-10区域序列的CATAAT的第1个“C”(表1中的p6-4)就明显增加GDH的比活性，因此认为以另一碱基置换是可行的。
如上叙述的GDH基因的启动子序列叙述于Sahm et al.,MolecularMicrobiology(1992),6,317-326。其中叙述为序列号1。而GDH基因其本身的序列也叙述于Sahm et al.,Molecular Microbiology(1992),6,317-326，亦为序列号1。
同样的，亦可在柠檬酸合成酶(CS)或异柠檬酸合成酶(ICDH)的启动子中产生突变。
如此，则GDH启动子具有选自位于-35区域CGGTCA，TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一个DNA序列和/或位于-10区域的TATAAT或其ATAAT碱基已被其它碱基置换但不抑制启动子功能的序列。本发明也提供具有上述启动子产生谷氨酸脱氢酶的基因。
CS的启动子具有位于-35区域中的TTGACA序列和/或位于-10区域中的TATAAT序列，且没有任何序列会抑制启动子功能。本发明也提供具有上述启动子的CS基因。
使用于ICDH的启动子是具有在-35区域第一个或第二个启动子(位点)的TTGCCA或TTGACA序列，和/或在-10区域第一个或第二个启动子(位点)的TATAAT序列，但不抑制启动子的功能。本发明也提供具有上述启动子的icd基因。
使用于PDH的启动子是在-35区域具有TTGCCA序列和/或在-10区域TATAAT序列，且引序列不抑制启动子的功能。本发明也提供具有上述启动子的PDH基因。
本发明也提供具有上述基因的产L-谷氨酸的棒状菌。
精氨基琥珀酸合成酶的启动子具有是选自位于-35区域的TTGCCA，TTGCTA和TTGTCA的至少一个DNA序列和/或位于-10区域的TATAAT序列或以其它碱基置换位于TATTAT中的ATAAT碱基，但序列不抑制此启动子功能。本发明也提供具有上述启动子的精氨基琥珀酸合成酶。
本发明也提供具有上述基因的产生精氨酸的棒状菌。
培养本发明的棒状菌可得到氨基酸，以产生L-谷氨酸为佳，是在液态培养基中形成所指定的氨基酸并通过累积，并从此培养基中收集氨基酸。
使用于培养本发明的上述菌株细菌的液态培养基是包含碳源，氮源，无机盐，生长因子等等的一般培养基。
碳源包括碳水化合物类的葡萄糖，果糖，蔗糖，糖蜜和淀粉水解物；醇类的乙醇和甘油；和有机酸类的醋酸。氮源包括硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，磷酸铵，醋酸铵，氨，蛋白胨，肉萃取物，酵母菌萃取物和玉米浆。当使用需特别营养的突变株时，则以标准品或天然物质形式将所要求的物质加入培养液中。
在生物素限制之下棒状杆菌常产生L-谷氨酸。因此，在培养基中需限制生物素的量或将表面活性剂或青霉素等对生物素具抑制影响的物质加入培养基中。
发酵作用最好以摇动培养方法或有氧转动培养方法在有氧条件下进行，而培养液pH维持在5到9持续2到7天。以尿素，碳酸钙，气态氨，氨水等等控制pH值。培养温度以24～37℃为佳。
利用离子-交换树脂方法或结晶法等常用方法控制液体培养液中L-谷氨酸的产生和累积。L-谷氨酸的分离可通过吸附在阴离子交换树脂或通过中和结晶作用。
根据本发明，在产生氨基酸的棒状菌氨基酸-生物合成基因的启动子区域导入一突变来调控目的基因的表达，因此可得到高产量的指定氨基酸。此外，根据本发明的细菌并未发生任何目的基因的流失，与质粒相较之下能稳定得到高产量的指定氨基酸。如此，本发明具重要的工业价值。
本发明提供各种启动子，特别是GDH的启动子能赋予产生氨基酸的能力，特别是谷氨酸，在棒状菌菌株内不需增加副产物天冬氨酸和丙氨酸的量就可得高产量谷氨酸。
在本发明中，将产生L-谷氨酸的棒状菌导入突变，使所得菌株的突变发生在GDH基因的启动子区域中，而此菌株对4-氟谷氨酸具抗性，且能在培养基中得到高产量的谷氨酸。因此，本发明非常有助于工业上的利用。
下列实施例将更进一步例证本发明。实施例1突变的GDH启动子的制作以下列的定位突变方法制备突变的GDH启动子(1)具有各种突变形式的启动子的GDH基因的制备野生型棒状菌GDH基因启动子-35区域和-10区域的序列显示在序列1。野生型的启动子序列已发表于[Molecular Microbiology(1992),6,317-326]。
携带具有突变启动子的GDH基因的质粒制备方法如下如图1所示，以“细菌基因组DNA纯化试剂盒”(Advanced Genetic TechnologiesCorp.)制备野生型棒状杆菌ATCC 13869的染色体基因作为模板，通过PCR在GDH基因的上游和下游序列中扩增GDH基因。两末端皆为平端。所得产物插入到质粒pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的SmaⅠ位点。然后从具有棒状杆菌复制起点的质粒pSAK 4中取得复制起点，将之插入到该质粒的SalⅠ位点而得到质粒pGDH。通过此方法，可使用序列表中所显示的GDH基因上游引物序列1到6为引物，得到具有上述各别启动子序列的GDH基因。利用测序测定确认PCR扩增片段中任何突变，和启动子序列中的非突变序列。pSAK4的构建如下质粒pHK4(特开平5-7491)具有衍生自质粒pHM 1519[Agric.Biol.Chem.,48,2901-1903(1984)]的复制起点，而pHM1519能在已得到的棒状杆菌中自动复制，因此以BamHⅠ和KpnⅠ消化而得到具有复制起点的DNA片段。然后使用DNA平端试剂盒(Blunting kit of Takara Shuzo Co.,Ltd.)处理得到平端的DNA片段。然后连结SalⅠ连接子(linker)所得的产生插入pHSG 299(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的SalⅠ位点而得到质粒pSAK4。(2)比较具有各启动子序列的GDH的表达程度如上述所制备的质粒以电穿孔作用(特开平2-207791)导入野生型的棒状菌菌株中。为比较这些菌株的GDH表达程度，GDH的比活性的测定是依照Sahm et al.的上述方法。结果显示在表1。
表1
ATCC 1369／p 6-到ATCC 1369／p 6-分别相对应到序列号2到6。除了下列划线部分改变之外，这些序列与序列号I(野生型)相同序列号1. 5'- TTAATTCTTTGTGGTCATATCTGCGACACTGCCATAATTTGAACGT -Y2. CGGTCA CATAAT3. TGGTCA TATAAT4. TTGACA TATAAT5. TTGCCA TATAAT6. TTGTCA TATATT这些序列是双链线形合成DNA。实施例2突变株菌株的制备(I)诱发对抗4-氟谷氨酸的突变株菌株AJ113029是公开在WO 96／06180中的产生谷氢酸的突变株菌株。虽然在31.5℃的培养温度下不能产生谷氨酸，但若培养在37℃之下即使没有生物素-抑制剂也能产生谷氨酸。在此实施例中，利用乳酸发酵短杆菌AJ 13029菌株作为亲代以衍生突变株菌株。当然除了AJ 13029之外的产生谷氨酸菌株可使用作为亲代，来衍生具4-氟谷氨酸抗性的突变株菌株。
将菌株AJ 13029的微生物培养于31.5℃的CM2B琼脂培养基(表2)24小时以取得细胞。以250微克/毫升的N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍于30℃处理30分钟。然后将具有存活率1％的细胞悬浮液涂于含有4-氟谷氨酸(4FG)的琼脂平板培养基(表3)。于31.5℃培养20到30小时可形成菌落。在此实验中，首先制备含有1毫克/毫升4FG的斜面培养基，然后其上制备相同培养基但不含4FG的平面培养基。如此，则可在琼脂培养基表面得到4FG浓度梯度。当上述所得的突变株细胞接种于此平板时，在此菌株的生长限制边界会形成一界线。采集在含有较高浓度4FG的区域所形成的菌落。因此从约10,000突变株菌株得到约50个菌株可抗4FG。
表2 CM2B琼脂培养基成分 浓度蛋白胨(E本制药社制)1.0％酵母菌萃取物(Ditco Co.)1.0％NaCl 10.5％d-生物素 10微克/升琼脂1.5％(pH7.2以KOH调整)
表3琼脂培养基成分 数量/每1公升水葡萄糖10克MgSO4·7H2O1克FeSO4·7H2O0.01克MnSO4·4-6H2O 0.01克盐酸硫胺素 0.2毫克d-生物素 0.05毫克(NH4)2SO45克Na2HPO4·12H2O 7.1克KH2PO41.36克琼脂 15克(2)4FG抗性突变株菌株的产生L-谷氨酸能力的确认约50个上述(1)所得的突变株菌株和亲代AJ 13029菌株产生谷氨酸的能力确认如下所述。
将AJ 13029和突变株菌株分别于31.5℃的CM2B琼脂培养基上培养20到30小时。然后培养在具有表4中所示的“培养基A”的液态培养中，而此培养是在31.5℃摇动培养。约22小时后加入表4中所示的最终浓度的B培养基。然后温度转移到37℃并再培养24小时。培养完全之后，以生物素分析仪(Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.)检验是否形成L-谷氨酸。结果发现50个菌株的培养中，有两个菌株的谷氨酸产量高于亲代菌株，且GDH活性较高(菌株A和菌株B)。测定此二菌株的GDH活性发现这两个菌株的特殊GDH活性皆增加(表5)。以E.R.Bormann et al.[Molecular Microbiol.,6,317-326(1996)]的方法测定GDH活性。分析GDH的碱基序列发现突变点只在GDH的启动子区域内(表6)。
