一种提取玻璃酸酶精品的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及从新鲜动物睾丸中提取玻璃酸酶的方法。
【背景技术】
[0002]玻璃酸酶又名透明质酸酶，在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子。也存在于精子、颁下腺、蜂毒、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。
[0003]玻璃酸酶的稳定性较好，42°C加热60分钟活力不损失；100°C加热5分钟，活力可保留80%。受热失活后进行冷却可恢复部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍较稳定。在低浓度水溶液中较易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯胶或0.2%明胶保护。Fe2+、Cu2+对酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等对酶活性没有明显影响。硫酸软骨素B (皮肤素)、硫酸类肝素、硫酸角质素、肝素及高浓度玻璃酸酶对酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化钠或硫酸鱼精蛋白所逆转。
[0004]药用玻璃酸酶为白色或微黄色粉末，无气味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有机溶剂。生化制药主要用牛、羊睾丸为原料进行提取制备。
[0005]国外50年代初已投入生产，并收载于英国和日本药典中，商品名Rondas。我国1965年正式投入生产，从羊睾丸中提取，收入1977版中国药典。王彦，周淑敏等曾在2002年15卷(I)期的《黑龙江医药》上发表了一篇名为《透明质酸酶提取工艺的研宄》的论文，较详细的介绍了工业生产中从羊睾丸中提取玻璃酸酶的传统工艺以及在此基础上由他们改良的新工艺；李丹，郭育涛等曾在2011年8月第40卷第8期的《应用化工》上发表了一篇名为《牛睾丸中透明质酸酶提取工艺研宄》的论文，介绍了用盐酸和乙酸的混合液溶解、硫酸铵盐析方法，从牛睾丸中玻璃酸酶的实验研宄。但是用色谱分离法提取玻璃酸酶精品的工艺，暂时还没有相关记载。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种提取玻璃酸酶精品的方法，粗品经色谱分离、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品。具体步骤如下:
(一)色谱分离
设定柱流速25L/h，用平衡液平衡色谱分离柱2小时，粗品溶于少量平衡液后上柱，再分别用平衡液和清洗液各清洗柱子25分钟，然后用洗脱液洗脱30分钟，收集溶液，加4倍收集液体积的乙醇沉淀12小时后离心脱水，转速3700r/min ;其中:平衡液为醋酸钠1090g，加纯化水160L，调pH3.6后的溶液；清洗液为醋酸钠220g，加纯化水16L，调pH3.6后的溶液Γ冼脱液为氯化钠440g，加纯化水15L，调pH3.6后的溶液；
(二)热原处理:
将上述溶液离心，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入15%磷酸三钠(Na3PO4.12H20)溶液，在不断搅拌下，缓缓加入20%醋酸钙(Ca(CH3COO)2 -H2O)溶液，并以NaOH溶液调pH 8.5，离心，收集上清液，之后上清液调pH 6.5?7.0 ;
(三)冻干
将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品。
[0007]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
本发明技术是用色谱分离法提取玻璃酸酶精品，国内暂时没有相关记载。本发明技术是用粗品经色谱分离、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品，得到的玻璃酸酶效价更高，350iu/mg，且玻璃酸酶不含热原，药品质量符合国家质量标准。生产工艺简易、成本低，原材料来源广泛，适合大规模工业化生产。该项成果有良好的经济效益和社会效益，它不但解决国内外医疗用药的需求，还为养殖产品的综合利用开拓了新路，对养殖业的发展有积极意义。
【具体实施方式】
[0008]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0009]实施例1
(一)色谱分离
设定柱流速25L/h，用平衡液平衡色谱分离柱2小时，粗品800g溶于80L平衡液后上柱，再分别用平衡液和清洗液各清洗柱子25分钟，然后用洗脱液洗脱30分钟，收集溶液12.8L，加51.2L乙醇沉淀12小时后离心脱水，转速3700r/min ;其中:平衡液为醋酸钠1090g，加纯化水160L，调pH3.6后的溶液；清洗液为醋酸钠220g，加纯化水16L，调pH3.6后的溶液Γ冼脱液为氯化钠440g，加纯化水15L，调pH3.6后的溶液；
(二)热原处理:
将上述溶液离心，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入15%磷酸三钠(Na3PO4.12H20)溶液8mL，在不断搅拌下，缓缓加入20%醋酸钙(Ca (CH3COO) 2.Η20)溶液4mL，并以NaOH溶液调pH8.5，离心，收集上清液，之后上清液调pH 6.5?7.0 ;
(三)冻干
将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品306.18g?
