用于分类和预后创伤的方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于分类和预后哺乳动物、特别是人中的创伤的方法和试剂盒。所述 方法定义了使本领域技术人员能够表征病理创伤愈合，诸如慢性或不愈合创伤的分子标 签。
[0002] 发明背景
[0003] 自然创伤愈合被分成三个连续的阶段；每个阶段通过特定的细胞活性来表征：炎 症期、增殖期和重塑期。
[0004] 第一阶段，称为炎症期，在损伤后数分钟开始。血管破裂诱导血块形成，其主要由 纤维蛋白和纤连蛋白构成。血块部分填充病灶，并允许病灶内炎症细胞的迀移。炎症细胞 被募集以清除创伤。血小板分泌因子，诸如生长因子或细胞因子，其诱导创伤愈合所涉及的 细胞的募集（炎症细胞诸如中性粒细胞和巨噬细胞，成纤维细胞和内皮细胞）。
[0005] 第二阶段被称为增殖期，且对应于肉芽组织的发展。成纤维细胞迀移到创伤区域 中，增殖并通过分泌胞外基质（ECM)蛋白形成新的临时胞外基质。然后内皮细胞迀移以促 进病灶的新血管形成或血管生成。在肉芽组织内，成纤维细胞活化并分化成肌成纤维细胞， 由于它们表达a-平滑肌肌动蛋白而呈现收缩特性（类似于平滑肌细胞中）。肌成纤维细 胞在创伤愈合中具有关键作用，因为它们提供了创伤的收缩。最后，角化细胞从创伤边缘迀 移，增殖并分化以重建表皮。
[0006] 创伤愈合过程的最后阶段在创伤闭合后出现。它对应于肉芽组织的重塑。肉芽组 织被重组，III型胶原蛋白被I型胶原蛋白替换，因为正常真皮主要由I型胶原蛋白构成。 在这个阶段期间，过量的肌成纤维细胞通过凋亡清除。创伤愈合的最后阶段是漫长的。损 伤后一年，疤痕被重塑；它变得没有那么红，且更薄。
[0007] 然而，该过程不仅复杂，而且脆弱；它易于中断或失败，导致慢性或不愈合创伤的 形成或异常疤痕的形成。可能有助于此的因素包括疾病（诸如糖尿病，静脉或动脉疾病）、 年龄、感染或组织定位。
[0008] 慢性或不愈合创伤
[0009] 慢性创伤是一个世界性的健康问题，部分是由于缺乏足够的治疗方法。在2010 年，全世界超过700万人患有慢性创伤，并且预计每年增长至少10%。
[0010] 慢性创伤有时是不愈合创伤。常见类型的慢性创伤包括但不限于，腿部静脉溃疡、 糖尿病性足部溃疡、褥疮性溃疡、腿部动脉溃疡、混合病因（静脉和动脉）的那些或具有未 知病因的那些。我们还可以发现由于不正确地愈合变成慢性的急性创伤。
[0011] 不愈合创伤或慢性创伤是患者、健康护理专业人员和健康护理系统的挑战。它们 显著损害数百万人的生活质量，并在丧失生产力和健康护理资金方面为社会形成了负担。
[0012] 创伤愈合是动态途径，其导致了组织完整性和功能的恢复。当正常修复过程受到 干扰时慢性创伤或不愈合创伤发展。通过理解创伤愈合的生物学，医师可以通过选择足够 的治疗优化创伤愈合。
[0013] 在慢性或不愈合创伤中，自然愈合过程被改变，因此治疗是延长的、不完整的，并 且有时创伤从不闭合。当一些因素引起正常炎症和增殖阶段的破坏时，慢性创伤发生。因 此，存在对于用于诊断不愈合或慢性创伤以适应最佳治疗以提供创伤闭合和愈合的可靠方 法的需求。还存在对于创伤的更好护理和对于降低所述护理的最后期限的需求。
[0014] 在一些病理疾病或特定解剖定位中，创伤的潜在发病的早期诊断可能有助于防止 创伤的发展。在其中创伤已经发展的情况下，创伤的诊断或预后的知识可以使患者能够从 治疗接受最大益处。因此，创伤的治疗特别适用于处于其早期阶段的创伤，如果它呈现不正 确愈合的风险。
[0015] 这将有益于知道哪些患者易于发展慢性或不愈合创伤，此外，如果慢性创伤确实 发展，则患者如何可能响应特定治疗。因此，关键目标是鉴定用于慢性或不愈合创伤的诊断 或预后方法，以便提供较早和改进的治疗选择。
[0016] 尽管一些常见临床/病理因素可能有助于预先判断，如果创伤可能是"愈合的"或 "不愈合的"，或者如果急性创伤可以变成慢性，则没有特定的实验室测试以在创伤类型中 进行区分。由Systagenix商业化的Woundcheckstatus⑧使本领域技术人员能够测量蛋白 酶活性，但还不特异性到足以在可以比无法愈合的其它慢性创伤更快和更好愈合的慢性创 伤之间进行区分。
[0017]例如，本技术，诸如创伤临床观察，无法预测慢性或不愈合创伤发展，且不足以分 类具有创伤的愈合结果的患者。如果处于发展慢性或不愈合创伤的风险的患者可以进行鉴 定，则合适的预防措施或治疗可用于潜在巨大有效性的目标程序。
[0018] W0 2011/033249公开了用于基于分子标记物或基因分类和预后创伤的方法和试 剂盒。
[0019] 然而，本领域中仍然存在对于用于早期诊断或预后创伤命运的方法的需求。具体 而言，存在对于用于诊断或预后慢性或不愈合创伤的灵敏且可靠的方法的需求，所述慢性 或不愈合创伤诸如，但不限于，腿部静脉溃疡、糖尿病性足部溃疡、褥疮性溃疡、和腿部动脉 溃疡、不愈合急性创伤。
【发明内容】
[0020] 因此，本发明的一个目标是提供诊断或预后创伤的结果的方法。
[0021] 在本发明的第一个方面，提供了诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法，所述 方法包括测定来自哺乳动物的创伤中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中 所述基因定义如下：
[0022] -当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因 显不增加的表达：
[0023] P0U2F2、AMIG02、CCL11、CDC45L、CSF2、CSF3、F0XS1、G0S2、IF44L、INHBA、KPRP、 LCP1、LPAR3、MICAL2、MT1F、MT1M、POLQ、RRM2、SERPINA9、S0X9、STC1、TFIP2 和 UCN2，