表4发成分培养基A 培养基B葡萄糖3克/100毫升 5克/100毫升KH2PO40.14克/100毫升0.14克/100毫升MgSO4·7H2O 0.04克/100毫升0.04克/100毫升FeSO4·7H2O 0.001克/100毫升 0.001克/100毫升MnSO4·4H2O 0.001克/100毫升 0.001克/毫升(NH4)2SO41.5克/100毫升 2.5克/100毫升黄豆蛋白质水解水溶液 1.5克/100毫升 0.38毫升/100毫升盐酸硫胺素 0.2毫克/升0.2毫克/升生物素 0.3毫克/升0.3毫克/升抗发泡剂 0.05毫升/升 0.05毫升/升CaCO35克/100毫升 5克/100毫升pH7.0(以KOH调整)表5突变株菌株的谷氨酸形成和GDH活性菌株 Glu(g/dl)GDH比活性相对值AJ 130292.6 7.7 1.0FGR12.9 23.13.0FGR23.0 25.93.4表6突变株菌株GDH启动子区域中的碱基序列菌株 GDH启动子序列-35- 10AJ 13029 TGGTCATTCTGTGCGACACTGC CATAATFGR1 TGGTCATTCTGTGCGACACTGC TATAATFGR2 TTGTCAT-CTGTGCGACACTGC TATAAT实施例3导入突变到产生谷氨酸棒状菌的CS基因启动子区域内在此实施例中，一菌株能加强编码谷氨酸脱氢酶(GDH)和柠檬酸合成酶(CS)基因的启动子。(1)gltA基因的克隆棒状菌的gltA基因的碱基序列是编码柠檬酸合成酶，且已被证明[Microbial.140,l817-1828(1994)]。以这些序列为基础的合成引物显示在序列号7和序列号8。另一方面，使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)制作乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的染色体DNA。加入无菌水到0.5微克染色体DNA,10微微摩尔的各寡核苷酸，8微升dNTP混合物(每一各2.5毫摩尔浓度)，5微升10×La Taq缓冲液(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和2单位La Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的混合液中使其最终PCR反应液为50微升。此反应液于94℃30秒(变性)，55℃15秒(退火)和72℃3秒(延长的)条件下进行30循环的PCR，以热循环器TP 240(Takara Shuzo Co.,Ltd.)扩增包含gltA基因及其启动子的3 kbp DNA片段。之后以SUPRECO2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)纯化所得的扩增片段，然后使其平端。应用宝酒造公司的Bluntmg kit进行平端化处理。将此产物与SmaⅠ完全消化的pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)混合以连接起来。使用DNA连接试剂盒ver 2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)进行连接作用。连接反应完全后，将之转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)内。将转化产物涂到含有10微克/毫升IPTG(异丙基β-D-硫化半乳糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和40微克/毫升氯霉素的L培养基(含有10克/升bactotryptone，5克/升细菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升琼脂；pH7.2)。过夜培养之后，挑起白色菌落并单个培养这些转化菌落菌株。
以碱性方法(由日本生物工学会编辑和培风馆发行的生物工学实验书，p.105,1992)从已转化菌株制备质粒。并制备限制酶图谱，相同于显示在图2的限制酶图谱，命名为“pHSG 399CS”。(2)导入突变到gltA启动子中使用Mutan-Super Express Km(Takara Shuzo Co.,Ltd.)将突变导入gltA启动子区域内。此方法具体描述如下。以EcoRⅠ和SalⅠ完全消化pHSG 399CS以得到含有gltA基因的EcoRⅠ-SalⅠ片段，然后与用EcoRⅠ和SalⅠ完全消化的pKF 19kM(Takara Shuzo Co.,Ltd.)片段连接起来。连接完全之后将其转化到大肠杆菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受态细胞内。将转化产物涂于含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素(kanamycin)的L培养基。过夜培养之后，挑起白色菌落并分离单个菌落，获得转化体。从这些转化菌株中制备质粒并将那些含有gltA基因者命名为pKF 19CS。
使用pKF 19CS为模板和显示在序列号9,10及11的序列的末端磷酸化的合成DNA为引物以及附属在Mutan Super Express Km的选择引物。将PCR产物转化到大肠杆菌MV 1184(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受态细胞内。然后将转化产物涂于含有25微克/毫升卡那霉素的L-培养基。过夜培养之后，挑起出现的白色菌落，分离单个菌落，获得转化体。从这些转化菌株中制备质粒DNA。通过Sanger方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]以合成的序列号12 DNA序列测定gltA启动子位点的碱基序列。具体而言，以染剂终止测序试剂盒(AppliedBiosystems)和Genetic Analyzer ABl 310(Applied Biosystems)分析测定碱基序列。以显示在表7的序列所置换的gltA启动子区域的产物分别命名为pKF 19CS1,pKF 19CS2和pKF 19CS4。
表7-35区域 -10区域pKF 19CS ATGGCT TATAGCpKF 19CS1 ATGGCT TATAACpKF 19CS2 ATGGCT TATAATpKF 19CS4 TTGACA TATAAT(3)突变株gltA质粒的构建步骤(2)中所构建的pKF 19CS,pKF 19CS1,pKF 19CS 和pKF19CS4以SalⅠ和EcoRⅠ(Takara Shuzo Co.,Ltd.)完全消化。另一方面，具有衍生自质粒pAM 330[特开昭58-67699]而能在棒状菌中自动复制的复制起点的质粒pSFK 6(Japanese Patent Application No.Hei 11-69896)，使用EcoRI和SalⅠ完全分解，所得片段与含有gltA的2.5kb片段连接在一起。连接完全之后转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞内。将转化产物涂于含有10微克/毫升IPTG,40克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培养基。过夜培养之后，挑起白色菌落并分离出单个菌落，获得转化体。从转化菌株中制备质粒。这些含有gltA基因的质粒分别命名为pSFKC,pSFKC1,pSFKC2和pSFKC4。(4)测定突变株gltA质粒在棒状菌内的CS表达量将上述步骤(3)所构建的质粒导入乳酸发酵短杆菌ATCC 13869内。具体而言，此过程是以电脉冲法(特愿平2-07791)进行。使用含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培养基(包含10克/升bactotrypton,10克/升细菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升琼脂；pH7.0)于31℃筛选转化产物。培养两夜之后取得单个的菌落。这些含有pSKFC,pSKFC1,pSKFC2和pSKFC4的转化体分别命名BLCS,BLCS1,BLCS2和BLCS4。将转化体接种在含有表8中所示的成分的培养基中。然后于31℃培养到葡萄糖完全消耗完之前。离心培养液以分离菌体。以含有200毫摩尔浓度谷氨酸钠的50毫摩尔浓度tris缓冲液(pH7.5)清洗细胞，然后再以相同溶液悬浮之。以UD-201(TOMY)超声波破碎之后离心(10,000g)20分钟，移除剩余仍未破碎的细胞而得到一粗酶溶液。根据Methods Enzymol.13,3-11(1969)测定柠檬酸合成酶的活性。具体而言，将此粗酶溶液加入含有100毫摩尔浓度Tris HCl(pH8),0.1毫摩尔浓度DTNB,200毫摩尔浓度谷氨酸钠和0.3毫摩尔浓度乙酰基辅酶A的反应液中，然后以日立分光光度计在30℃,412nm测定其吸光度增加，以此最为背景值。更进一步，加入草醋酸至其最终浓度为0.5毫摩尔浓度。测定在412nm时增加的吸光度，从背景值推算获得柠檬酸合成酶的活性。以Protein Assay(BIO-RAD)测定粗酶溶液中的蛋白质浓度。使用牛血清白蛋白为标准蛋白质。结果显示在表9中。可以确认，与野生型gltA启动子相比，突变型gltA启动子的柠檬酸合成酶活性增加。
表8成分浓度葡萄糖50克/升KH2PO41克/升MnSO4·7H2O 0.4毫克/升FeSO4·7H2O 10毫克/升黄豆蛋白质水解物 20毫克/升生物素0.5毫克/升盐酸硫胺素2毫克/升2毫克/升表9菌株吸光度/分/毫克相对活性相对活性ATCC 13869 6.81.0ATCC 13869/pSFKC38.8 5.7 1.0ATCC 13869/pSFKC1 57.1 8.4 1.21ATCC 13869/pSFKC2 92.5 13.6 1.9ATCC 13869/pSFKC4 239.4 35.2 4.8(5)导入突变gltA基因到温度敏感性质粒内为将含有突变gltA启动子序列的基因整合插入到染色体中，则使用已知的在棒状菌内复制的温度敏感性质粒的方法来进行(特开平5-7491)。使用pSFKT7(特愿平11-81693)作为质粒载体，在棒状菌内其复制对温度敏感。使用SalⅠ和BstPⅠ完全消化pKFCS1,pKFCS2和pKFCS3并使其平端，作为突变gltA启动子序列。然后与已用SmaⅠ完全消化的pSFKT2连接起来。连接完全之后，转化到大肠杆菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd)的感受态细胞内。将转化产物涂于含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培养基。过夜培养之后，挑起白色菌落并分离单个菌落，获得转化体。从已转化品素中制备质粒。含有gltA基因的温度敏感性穿梭载体命名为pSFKTC1,pSFKTC2和pSFKTC4。(6)导入突变gltA启动子到染色体内将pSFKTC1,pSFKTC2和pSFKTC4以电脉冲法分别导入乳酸发酵短杆菌FGR2菌株。使用含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培养基于25℃筛选转化产物。导入之后所得的菌株培养于CM2B液态培养基，然后以稀释浓度为每一平板103到105cfu涂于含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上于34℃培养。如此，则具有温度敏感性的质粒的菌株由于在此温度之下质粒复制受到抑制而变成对温度敏感，所以不会形成菌落。另一方面，质粒DNA整合插入到染色体的菌株者因可形成菌落而能被筛选出来而取得个别分开的菌落。然后从此菌株提取染色体DNA作为模板，应用序列号8和13为引物进行PCR。之后确认约3kb的扩增片段。如此则证明此菌株已经由同源重组作用将衍生自温度敏感性质粒的突变gltA基因整合插入到宿主染色体接近gltA基因中。衍生自pSFKTC1，2和4的菌株分别命名为BLCS11,BLCS12和BLCS14。(7)gltA启动子-取代菌株的取得首先，从BLCS11，BLCS12和BLCS14菌株得到突变gltA基因通过同源性重组作用整合插入到染色体的卡那霉素敏感性菌株。将此质粒整合插入的菌株稀释后涂于CM2B平板上并于34℃培养。形成菌落之后复印到含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上，然后于34℃培养。如此则得到卡那霉素敏感性菌株。