[0010]实施例2
(一)色谱分离
设定柱流速25L/h，用平衡液平衡色谱分离柱2小时，粗品400g溶于40L平衡液后上柱，再分别用平衡液和清洗液各清洗柱子25分钟，然后用洗脱液洗脱30分钟，收集溶液8.2L,加32.8L乙醇沉淀12小时后离心脱水，转速3700r/min ;其中:平衡液为醋酸钠1090g，加纯化水160L，调pH3.6后的溶液；清洗液为醋酸钠220g，加纯化水16L，调pH3.6后的溶液Γ冼脱液为氯化钠440g，加纯化水15L，调pH3.6后的溶液；
(二)热原处理:
将上述溶液离心，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入15%磷酸三钠(Na3PO4.12H20)溶液4mL，在不断搅拌下，缓缓加入20%醋酸钙(Ca (CH3COO) 2.Η20)溶液2mL，并以NaOH溶液调pH8.5，离心，收集上清液，之后上清液调pH 6.5?7.0 ;
(三)冻干
将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品154.64g?
[0011]经测算，实施例1中玻璃酸酶精品效价为352.76iu/mg，收率38.27% ;实施例2中玻璃酸酶精品效价为354.45iu/mg，收率38.69%。
[0012]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.一种提取玻璃酸酶精品的方法，其特征在于，粗品经色谱分离、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品，所述玻璃酸酶精品的效价可以达到350iu/mg。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: (一)色谱分离 设定柱流速25L/h，用平衡液平衡色谱分离柱2小时，粗品溶于少量平衡液后上柱，再分别用平衡液和清洗液各清洗柱子25分钟，然后用洗脱液洗脱30分钟，收集溶液，加4倍收集液体积的乙醇沉淀12小时后离心脱水，转速3700r/min ;其中:平衡液为醋酸钠1090g，加纯化水160L，调pH3.6后的溶液；清洗液为醋酸钠220g，加纯化水16L，调pH3.6后的溶液Γ冼脱液为氯化钠440g，加纯化水15L，调pH3.6后的溶液； (二)热原处理: 将上述溶液离心，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入15%磷酸三钠(Na3PO4.12H20)溶液，在不断搅拌下，缓缓加入20%醋酸钙(Ca(CH3COO)2 -H2O)溶液，并以NaOH溶液调pH 8.5，离心，收集上清液，之后上清液调pH 6.5?7.0 ; (三)冻干 将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品。
3.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，色谱柱流速为25L/h。
4.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，得到收集液后，要加4倍收集液体积的乙醇沉淀12小时后再离心脱水，其转速为3700r/min。
5.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，平衡液为醋酸钠1090g，加纯化水160L，调pH3.6后的溶液。
6.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，清洗液为醋酸钠220g，加纯化水16L，调pH3.6后的溶液。
7.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，洗脱液为氯化钠440g，加纯化水15L，调pH3.6后的溶液。
8.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤(二)中的“上述溶液”在过滤前以及调pH值至8-9后都要进行离心，离心时间:20分钟?30分钟，转速:2700?3200r/min。
【专利摘要】本发明提供了一种提取玻璃酸酶精品的方法，其特征在于，粗品经色谱分离、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品，使玻璃酸酶精品的效价可以达到350iu/mg。
【IPC分类】C12N9-26
【公开号】CN104531634
【申请号】CN201410807708
【发明人】刘冠男, 宋超龙, 孙延年
【申请人】青岛康原药业有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月23日