[0024]-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少以下 miRNA显示降低的表达：
[0025] AC084368.1，
[0026]-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下 基因显示正常的表达：
[0027] CNN1 和 KRT16，
[0028] _或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下 基因显示降低的表达：
[0029] ACTC1、ADAMTS7、CFB、COMP、ECM2、EDIL3、EFHD1、FOLR1、ITGA11、KIT、LBH、LGR5、 MED12L、MFAP5、NR4A3、OMD、PALM、PHACTR3、P116、PPARG、PTH1R、PTX3、RCAN2、RSPO1、SPON2、 TAGLN、TMEM37、TMSB4Y、TXNIP 和 WFDC1，
[0030]-或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下 miRNA显示增加的表达：
[0031] MIR147B 和 MIR1181。
[0032] 在本发明的优选实施方案中，诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法还包括测 定来自哺乳动物的创伤样品中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中所述基 因定义如下：
[0033]-当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因 显示降低的表达：
[0034] ACTC1、ADAMTS7、COMP、ECM2、EDIL3、EFHD1、FOLR1、ITGA11、LBH、LGR5、MED12L、 MFAP5、OMD、PALM、PHACTR3、PI16、PTH1R、RSPOl、SPON2、TAGLN、TMEM37、TMSB4Y、TXNIP 和 WFDC1,
[0035] _或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少以下 miRNA显示降低的表达：
[0036] AC084368. 1，
[0037] _或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下 基因显示正常的表达：
[0038] CNN1 和 KRT16，
[0039] _或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下 基因显示增加的表达：
[0040] CCL11、CDC45L、CSF2、CSF3、GOS2、IF44L、KPRP、LCP1、LPAR3、MT1F、MT1M、POLQ、 RRM2、SERPINA9、STC1 和 TFIP2，
[0041] _或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下 miRNA显示增加的表达：
[0042] MIR147B 和 MIR1181。
[0043] 在本发明的具体实施方案中，诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法还包括测 定来自哺乳动物的创伤样品中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中所述基 因定义如下：
[0044]-当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因 显示降低的表达：
[0045] ACTA2、APOD、FGF9、ID4、POSTN 和 SMAD3，
[0046] _或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下 基因显示增加的表达：
[0047]CXCL1、CXCL5、CXCL6、MMP10、MMP3、SERPINB2、SPHK1、HALPN1 和 CTGF。
[0048] 在本发明的另一个具体实施方案中，诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法还 包括测定来自哺乳动物的创伤样品中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中 所述基因定义如下：
[0049]-当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下基因 显示降低的表达：
[0050]ACTA2、FGF9、ID4 和 POSTN，
[0051] _或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种以下 基因显示增加的表达：
[0052] CXCL1、CXCL5、CXCL6、MMP10、MMP3 和 SERPINB2。
[0053] "慢性创伤"或"慢性创伤组织"或"不愈合创伤"是指，例如，选自腿部静脉溃疡、 糖尿病性足部溃疡、褥疮性溃疡、腿部动脉溃疡或不愈合急性创伤或者不愈合创伤的病症。
[0054] 根据本发明的基因的完整身份可以在NCBI数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)获得，或者对于本领域技术人员是众所周知的。
[0055] 在本发明的一个优选方面，创伤组织是人组织，并且正常真皮成纤维细胞是正常 人真皮成纤维细胞（NHDF