从卡那霉素敏感性菌株中提取染色体作为模板，应用序列号7和8为引物进行PCR以制备gltA基因片段。然后使用SUPRECO2(TakaraShuzo Co，Ltd.)纯化后以序列号13为引物进行测序反应测定其中的启动子区域的序列。结果，与表7中的pKF19CS1启动子序列相同的菌株命名为GB01，与pKF19CS2启动子序列相同的菌株命名为GB02，以及和pKF 19CS4启动子序列相同的菌株命名为GB03。当质粒及复制的gltA基因从染色体被移除时，原先位于染色体上的野生型gltA基因也一起与载体质粒被移除，然而通过质粒导入的突变株gltA基因仍留在染色体上。此事实指出基因取代已发生。(8)gltA启动子突变株的柠檬酸合成酶的活性测定柠檬酸合成酶的活性测定可通过步骤(7)中所得到的FGR2,GB01,GB03和FGR2/pSFKC菌株以相同于步骤(4)的方法处理进行。结果显示在表10。结果确认gltA启动子取代的菌株的柠檬酸合成酶合性高于其亲代菌株。
表10菌株 吸光度/分/毫克相对活性FGR2 7.9 1.0GB01 9.5 1.2GB02 15.0 1.9GB03 31.6 4.0FGR2/pSFKC 61.6 7.8(9)gltA启动子取代菌株培养的结果将上述步骤(7)所得的每一菌株接种到含有表11中所显示的成分的接种培养基中，在31.5℃摇动培养24小时。取300毫升的具有显示在表11的成分的主要培养基于500毫升玻璃瓶发酵器中，然后加热灭菌。取40毫升的上述接种培养物接种到此培养基内。然后于31.5℃开始培养，其搅动速率及通气速率分别控制在800到1300rpm及1/2到1/1vvm。以气态氨维持培养液pH值为7.5。初始培养8小时之后将温度转移到37℃。得20到40小时内葡萄糖完全消耗时就终止培养，而L-谷氨酸则形成且累积于培养液中，测定培养液中L-谷氨酸的含量。
结果如表12中所显示，GB02和GB03菌株的L-谷氨酸产量有较大改进，而非GB01及FGE2/pSFKC菌株。从这些事实得知这些菌株的谷氨酸产量增加，通过导入突变到gltA启动子中可增加CS活性2到4倍的好结果。
表11浓度成分 接种培养基主要培养基葡萄糖50克/升 150克/升KH2PO41克/升2克/升MgSO47H2O 0.4克/升 1.5克/升FeSO47H2O 10毫克/升 15毫克/升MnSO44H2O 10毫克/升 15毫克/升黄豆蛋白质水解物 20毫克/升 50毫克/升生物素0.5毫克/升2毫克/升盐酸硫胺素2毫克/升 3毫克/升表12菌株L-谷氨酸(克/升)FGR28.9GB 01 9.1GB 02 9.4GB 03 9.4FGR2/pSFKC 9.1实施例4导入突变到谷氨酸产生菌棒状菌的ICDH基因启动子区域中在此实施例中制备一菌株，能增强编码谷氨酸脱氢酶，柠檬酸合成酶和异柠檬酸合成酶基因的启动子。(1)gltA基因的克隆编码棒状菌柠檬酸合成酶基因的icd基因碱基序列已被证实[J.Bacterio1.177,774-782(1995)]。以此序列为基础，合成如序列号14和15的引物。使用乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的染色体DNA为模板进行PCR，扩增含有icd基因及其启动子的3kbp DNA片段。所得的扩增片段以EcoRⅠ完全消化，然后与已用EcoRⅠ完全消化的pHSG 399(Takara Shuzo Co.,Ltd.)混合以连接起来。完全连接之后转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞内。将转化产物涂到含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和40微克/毫升氯霉素的L-培养基上。过夜培养之后，挑起白色菌落并分别培养这些转化菌株得到转化体。
携带icd基因的质粒命名为pHSG 399icd。(2)导入突变到icd启动子内icd基因启动子的正确位点目前尚未确定。研究增加icd基因mRNA转录量的可能性，是通过人为修饰编码ICDH基因的上游序列成启动子类似序列而得知。具体而言，在ICDH蛋白质的第一个ATG的上游约190bp(第一个启动子)和约70 bp(第二个启动子)的位于-10类似区域的DNA序列中导入突变。使用Mutan-Super Express Km(Takara ShuzoCo,Ltd.)导入突变到icd基因上游区域内。此方法具体叙述如下。使用PstⅠ完全消化pHSG 399icd以得到含有icd基因启动子的PstⅠ片段。然后将此片段与已使用PstⅠ完全消化的pKF18kM(Takara Shuzo Co.,Ltd.)连接在一起。完全连接之后转化到大肠杆菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd)感受态细胞内。将转化产物涂到含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培养基上。过夜培养之后，挑起白色菌落并分别培养这些转化菌株。从转化菌株中制备质粒，并命名含有icd基因启动子的质粒为pKF18icd。
使用pKF18icd为模板，及序列号16,17,18,19,20和21的5，末端磷酸化合成DNA及一筛选引物进行PCR。将PCR产物转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞内。将转化产物涂于含有25微克/毫升卡那霉素的L-培养基上。过夜培养之后分别得到个别的已转化菌株菌落。从被转化菌株中制备质粒DNA，并以序列号22的合成DNA使用Sanger的方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]测定icd启动子位点的碱基序列。具体而言，使用染剂终止测序试剂盒(Applied Biosystems)测定碱基序列，并使用Genetic Analyzer ABI 310(Applied Biosystems)进行分析。以表7中所显示的序列置换icd启动子区域所得的质粒分别命名为pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5hdrpKFl8ICD 6。其中，以PstI完全消化pKFl8ICD2得到含有icd基因的启动子PstⅠ片段。将此片段与已使用PstⅠ完全消化的pKFl8KM(TakaraShuzo Co.,Ltd.)连接起来。完全连接之后，转化到大肠杆菌JM 109(Takara Shuzo Co,Ltd.)感受态细胞内。将转化产物涂于含有10微克/毫升IPTG,40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培养基上。过夜培养之后，挑起白色菌落并分别培养这些转化菌株。从被转化菌株中制备质粒，并将含有icd基因启动子者命名为pKFl8ICD2。使用pKFl8ICD2为模板，及序列号20和21的5′末端磷酸化合成DNA及一筛选引物进行PCR。将PCR产物转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞内。将转化产物涂于含有25微克/毫升卡那霉素的L-培养基上。过夜培养之后，分别得到个别的已转化菌株菌落。从被转化菌株制备质粒DNA，并以序列号22的合成DNA测定位于icd启动子位点内的碱基序列。以表13中所显示的序列置换icd启动子区域所得的质粒分别命名为pKFl8ICD25和pKFl8ICD26。
表13质粒 第一个启动子 第二个启动子-35-10 -35 - 10pKFl8ICD GCGACT GAAAGT TTTCCA CACCATpKFl8ICD01 GCGACT TATAAT TTTCCA CACCATpKFl8ICD02 TTGACA TATAAT TTTCCA CACCATpKFl8ICD03 TTGACT TAAAGT TTTCCA CACCATpKFl8ICD04 GCGACT TAAAGT TTTCCA TATAATpKFl8ICD05 GCGACT GAAAGT TTGCCA TATAATpKFl8ICD06 GCGACT GAAAGT TTGACA TATAATpKFl8ICD25 TTGACA TATAAT TTGCCA TATAATpKFl8ICD26 TTGACA TATAAT TTGACA TATAAT(3)测定启动子活性用质粒的构建为更简单测定启动子活性，利用报告基因来间接测定启动子活性是可行的。理想的报告基因的特性是其活性能简单被测定，甚至当一氨基酸加到N-末端时其活性并不会显著变低，且不能产生背景反应，并具有适合基因操作的限制酶切位点。因为大肠杆菌的β半乳糖苷酶(LacZ)被广泛使用作为报告基因，且棒状杆菌属没有乳糖同化能力的基因[J.Gen.Appl.Microbiol.,18,399-416(1972)]，因此应用LacZ是适宜的报告基因。然后构建携带LacZ作为报告基因的质粒pNEOL(图3)。此构建过程详细叙述如下。使用得自大肠杆菌ME 8459(ME8459存放于基因学国家研究所(日本))的染色体DNA为模板，显示在序列号23和24的合成DNA为引物进行PCR。使用SmaⅠ和BamHⅠ完全消化此PCR产物，然后与已用HindⅢ消化并平端的pKF3(TakaraShuzo Co,Ltd.)片段连接在一起。完全连接之后，转化到大肠杆菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受态细胞内。将转化产物涂于含有25微克/毫升卡那霉素的L-培养基上。过夜培养之后，分别得到个别的已转化菌株菌落。从被转化菌株中制备质粒。其中取一质粒命名为pKF3nptⅡ。然后使用SalⅠ分解pKF3nptⅡ。另一方面，按实施例1(1)中所叙述的使用SmaⅠ和SalⅠ完全消化并平端pSAK4。将这些片段连接在一起以构建一穿梭载体pNEO，它可在棒状杆菌中复制。此质粒对氯霉素和卡那霉素具抗性。更进一步，使用SmaⅠ和Sse 83871完全消化pNEO。所得的结果片段与已使用PstⅠ和SmaⅠ完全消化的pMC 1871(FarmaciaBiotech)连接在一起。如此，pNEOL能在棒状菌中复制，且具有N端缺乏第8氨基酸的LacZ的报告基因的穿梭载体就构建完成了(参阅图3)。(4)突变株icd启动子活性的测定上述步骤(2)中所构建的具有突变icd启动子的质粒，亦即pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5,pKFl8ICD6,pKFl8ICD25,pKFl8ICD26和pKFl8ICD等，使用SacⅡ和PstⅠ完全分解然后平端。之后与已使用SmaⅠ切割的pNEOL片段连接起来。完全连接之后转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞内。将转化产物涂于含有IPTG，X-Gal和40微克/毫升氯霉素的L-培养基中。过夜培养之后，挑起蓝色菌落并分别培养这些转化菌株。
从已转化菌株中制备质粒。具有能产生ICDH和LacZ融合蛋白质的结构的质粒命名为pNEOICD1,pNEOICD2,pNEOICD3,pNEOICD4,pNEOICD5,pNEOICD6,pNEOICD25,pNEOICD26和pNEOLICD。使用电脉冲法将这些质粒和pNEOL导入乳酸发酵短杆菌ATCC 13869内。这些转化产物的筛选是使用含有25微克/毫升卡那霉素和40微克/毫升X-Gal的CM2B平板培养基(含有10克/升bactotryptone,10克/升细菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升琼脂，pH7.0)在31℃培养两晚。完全导入之后，形成菌落并分别挑起单个的菌落。含有pNEOICD1,pNEOICD2,pNEOICD3,pNEOICD4,pNEOICD5,pNEOICD6,pNEOICD25,pNEOICD26和pNEOLICD的转化产物分别命名为BLAC1,BLAC2,BLAC3,BLAC4,BLAC5,BLAC6,BLAC25,BLAC26,BLAC和BNEOL。除了BNEO之外，全部转化产生形成蓝色菌落。如实施例3中的步骤(4)的相同方法，从转化产物制备粗制的酶溶液，除了将细胞改为由“Z-缓冲液”(含有10毫摩尔浓度KCl，1毫摩尔浓度MgSO4,270微克/100毫摩尔浓度2-ME和NaPi,pH7.5)的缓冲溶液清洗及悬浮之。LacZ的活性测定如下Z-缓冲液与粗制的酶溶液混合。将ONPG溶于Z-缓冲液中至最终浓度为0.8毫克/毫升加入到反应混合物中，以Hitachi分光光度计U-3210于30℃测量在420nm的增加吸光度。所得值即为LacZ的活性。粗制的酶溶液中的蛋白质浓度以Protein Assay(BIO-RAD)测定。使用半血清白蛋白作为标准蛋白质。结果显示在表14中。结果确认具有icd启动子突变的发现ICDH-LacZ融合蛋白质的菌株的LacZ活性高于表达野生型ICDH-LacZ融合蛋白质的菌株。
表14菌株 吸光度/分/毫克 相对活性BNEOL未测定 0.0BNEOLI 42 1.0BNEOLI-1 84 2.0BNEOLI-2 168 4.0BNEOLI-3 80 1.9BNEOLI-4 126 3.0BNEOLI-5 139 3.3BNEOLI-6 84 2.0BNEOLI-25 168 4.0BNEOLI-26 170 4.0(5)将突变株icd基因导入温度敏感性质粒内在棒状菌内质粒载体pSFKT2(特愿平11-81693)是温度敏感性的复制子。使用PstⅠ完全消化pKFl8ICD1,pKFl8ICD2,pKFl8ICD3,pKFl8ICD4,pKFl8ICD5,pKFl8ICD6,pKFICD25和pKFICD26,所得的片段使用作为突变的icd启动子。然后将此片段与已使用PstⅠ完全消化的pSFKT2连接起来。完全连接之后将之转化到大肠杆菌JM 109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受态细胞内。将转化产物涂于含有10微克/毫升IPTG，40微克/毫升X-Gal和25微克/毫升卡那霉素的L-培养基上。过夜培养之后，挑起白色菌落并分别培养这些转化菌株。从已转化菌株中制备质粒。含有icd启动子的温度敏感性穿梭载体分别命名为pSFKTI1,pSFKTI2,pSFKTI3,pSFKTI4,pSFKTI5,pSFKTI6,pSFKTI25和pSFKTI26。(6)将突变株icd启动子导入染色体内使用电脉冲法将上述步骤(5)中构建的质粒个自导入乳酸发酵短杆菌GB 02菌株中。此转化产物的筛选是在25℃,使用含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培养基(含有10克/升bactotryptone，10克/升细菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl,10微克/升生物素和15克/升琼脂，pH7.0)。导入之后，将培养在CM2B液态培养基中所得的菌株涂到含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上，以每一平板稀释为103到105cfu的浓度于34℃培养。如此，则具有温度敏感性的质粒的菌株由于在此温度之下质粒复制受到抑制而变成对卡那霉素敏感，所以不会形成菌落。另一方面，质粒DNA整合插入到染色体菌株者因可形成菌落而能被筛选出来而取得单个分开的菌落。从此菌株中提取染色体DNA作为模板，序列号13和15为引物进行PCR。之后确认约3kb的扩增片段。如此则证明此菌株已经由同源性重组作用将衍生自温度敏感性质粒的突变icd基因整合插入到宿主染色体icd基因的邻近位点。(7)icd启动子取代菌株的取得首先，从如步骤(6)中的叙述通过同源性重组作用将突变icd基因整合插入到染色体的菌株中得到卡那霉素敏感性菌株。将此质粒整合插入的菌株稀释后涂于CM2B平板上并于34℃培养。形成菌落之后于含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上培养。如此则得到卡那霉素敏感性菌株。
从卡那霉素敏感性菌株中提取染色体作为模板，序列号14和15为引物进行PCR以制备icd基因片段。然后使用SUPRECO2(Takara ShuzoCo.,Ltd.)纯化后以序列号22为引物进行测序反应测定其中的启动子区域的序列。结果，具有衍生自pSFKTI1,pSFKTI2,pSFKTI3,pSFKTI4,pSFKTI5,pSFKT16,pSFKT125和pSFKT126的icd启动子序列者分别命名为GC01,GC02,GC03,GC04,GC05,GC06,GC25和GC26。当质粒及复制的icd基因从染色体被移除时，原先位于染色体上的野生型icd基因也一起与载体质粒被移除，然而通过质粒导入的突变icd基因仍留在染色体上。(8)icd启动子突变株的异柠檬酸脱氢酶的活性测定使用上述步骤(7)中所得的8个菌株及GB02菌株应用实施例3(7)中相同方法制备ICDH粗制的酶溶液。ICDH活性的测定如下将粗制的酶溶液加到含有35毫摩尔浓度Tris HCl(pH7.5)，1.5浓度MnSO40.1毫摩尔浓度NADP和1.3毫摩尔浓度异柠檬酸的反应溶液中，在30℃使用Hitachi分光光度计U-3210测定340nm时的吸光度增加情形。使用Protein Assay(BIO-RAD)测定粗制的酶溶液中的蛋白质浓度。结果显示在表15中。结果确认icd启动子取代菌株的异柠檬酸脱氢酶的活性高于亲代菌株。
表15菌株 吸光度/分/毫克 相对活性GB 02 3.91.0GC 01 8.21GC 02 19.1 4.9GC 03 7.01.8GC 04 12.5 3.2GC 05 19.1 4.9GC 06 10.5 2.7GC 025 30.4 7.8GC 026 24.2 6.2(9)icd启动子取代菌株的培养结果如实施例3中步骤(9)的相同方法培养上述步骤(7)中的8个菌株。结果确认使用菌株GC02,GC04,GC05,GC25和GC26时其L-谷氨酸产量有改善，如表16中所显示。结果发现导入突变到icd启动子中所得的菌株的ICDH活性至少增加3倍。
表16菌株 L-谷氨酸(g/l)GB02 9.2GC01 9.0GC02 9.5GC03 9.1GC04 9.4GC05 9.6GC06 9.2GC25 9.9GC26 9.8实施例5在棒状菌谷氨酸产生细菌的PDH基因启动子区域导入突变(1)从棒状菌中克隆pdhA基因合成的引物序列号25和26，是筛选自大肠杆菌，绿脓杆菌和结核杆菌的丙酮酸脱氢酶(PDH)的E1亚单位中具有高同源性的区域。使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)从乳酸发酵短杆菌ATCC 13869中制备染色体DNA作为模板，在PCRTechnology(H.Erlich编辑，Stockton Press发行，1989)第8页所叙述的标准反应条件下进行PCR。然后将反应液载入琼脂凝胶中进行电泳以确定约1.3 kb的DNA片段被扩增。使用合成性的序列号25和26的DNA从两末端测定所得的碱基序列。以Sanger的方法[J.Mol.Biol.,143,161(1980)]利用DNA测序试剂盒(Applied Biosystems Co.)测定碱基序列。将测定的碱基序列翻译为氨基酸，并与大肠杆菌，绿脓杆菌和结核杆菌的丙酮酸脱氢酶的E1亚单位比较，因发现其中的同源性区域高。结果判断认为PCR扩增的DNA片段是编码乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的丙酮酸脱氢酶E1亚单位的pdhA基因的一部分。因此进一步克隆此基因的上游及下游。克隆方法如下使用限制酶EcoRⅠ,BamHⅠ,HindⅢ,PstⅠ,SalⅠ和XbaⅠ(Takara Shuzo Co.,Ltd.)消化乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的染色体以得到DNA片段。序列表中的引物序列号27和28使用于克隆上游部分，引物序列号29和30使用于克隆下游部分。利用LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)进行克隆。使用该试剂盒进行PCR的结果，以EcoRⅠ,HindⅢ,PstⅠ,SalⅠ和XabⅠ分解从上游位点分别扩增出0.5,2.5,3.0,1.5和1.8 kb的DNA片段；以及使用BamHⅠ,HindⅢ和PstⅠ分解从下游位点分别扩增出1.5,3.5和1.0kb的DNA片段。DNA片段的碱基序列以上述的相同方法测定。结果发现此扩增的DNA片段更进一步包含一约920个氨基酸的开放读码相及一位于上游的假设启动子区域。由于此开放读码相的碱基序列的氨基酸产物与已知的大肠杆菌丙酸酸脱氢酶的E1亚单位具高度同源性，因此显然此开放读码相是编码乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的丙酸酸脱氢酶E1亚单位的pdhA基因。此开放读码相的碱基序列显示在序列表中的序列号31。序列表中的序列31，也显示从碱基序列所预测的氨基酸产物的序列。由于位于蛋白质N端的甲硫氨酸残基是衍生自起始密码ATG，此氨基酸通常不是蛋白质的功能所必需，因此目前已知此甲硫氨酸残基在翻译之后会通过胜肽酶作用而被移除。上述的蛋白质其N端的甲硫氨酸残基可能已被移除。然而，在序列表中序列号31的ATG上游6个碱基存在的GTG序列，可能从这儿氨基酸被翻译。其它微生物譬如大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶是由三个次单元E1，E2和E3所组成，且他们的编码基因通常是操纵子。然而在pdhA基因3kb下游中并没有可能是丙酮酸脱氢酶E2和E3亚单元的开放读码相。但很清楚的是，位于开放读码相下游存在一终止子。从这些事实推测，乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的丙酮酸脱氢酶E2和E3亚单元是位于染色体的另一位点上。(2)构建一质粒用以扩增pdhA目前已有一菌株是将编码大肠杆菌的PDH三个亚单位的基因导入乳酸发酵短杆菌ATCC 13869中，而得到一谷氨酸产量增强的菌株(特愿平10-360619)。然而，乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的PDH中只有编码E1亚单位的pdhA基因被克隆到，且不知单独扩增此基因是否能改善氨基酸的产量。在此情形下，因此想单独扩增pdhA基因看看是否可有效改善氨基酸的产量。
以已克隆的碱基序列为基础合成显示在序列号33和34的引物。使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)制备乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的染色体为模板，依据PCR Technology(H.Erlich编辑，Stockton Press发行，1989)第8页上叙述的标准反应条件进行PCR以扩增pdhA基因。序列号33的合成引物是对应到序列表中序列号32中的pdhA基因第1397碱基到1416碱基。序列号34则是一其碱基为序列表中序列号32中的第5355到5374碱基负链的引物，从5′位点表示。
利用常用方法纯化PCR产物，然后与限制酶SalⅠ和EcoT221作用。将此片段与已用SalⅠ和PstⅠ切割的pSFK(特愿平11-69896)经由连接试剂盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)连接在一起。之后转化到大肠杆菌JM109(Takara Shuzo Co.,Ltd.)感受态细胞内，将转化产物涂于含有10微克/毫升IPTG(异丙基-β-D-硫化半乳糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那霉素的L-培养基(含有10克/升bactotryptone，5克/升细菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升琼脂，pH7.2)。过夜培养之后，挑起白色菌落并单个培养这些被转化的菌落菌株。
以碱性方法(由日本生物工学会编辑和培风馆发行的实验工学实验书，p.105,1992)从已转化菌株制备质粒。测定插入到载体中DNA片段的限制酶图谱，并与序列表中序列号32所发表的pdhA基因的限制酶图谱作比较，含有DNA片段的质粒若其插入段有相同限制酶图谱者命名为pSFKBPDHA。(3)将pSFKBPDHA导入到乳酸发酵短杆菌ATCC 13869和GC25中并评价其发酵实验使用电脉冲法(特开平2-207791)将质粒pSFKBPDHA转化到乳酸发酵短杆菌ATCC 13869和GC25内而得到已转化菌株。通过导入质粒pSFKBPDHA到乳酸发酵短杆菌ATCC 13869和GC25而得的产生L-谷氨酸转化菌株ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA的培养如下将所得的ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA的培养如下将所得的ATCC 13869/pSFKBPDHA和GC25/pSFKBPDHA细胞培养在含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培养基之后，所得的细胞接种到一培养基中(每1公升包括80克葡萄糖，1克KH2PO4,0.4克MgSO4·7H2O,30克(NH4)2SO4,0.01克FeSO4·7H2O,0.01克MnSO4·7H2O,15毫升黄豆蛋白质水解物，200微克盐酸硫胺素，60微克生物素，25毫克卡那霉素和50克CaCO3；使用KOH调整pH到8.0)。于31.5℃摇动培养至培养基中的糖分消耗完。所得产物再接种到上述的相同成分的培养基(用于GC25/pSFK6和GC25/pSFKBPDHA)，或删除生物素的相同成分培养基(用于ATCC 13869/pSF6和ATCC 13869/pSFKBPDHA)，以5％的量于37℃摇动培养至糖分被消耗完。对照组是使用电脉冲法(参考特开平2-207791公报)将质粒pSFK6转化到乳酸发酵短杆菌ATCC 13869和GC25中所得的菌株，pSFK6是得自棒状杆菌的可以自动复制的质粒，然后如上述的相同方法培养。完全培养之后，使用Biotic Analyzer AS-210(Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.)测定培养基中L-谷氨酸累积的量。结果如表17中所示。
表17菌株 L-谷氨酸生成率(％)ATCC 13869/pSFK6 3.6ATCC 13869/pSFKBPDHA 3.8GC25/pSFK6 5.1GC25/pSFKBPDHA 5.3从这些结果显示在乳酸发酵短杆菌ATCC 13869和GC25中单一扩增pdhA基因，能明显有效改善谷氨酸的产量。(4)构建质粒用以测定突变的pdhA启动子活性为制备丙酮酸脱氢酶(PDH)的突变启动子，将乳酸发酵短杆菌ATCC 13869已克隆的pdhA基因先测定其启动子区域，通过不同的启动子区域修饰来测定表达量的差异，可利用β-半乳糖苷酶活性来测定。
从已克隆且证明的碱基序列推算pdhA基因的启动子位点，结果推测很有可能位于序列表中序列号32的第2252到22257及2279到2284的碱基，分别是位于-35区域及-10区域。因此合成序列表中序列号35和36中的引物，以来自乳酸发酵短杆菌ATCC 13869染色体DNA为模板进行PCR，扩增含有pdhA基因启动子区域的DNA片段。合成的引物中，序列号35对应到序列号32中的碱基2194到2221；但碱基2198已用C取代，且碱基2200和2202已用G取代，且限制酶SmaⅠ的识别序列已被插入。序列号36对应到序列号32中的碱基2372到2398；但碱基2393和2394已用G取代，且具有限制酶SmaⅠ的识别序列的反链，从5′位点表示。使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)制备乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的染色体作为模板，以PCR Technology(H.Erlich编辑，Stockton Press，1989)第8页所叙述的标准反应条件下进行PCR来扩增pdhA基因的启动子区域。利用常用的一般方法纯化所得的PCR产物，然后使用限制酶SmaⅠ作用之。将此片段与已用限制酶SmaⅠ(实施例4(3))切割的pNEOL连接在一起，pNEOL能在缺乏LacZ基因启动子区域的棒状菌中复制(使用连接试剂盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.))。之后转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞内(Takara Shuzo Co.,Ltd.)，然后将转化产物涂于含有40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那霉素的L-培养基上(含有10克/升bactotryptone，5克/升细菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升琼脂，pH7.2)。过夜培养之后，挑起蓝色菌落并分别培养这些转化菌株。使用碱性方法(日本生物工学会编辑，以及培风馆发行的生物工学实验书，p.105，1992)从已转化菌株中制备质粒。通过一般方法测定插入到载体的DNA片段的序列之后，含有此插入段DNA片段的质粒命名为pNEOLBPDHAprol。
更进一步，为构建质粒而合成的位于序列表中的序列号37,38和39的引物，其中假设是启动子位点的区域已改变为棒状菌启动子的共有序列。使用乳酸发酵短杆菌ATCC 13869染色体DNA为模板，各引物及序列号36的引物进行PCR，所扩增的DNA片段中的pdhA基因启动子区域已改变为共有序列。在合成的引物中，序列号37对应到序列号32中的碱基2244到2273；而碱基2255已被C取代，和碱基2257已被A取代；且只有-35区域已被改为棒状菌的共有序列。序列号38对应到序列号32中的碱基2249到2288；碱基2279和2281已被T取代；且只有-10区域已被改为棒状菌的共有序列。序列号39对应到序列号32的碱基2249到2288；碱基2255已被C取代，碱基2257已被A取代；以及碱基2279和2281已被T取代；且-35区域和-10区域皆改为棒状菌的共有序列。使用细菌基因组纯化试剂盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)制备乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的染色体作为模板，以PCR Technology(H.Erilich编辑，Stockton Press发行，1989)第8页所述的标准反应条件下进行PCR，利用这些引物扩增pdhA基因的启动子区域，其中的启动子区域改为共有序列。所得的PCR产物以常用方法纯化，然后以限制酶SmaⅠ作用之。将此片段与已用限制酶SmaⅠ切割的pNEOL利用连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)连接起来，其中的pNEOL能在缺乏启动子区域的lacZ基因的棒状菌中复制。之后转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)内，将转化产物涂于含有40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和25微克/毫升卡那霉素的L-培养基(包含10克/升bactotryptone，5克/升细菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升琼脂，pH7.2)。过夜培养之后，挑起蓝色菌落并分别培养这些转化菌株。使用碱性方法(日本生物工学会编辑，以及培风馆发行的生物工学实验书，p.105,1992)从已转化菌株中制备质粒。通过一般方法测定插入到载体的DNA片段的序列，其中只有-35区域已改为共有序列的质粒命名为pNEOLBPDHApro35；所含的DNA片段中的序列只有-10区域已改为共有序列的质粒则命名为pNEOLBPDHApro10；且若质粒所含的DNA片段的-35区域及-10区域皆改为共有序列者则命名为pNEOLBPDHApro3510 。(5)突变株pdhA启动子活性的估计使用电脉冲法(特开平2-207791)将这里构建的质粒pNEOLBPDHApro1，pNEOLBPDHApro10和pNEOLBPDHApro3510和命名的质粒转化到乳酸发酵短杆菌ATCC 13869中而取得被转化菌株。以实施例4(4)中所叙述的方法测定所得的转化产物的β-半乳糖苷酶活性。启动子区域的序列改为共有序列之后的β-半乳糖苷酶活性显示在表18中，其中将具有pdhA基因启动子区域的β-半乳糖苷酶酶活性定为1。
表18菌株 β-半乳糖苷酶活性(相对值)ATCC 13869/pNEOLBPDHAprol 1ATCC 13869/pNEOLBPDHApro106ATCC 13869/pNEOLBPDHApro3510 7.5这些结果指出假设的启动子位点为pdhA基因的启动子，且可通过改变此区域的序列为共有序列而改变pdhA的表达(增加)。此事实表示通过改变PdhA基因的启动子区域，就能不需使用质粒而改变表达量。(6)构建质粒用以制备启动子突变的菌株由于已证明可通过在启动子导入突变而改变PdhA的表达，因此构建质粒用以制备PdhA基因启动子变化的菌株。为构建启动子变化的菌株，因此构建三种质粒。此三质粒分别是其中的-35区域，-10区域和两区域皆改为共有序列。
以已被克隆的碱基序列为基础，新合成序列号40和41中的引物。在合成的引物中，序列号40是一反链，其碱基序列对应于序列号32中的碱基2491到2521的反链，其表示法是从5′开始，且在5′末端附着上3个A和4个T。序列号33是一反链，对应于序列号32中的pdhA基因的碱基5020到5039的反链，其表示法是从5′开始。使用序列号33和40为引物，以细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)所制备的乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的染色体为模板，在PCR Technology(H.Erilich编辑，Stockton Press发行，1989)第8页所叙述的标准反应条件下进行PCR。更进一步使用序列号15和17为引物，乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的染色体为模板进行PCR。使用常用方法纯化所得到的PCR产物。然后使用通过序列号9和16为引物进行PCR，以及使用序列号39和41的PCR产物及序列号33和41为引物进行PCR。PCR条件如下在反应液中此四个DNA浓度为10微摩尔浓度，没有使用模板，并使用La tag(Takara Shuzo Co.,Ltd.)。使用一般常用方法纯化PCR产物后与限制酶SalⅠ和XhoⅠ作用。所得片段利用连接试剂盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)与已用限制性酶SolⅠ切割的温度敏感性质粒pSFKT2连接在一起，而pSFKT2能在棒状菌中复制。之后转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞(Takara Shuzo Co.,Ltd.)内，转化产物涂有含有10微克/毫升1PTG(异丙基-β-半乳糖苷)，25微克/毫升卡那霉素和40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的L-培养基(包含10克/升bactotryptone，5克/升细菌酶母菌萃取物，5克/升NaCl和15克/升琼脂，pH7.2)。过夜培养之后，挑起白色菌落并分别培养这些被转化的菌落菌株。使用碱性方法(由日本生物工学会编辑，培负馆发行的生物工学实验书，p.105,1992)从已转化菌株中制备质粒。之后测序插入到载体的DNA片段，然后与序列号32中所发表的pdhA基因的碱基序列作比较。含有DNA片段的质粒，其中的DNA片段序列只有启动子的-35区域和-10区域改为棒状菌的共有序列，将此质粒命名为pSFKTPDHApro3510。
质粒中的pdhA基因启动子-35区域改为棒状菌的共有序列，和pdhA基因启动子-10区域改为棒状菌共有序列的质粒，除了分别以序列表中的序列号37和39取代序列号39以外，皆是以上述相同方法构建的。这些质粒分别命名为pSFKTPDHApro35和pSFKTPDHApro10。(7)启动子突变菌株的制备pdhA基因启动子突变菌株的制备是通过同源性重组作用，利用上述步骤(6)中用于制备启动子突变菌株所构建的质粒来进行。
首先，通过电脉冲法(特开平2-207791)将质粒pSFKTPDHApro3510转化到GC 25用以制备启动子突变菌株。之后转化产物涂于CM2B平板培养基(包括10克/升聚蛋白胨，10克/升细菌酵母菌萃取物，5克/升NaCl，10微克/毫升生物素和15克/升琼脂，pH7.2)并在25℃培养以获取被转化菌株。将此产物于含有CM2B液态培养基的试管中培养过夜。然后涂于含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培养基，在34℃培养以获取含有通过同源性重组作用将质粒pSFKTPDHApro 3510插入到染色体中的一次转化菌株。分离出单一菌落之后，湿涂于CM2B平板培养基在31.5℃培养。菌落开始出现之后，此产物能在含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培养基中复制而得到卡那霉素敏感性菌株。由于有两种菌株，亦即具有野生型pdhA基因启动子位点的菌株，和另一具有突变导入的菌株，因此测序此部分。如此可获得将突变导入pdhA基因启动子位点的启动子突变菌株。在此菌株中，pdhA基因的启动子-35区域和-10区域已改为棒状菌的共有序列。此菌株命名为GD 3510。
除了以质粒pSFKTPDHApro35和pSFKTPDHApro10取代质粒pSFKTPDHApro3510用以制备启动子突变菌株之外，使用上述的相同方法获取pdhA基因启动子的-35区域和-10区域已改为棒状菌共有序列的菌株。它们分别命名为GD 35和GD 10。(8)pdhA基因启动子突变菌株的锥形瓶培养结果的评估将上述所得的三种pdhA基因启动子突变菌株在锥形瓶中培养以产生L-谷氨酸。将培养于CM2B平板培养基中的启动子突变菌株GD3510,GD 35,GD 10和GC 25细胞接种于培养基中(每公升水含有30克葡萄糖，1克KH2PO4,0.4克MgSO4·7H2O,30克(NH4)2SO4,0.01克FeSO4.7H2O,0.01克MnSO4.7H2O,15毫升黄豆水解物，200微克盐酸硫胺素，60微克生物素和50克CaCO3；使用KOH调整pH到8.0)。然后在31.5℃摇动培养到培养基中的糖分消耗为止。所得的产物接种到上述相同成分的培养基中，以5％的量于37℃摇动培养到培养基中的糖分消耗为止。培养完全之后，使用Biotic Analyzer AS-210(AsahiChemical Industry Co.,Ltd.)测定液态培养基中所累积的L-谷氨酸数量。结果显示于表19中。
表19菌株 L-谷氨酸(克/100毫升)GC 25 1.9GD 35 2.0GD 10 2.0GD 35102.1从这些结果得知所获得的启动子突变菌株可提供增强的谷氨酸产量。实施例6导入突变到棒状菌精氨酰琥珀酸合成酶基因的启动子区域内(1)argG基因上游的碱基序列的测定为了以PCR扩增黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)的argG基因，因此需测定此ORF上游及下游区域的碱基序列。以已知的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicom)argG的ORF碱基序列(GenBank登记号AF 030520)为基础合成引物，并使用体外LA PCR克隆试剂盒(Takara Shuzo Co.,Ltd.)依据其说明书进行碱基序列的测定。这些引物特别使用具有位于序列号42和43中的碱基序列的寡核苷酸(引物1和2)用于上游区域，以及具有位于序列号44和45中的碱基序列的寡核苷酸(引物3和4)用于下游区域。将野生型菌株的黄色短杆菌2247菌株(ATCC 14067)的染色体DNA，以限制酶EcoRⅠ完全消化，使用引物2或3进行第1次PCR，和使用引物1或4进行第2次PCR来测定argG上游及下游的碱基序列。(2)启动子位点的预测将上述序列以购买的软件(GENETYX)预测argG基因ORF的上游区域中类似启动子的序列。将突变导入最高分数(约第一个ATG的上游120bp)的位点。然后测量此启动子的活性。(3)导入突变到启动子序列中，并测定突变株启动子的活性使用突变导入引物9，10,11,12或13和7(具有序列号50,51,52,53,54或58)用于最高分数的位点，以AJ 12092菌株的染色体DNA为模板进行第一次PCR。使用PCR产物作为3′位点的引物，以及具有序列号49的引物8作为5′位点的引物，相同的染色体DNA作为模板进行第二次PCR，在可能是启动子的部分获得具有突变导入其中的DNA片段。为测定此突变株启动子的活性，将这些DNA片段插入到启动子探针载体pNEOL的SmaⅠ位点，而能得到与LacZ报告基因相同方向的质粒pNEOL-1,pNEOL-2,pNEOL-3,pNEOL-4和pNEOL-7。使用引物7和8,AJ 12092菌株染色体DNA为模板进行PCR所得的DNA片段同样插入质粒pNEOL的LacZ报告基因的上游而获得对照组质粒pNEOL-0。
将pNEOL-0,pNEOL-1,pNEOL-2,pNEOL-3,pNEOL-4和pNEOL-7导入AJ 12092菌株内。使用电脉冲法(特开平2-207791)将质粒导入。把每一转化产物涂于含有4微克/毫升氯霉素的CM2G平板培养(每1公升纯水包含10克聚蛋白胨，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克琼脂，pH7.2)，并筛选氯霉素抗性菌株。
将这些菌株——涂于琼脂培养基(含有0.5克/100毫升)葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白胨，1克/100毫升酵母菌萃取物，0.5克/100毫升NaCl和5微克/升氯霉素)，在31.5℃培养20小时。取所得的其中一细胞接种到一培养基中[包含3克/100毫升葡萄糖，1.5克/100毫升硫酸铵，01克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4，0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45毫克/100毫升(以氮角度而言)的黄豆水解物]。于31.5℃培养18小时，所得细胞以实施例4(4)中所叙述的方法测定β-半乳糖苷酶活性。
AJ 12092/pNEOL-0所检测的β-半乳糖苷酶活性显示在表20中，结果发现插入到lacZ基因结构上游的DNA片段扮演启动子的功能。此外，每一质粒导入的菌株皆比AJ 12092/pNEOL-0具有较高的β-半乳糖苷酶活性。因此发现通过导入突变到可能是启动子序列的菌株，其转录作用活性增加，结果显示在表20中。
表20相对活性(AJ 12092/pNEOL-0=1)AJ 12092 未检测AJ 12092/pNEOL-01.0AJ 12092/pNEOL-12.8AJ 12092/pNEOL-22.7AJ 12092/pNEOL-31.8AJ 12092/pNEOL-40.8AJ 12092/pNEOL-73.0(4)用于导入突变的质粒的构建以AJ 12092菌株的染色体DNA为模板，使用引物14和15(具有序列号55和56)进行PCR。所得的DNA片段插入克隆用载体pHSG 398(TaKaRa产品)的多克隆位点中的SmaⅠ位点以构建质粒p0。然后使用限制酶EcoRⅤ和BspHⅠ消化p0，同样也使用限制酶EcoRⅤ和BsplⅠ消化pNEOL-3和pNEOL-7。所得的DNA片段连接在一起而获得导入突变的质粒p3(衍生自导入突变的引物11的突变株)和p7(衍生自导入突变的引物13的突变株)。(5)将突变导入性质粒导入到产生精氨酸的细菌内使用电脉冲法(特开平2-207791)将所得质粒导入产生精氨酸的乳酸发酵短杆菌AJ 12092菌株内。由于这些质粒的自动复制功能在短杆菌内无效，因此唯有通过同源性重组作用将主要质粒插入整合到染色体的菌株才能被筛选为Cm抗性菌株。将突变导入性质粒插入整合到染色体者，在含有5微克/毫升氯霉素的CM2G平板培养基(每1公升纯水包含10克聚蛋白胨，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克琼脂，pH7.2)筛选氯霉素抗性菌株。然后再进行一次同源性重组作用从Cm敏感性菌株筛选出将指定的变化序列置换argG基因的启动子部分的菌株。
因此得到以P3序列取代的菌株(AJ 12092-P3)和P7序列取代的菌株(AJ 12092-P7)。(6)argG基因的克隆以(1)中所测定的碱基序列为基础，合成具有位于序列号46和47的寡核苷酸(引物5和6)，及黄色短杆菌的染色体DNA为模板进行PCR。PCR反应进行25次循环，每一循环包括94℃30秒，55℃1秒，72℃2分钟及30秒。如此所得的DNA片段克隆到克隆用载体pSTV 29(Takara Shuzo Co.,Ltd.)中多克隆位点的SmaⅠ位点。更进一步，将实施例1中的pSAK4以SalⅠ处理所得的复制起点片段插入pSTⅤargG的SalⅠ位点而制备pargG。(7)将pargG导入到短杆菌内使用电脉冲法(特开平2-207791)将质粒pargG导入乳酸发酵短杆菌AJ 12092菌株内。然后将转化产物于含有4微克/毫升氯霉素的CM2G平板培养基(每1公升纯水包括10克聚蛋白胨，10克酵母菌萃取物，5克葡萄糖，5克NaCl和15克琼脂，pH7.2)筛选氯霉素抗性菌株。(8)启动子突变菌株的argG活性上述的两种argG启动子突变菌株和使用质粒通过扩增argG所得的菌株(AJ 12092/pargG)测定其argG活性。将这些菌株——涂于琼脂培养基(含有0.5克/100毫升葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白胨，1克/100毫升酵母提取物，0.5克/毫升NaCl和5微克/升氯霉素)，在31.5℃培养20小时。然后将所得的每一细胞接种到培养基内[包含3克/100毫升葡萄糖，1.5克/100毫升硫酸铵，0.1克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4,0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45毫克/100毫升(以氮而言)的黄豆水解物]。在31.5℃培养18小时后，使用已述方法[Journal ofGeneral Microbiology(1990)]测定所得细胞的ArgG活性。上述两种ArgG启动子突变菌株和使用质粒通过扩增argG所得菌株的ArgG活性显示在表21中。从表21显然得知，将突变导入启动子的AJ 12092-P3的ArgG活性比亲代品约高两倍，而AJ 12092-P7比亲代菌株高约3倍。AJ 12092/pargG的ArgG活性比亲代菌株高约4.5倍。
表21相对活性(AJ 12092=1)AJ 120921.0AJ 12092 - P3 2.1AJ 12092 - P7 2.9AJ 12092/pargG 4.4(9)由启动子突变菌株产生精氨酸在锥形瓶内培养每一argG启动子变化的菌株。为对照用，也同样培养亲代菌株AJ 12092和AJ 12092/pargG。将这些菌株各别接种到培养基上(含有0.1克/100毫升KH2PO4，0.04克/100毫升MgSO4，0.001克/100毫升FeSO4，0.01克/100毫升MnSO4，5微克/毫升VB1，5微克/100毫升生物素和45克/100毫升(以氮而言)的黄豆水解物)。然后再涂于琼脂培养基(包含0.5克/100毫升葡萄糖，1克/100毫升聚蛋白胨，1克/100毫升酵母菌萃取物，0.5/克/100毫升NaCl和5微克/升氯霉素)，于31.5℃培养20小时。然后取这些细胞培养在含有4克/100毫升葡萄糖和6.5克/100毫升硫酸铵的锥形瓶中，于31.5℃培养到葡萄糖完全消耗为止。使用0.2当量浓度的HCl溶液将此培养液稀释到1/51的浓度测其吸光度(CD 620)，精氨酸的生成量(浓度克/100毫升)及培养时间显示在表22中。
从表22显然得知使用argG启动子突变菌株时，精氨酸的产量增加程度相当于使用质粒扩增argG。启动子突变菌株AJ 12092-P3和AJ12092-P7的培养时间与亲代菌株相同，但质粒扩增菌株的培养时间较长。由此得知精氨酸产生力高于质粒扩增菌株。
表22OD 精氨酸 培养 生产力(克/100 时间 (克/100毫毫升) (小时) 升/小时)AJ 12092 0.5021.25 48 0.026AJ 12092-P3 0.5101.47 48 0.031AJ 12092-P7 0.5141.43 48 0.030A.J 12092/pargG 0.5201.47 52 0.028实施例7将突变导入产生谷氨酸的棒状菌的GDH基因启动子区域内(1)突变株gdh质粒的构建使用定位突变法来构建具有实施例2中所叙述的FGR1菌株和FGR2菌株的GDH启动子序列的质粒。为取得FGR1菌株的GDH启动子序列，使用序列号57和60的合成DNA为引物及ATCC 13869的染色体DNA为模板进行PCR；另一方面也使用序列号58和59的合成DNA及ATCC 13869的染色体DNA为模板进行PCR。更进一步，以这些PCR产物作为模板，使用序列号57和58的合成DNA为引物进行PCR。将所得的PCR产物插入pSFKT 2(特愿平11-69896)的SmaⅠ位点而构建出pSFKTG11。为取得FGR2菌株的GDH启动子序列，使用序列号57和62的合成DNA为引物及ATCC 13869的染色体DNA为模板进行PCR；另一方面也使用序列号58和61的合成DNA为引物，及ATCC13869的染色体DNA为模板进行PCR。更进一步，以这些PCR产物为模板，使用序列号57和58的合成DNA为引物进行PCR。所得的PCR产物插入pSFKT2(特愿平11-69896)的SmaⅠ位点而构建出pSFKTG07。插入pSFKTG11和pSFKTG07 SmaⅠ位点的DNA片段必需测定其碱基序列，以确认除了启动子区域以外没有突变导入GDH内。(2)gdh启动子突变菌株的构建使用电脉冲法将pSFKTG 11和pSFKTG 07导入AJ 13092菌株内，然后将转化产物生长于含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上，于25℃进行筛选。将转化产物在34℃培养，以筛选可在34℃对卡那霉素具抗性的菌株。事实上有一菌株在34℃对卡那霉素具抗性，表示pSFKTG11或pSFKTG 07整合插入到AJ 13029菌株的染色体中。因此卡那霉素敏感性菌株则从那些质粒插入整合到染色体中的菌株中获得。测定这些菌株的GDH启动子序列，具有相同于pSFKTG 11和pSFKTG 07的gdh启动子序列的菌株分别命名为GA01和GA02。(3)gdh启动子突变菌株的L-谷氨酸产生力的确认使用上述实施例2(2)中的相同方法确认菌株GA01和GA02和其亲代菌株的谷氨酸产生力。结果得知GA01和GA02显著增加谷氨酸的累积，结果显示在表23。
表23菌株谷氨酸(克/100毫升)GDH的比活性相对值AJ 13029 2.6 7.7 1.0GA01 3.0 22.3 2.9GA02 2.9 27.0 3.5(4)自行克隆(self-cloning)型式的gdh质粒的构建首先，构建自行克隆载体pAJ 220。使用EcoRⅤ和PatⅠ处理pAJ 226(特开昭61-152289)，以制备含有可在棒状菌内自动复制的区域的片段。将此片段与约0.7kb的DNA片段连接起来而得到质粒AJ 220，而0.7 kb的DNA片段是以EcoRV和PstⅠ处理pAJ 224(J P.KOKAI No.Sho 61-152289)所得到。此质粒能在棒状菌内自动复制，且可使宿主对抗生素-甲氧苄啶具抗性。
使用序列号63和64的合成DNA为引物，野生型棒状菌ATCC 13869的染色体DNA为模板进行PCR。将所得的gdh基因片段插入pAJ 220的BalⅠ位点而构建pAJ 220G。启动子位于靠近pAJ 220的BalⅠ位点，且表达的增加视基因插入到BalⅠ位点的方向而定。使用电脉冲法将pAJ220G和pGDH导入ATCC 13869内。如此构建的菌株的GDH活性测定，可通过上述(1)中的方法进行。结果显示于表24中，导入pAJ 220G的菌株的GDH活性比导入dGDH的菌株高约1.5倍。
表24菌株 GDH比活性相对值ATCC 13869 7.7 1.0ATCC 13869/pGDH82.710.7ATCC 13869/pAJ 220G120.1 15.6(5)gdh活性对产量及副产物天冬氨酸的影响的研究利用电脉冲法将pGDH和pAJ 220G导入AJ 13029内。将这些菌株及上述步骤(2)中所得的菌株一一接种到具有表25中所示成分的接种培养基内，于31.5℃摇动培养24小时以获取这些接种物。取300毫升的主要培养基于500毫升的玻璃发酵瓶内，主要培养基成分如表25中所示，然后加热灭菌。将40毫升的上述的接种培养基内的菌株接种到主要培养基内，在31.5℃开始培养并伴随800到1300rpm的转动及1/2到1/1vvm的通气量。使用气态氨维持1/1 pH7.5。开始培养8小时后将温度移到37℃。约20到40小时内葡萄糖完全耗尽时就终止培养，测定所形成及累积在液态培养基中的L-谷氨酸数量(表26)。GDH的活性最高可得到约3倍高的产量。当GDH活性更进一步再提高时，则产量的增强程度就会降低。当GDH活性提高到16倍时，产量会稍微减少。使用日立氨基酸分析仪L-8500来分析副产物氨基酸的形成，结果发现GDH活性提高时，天冬氨酸和丙氨酸的累积量增加。这些结果证明下列事实要增加谷氨酸的产量必需适当增加GDH的活性，才不致导致天冬氨酸和丙氨酸的显著增加。其中一有效方法就是将各种gdh启动子的突变导入以调控GDH活性至3倍的亲代菌株即可。
表25浓度成分 接种培养主要培养葡萄糖 50克/升150克/升KH2PO41克/升 2克/升MgSO4·7H2O0.4/克/升 1.5克/升FeSO4·7H2O10毫克/升 15毫克/升MnSO4·4H2O10毫克/升 15毫克/升黄豆蛋白质水解物20毫升/升 50毫升/升生物素 0.5毫克/升 2毫克/升盐酸硫胺素 2毫克/升 3毫克/升表26菌株 谷氨酸天冬氨酸 丙氨酸 GDH 相对值(克/100(毫克/ (毫克/比活性毫升) 100毫升)100毫升)AJ 13029 8.3 49 607.71.0GA01 9.0 145 152 22.3 2.9GA02 8.9 153 155 27.0 3.5AJ 13029/pGDH8.8 201 190 82.7 10.7AJ 13029/pAJ220G 7.5 290 590 120.12 15.6
序列表<110>Ajinomoto Co.Inc.<120>构建产生氨基酸的细菌的方法，及通过发酵该经构建的产生氨基酸的细菌以制备氨基酸的方法<130>YIG-0426<160>＞6<210>1<211>46<212>核酸<400>1ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt<210>2<211>46<212>核酸<400>2ttaattcttt gcggtcatat ctgcgacact gccataattt gaacgt<210>3<211>46<212>核酸<400>3ttaattcttt gtggtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt<210>4<211>46<212>核酸<400>4ttaattcttt gttgacatat ctgcgacact gctataattt gaacgt<210>5<211>46<212>核酸<400>5ttaattcttt gttgccatat ctgcgacact gctataattt gaacgt<210>6<211>46<212>核酸<400>6ttaattcttt gttgtcatat ctgcgacact gctataattt gaacgt<210>7<211>30<212>核酸<220>用于克隆乳酸发酵短杆菌的gltA的引物A<400>7gtcgacaata gcctgaatct gttctggtcg<210>8<211>30<212>核酸<220>用于克隆乳酸发酵短杆菌的gltA的引物B<400>8aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt<210>9<211>20<212>核酸<220>用于导入突变到gltA启动子的引物1<400>9atcgtataa cgtgttaacc<210>10<211>20<212>核酸<220>用于导入突变到gltA启动子的引物2<400>10atcggtataa tgtgttaacc<210>11<211>40<212>核酸<220>用于导入突变到gltA启动子的引物4<400>11gatttgacaa aaccgcattt atcggtataa tgtgttaacc<210>12<211>28<212>核酸<220>gltA启动子序列引物<440>12agggatccgt ccagtctcag acagcatc<210>13<211>17<212>核酸<220>通用引物M13RV<400>13caggaaacag ctatgac<210>14<211>20<212>核酸<220>用于克隆ICDH的引物A<400>14gaattcgctc ccggtgcagc<210>15<211>20<212>核酸<220>用于克隆ICDH的引物B<400>15gatgcagaat tccttgtcgg<210>16<211>28<212>核酸<220>用于导入突变到ICDH的引物1<400>16tggattgctg gctataatgg tgtcgtga<210>17<211>53<212>核酸<220>用于导入突变到ICDH启动子的引物2<400>17caacccacgt tcagttgaca actactggat tgctggctat aatggtgtcg tga<210>18<211>53<212>核酸<220>用于导入突变到ICDH启动子的引物3<400>18caacccacgt tcagttgact actactggat tgctggctaa agtggtgtcg tga<210>19<211>28<212>核酸<220>用于导入突变到ICDH启动子的引物4<400>19ggctgaaact gctataatag gcgccagc<210>20<211>51<212>核酸<220>用于导入突变到ICDH启动子的引物5<400>20ggaaacacgg cgttgccatg cggggctaa actgctataa taggcgccag c<210>21<211>51<212>核酸<220>用于导入突变到ICDH启动子的引物6<400>21ggaaaca cgg cgttgacatg cggggctgaa actgctataa taggcgccag c<210>22<211>22<212>核酸<220>ICDH启动子序列引物<400>22
gtgcgggtcc agatgatctt ag<210>23<211>20<212>核酸<220>用于扩增nptⅡ的引物A<400>23gggatcccgg atgaatgtca<210>24<211>23<212>核酸<220>用于扩增nptⅡ的引物B<400>24gcccggggtg ggcgaagaac tcc<210>25<211>23<212>核酸<220>用于扩增乳酸发酵短杆菌pdhA基因LA的引物<440>25aci gti tci atg ggi cti ggi cc<210>26<211>23<212>核酸<220>用于扩增乳酸发酵短杆菌pdhA基因LA的引物<400>26cct tct ccg tti agi gti gti cg<210>27<211>30<212>核酸<220>用于体外克隆乳酸发酵短杆菌pdhA基因LA的引物<400>27ttg cag tta acc acg aag gtc agg ttg tcc<210>28<211>30<2l2>核酸<220>用于体外克隆乳酸发酵短杆菌pdhA基因LA的引物<400>28tgg atg aga cca cgt gat tct ggc tcg tcc<210>29<211>30<212>核酸<220>用于体外克隆乳酸发酵短杆菌pdhA基因LA的引物<400>29aca gat cct gca cga agg cat caa cga ggc<210>30<211>30<212>核酸<220>用于体外克隆乳酸发酵短杆菌pdhA基因LA的引物<400>30tca tcg ctg cgg gta cct cct acg cca ccc<210>31<211>2766<212>核酸<213>乳酸发酵短杆菌ATCC 13869<220>乳酸发酵短杆菌ATCC 13869的pdhA基因LA<400>31atg gcc gat caa gca aaa ctt ggt ggt aag ccc tcg gat gac tct aac 48Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp ser Asa1 5 10 15ttc gcg atg atc cgc gat ggc gtg gca tct tat ttg aac gac tca gat 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权利要求
1．氨基酸或核酸生产力增强的棒状菌的制备方法，其特征在于，该方法包括在一棒状菌染色体上的氨基酸或核酸生物合成基因的启动子序列中发生突变而使其接近共有序列，或以基因重组作用在一棒状菌染色体上的氨基酸或核酸生物合成基因的启动子序列中导入一个变化而使其接近共有序列，进而取得此产生氨基酸或核苷酸的棒状菌的突变株，培养这些突变株并筛选能大量产生氨基酸或核苷酸的突变株。
2．权利要求1的方法，其中的氨基酸选自谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，丝氨酸，苯丙氨酸，核酸是选肌苷，鸟苷，腺苷和核苷酸。
3．权利要求1的方法，其中的氨基酸是谷氨酸，其启动子选自谷氨酸脱氢酶(GDH)，柠檬酸合成酶(CS)，异柠檬酸合成酶(ICDH)，丙酮酸脱氢酶(PDH)和乌头酸酶(ACO)产生基因的启动子。
4．权利要求3的方法，其中谷氨酸脱氢酶(GDH)基因的启动子是选自位于-35区域的CGGTCA，TTGTCA,TTGACA和TTGCCA的至少一种DNA序列和/或-10区域TATAAT序列或ATAAT已被其它碱基取代且不会抑制启动子的序列。
5．权利要求4的方法，其中GDH的启动子具有位于-35区域的TGGTCA，和位于-10区域的TATAAT；或位于-35区域的TTGTCA，和位于-10区域的TATAAT。
6．权利要求3的方法，其中CS的启动子具有位于-35区域的TTGTCA序列和/或位于-10区域的TATAAT序列，且此序列不会抑制启动子功能。
7．权利要求3的方法，其中ICDH启动子具有-35区域的第一或第二启动子(位点)的TTGCCA序列及TTGACA序列中的任意一个和/或-10区域第一或第二启动子(位点)的TATAAT，且此序列不会抑制启动子功能。
8．权利要求3的方法，其中PDH的启动子具有位于-35区域的TTGCCA序列和/或位于-10区域的TATAAT，且此序列不会抑制启动子功能。
9．权利要求1的方法，其中的氨基酸是精氨酸，其启动子是精氨酸琥珀酸合成酶的启动子。
10．权利要求9的方法，其中精氨酸琥珀酸合成酶的启动子具有选自位于-35区域的TTGCCA,TTGCTA和TTGTCA中至少一种的DNA序列和/或-10区域TATAAT序列或ATAAC已被其它碱基取代的序列，且此序列不抑制启动子功能。
11．权利要求10的方法，其中精氨酸琥珀酸合成酶的启动子具有位于-35区域的TTGTCA序列和/或位于-10区域的TATAAT序列。
12．一种谷氨酸合成基因，它具有权利要求第4项到第8项中所叙述的启动子。
13．一种精氨酸合成基因，它具有权利要求第10项中所叙述的启动子。
14．一种产生谷氨酸的棒状菌，它具有权利要求第12项中所陈述的谷氨酸合成基因。
15．一种产生精氨酸的棒状菌，它具有权利要求第13项中所陈述的精氨酸合成基因。
16．经由发酵作用产生氨基酸或核酸的方法，其特征在于，该方法包括培养一具有增强的氨基酸或核苷酸生产力的棒状菌，而该棒状菌是通过权利要求第1项到第11项中所陈述的方法所构建的，或在培养基中培养权利要求第14项或第15项的棒状菌，于培养基中形成并累积指定的氨基酸或核苷酸，并从培养基中收集之。
17．一种经由发酵作用产生L-谷氨酸的方法，其特征在于，该方法包括在液体培养基中培养对4-氟谷氨酸具抗性的产生L-谷氨酸的棒状菌，在培养液中形成并累积L-谷氨酸，并从培养基中收集之。
全文摘要
一种制备具有增强的氨基酸或核酸生产能力的棒状杆菌的方法,包括在一棒状菌染色体上的氨基酸或核酸生物合成基因的启动子序列中发生突变而使其接近共有序列,或以基因重组作用在一棒状菌染色体上的氨基酸和核酸生物合成基因的启动于序列中导入一个变化而使其接近共有序列,进而取得此产生氨基酸或核苷酸的棒状杆菌的突变株,培养这些突变株并筛选能大量产生氨基酸或核酸的突变株。这些方法可构建一突变株,不需要利用质粒就能适当加强或控制目的基因的表达;且能经由重组作用或突变作用产生高产量的氨基酸。
文档编号C12N1/21GK1289368SQ99802380
公开日2001年3月28日 申请日期1999年9月22日 优先权日1998年9月25日
发明者朝仓阳子, 中村纯, 菅野壮平, 菅美喜子, 木村英一郎, 伊藤久生, 松井和彦, 中松亘, 仓桥修, 大住刚 申请人:味之素株式会社