用于治疗淀粉状蛋白沉积的方法和组合物的制作方法

用于治疗淀粉状蛋白沉积的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于治疗淀粉状蛋白沉积的方法和组合物
[0001] 相关申请 本专利申请要求2012年5月18日提交的美国申请顺序号61/648,801的优先权的权 益，所述申请通过引用结合到本文中。
[0002] 联邦咨助支持 本发明在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health)授予的资助号 RC1AG036265的政府支持下完成。政府在本发明中享有一定权利。
[0003] 序列表 本申请含以ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表，并通过引用以其整体结合到本文 中。2013年3月12日创建的所述ASCII副本被命名为17023. 122W01.txt，大小为20, 234 字节。
[0004] 发明背景 基因转移目前被广泛公认为用于在细胞和分子水平两者上分析生物学事件和疾病过 程的强大工具。最近，用于遗传性（例如ADA缺乏症）或获得性（例如癌症或感染性疾病） 人类疾病治疗的基因疗法的应用，已受到相当多的关注。随着改进的基因转移技术的出现 和缺陷性基因相关疾病不断扩大的文库的鉴定，基因疗法已从治疗理论快速发展成实用的 事实。
[0005] 传统上，基因疗法被定义为这样一种方法，其中将外源基因导入患者的细胞中以 纠正先天遗传错误。最近，基因疗法在广义上被定义为通过将新的遗传信息导入受影响的 生物体中来纠正疾病表型。在体内基因疗法中，转移的基因被原位导入接受生物体的细胞 中，即在接受者内。已在动物模型中检验了体内基因疗法。已报道了原位直接基因转移到 器官和组织（例如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统和肺）的可行性。还报告了 DNA直 接注射入骨骼肌、心肌和DNA-脂质复合物注射入血管系统以产生体内可检测表达水平的 插入的基因产物。
[0006] 中枢神经系统（CNS)疾病（例如脑部遗传疾病例如阿尔茨海默病（Alzheimer' S disease))的治疗，仍然是难解决的问题。治疗脑部疾病的一个主要问题是治疗性蛋白质在 静脉内递送时，无法跨越血脑屏障，或当直接递送到脑时，不会广泛分布。因此，需要开发用 于治疗阿尔茨海默病的疗法。
[0007] 发明概沭 在某些实施方案中，本发明提供治疗哺乳动物的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括 以有效感染非啮齿类哺乳动物的室管膜细胞的方式，将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性 ApoE同种型蛋白的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的脑脊液（CSF)，所述核酸插入一 对AAV反向末端重复之间，其中室管膜细胞分泌ApoE以治疗所述疾病。本文所用术语"保 护性ApoE同种型"用来区分降低阿尔茨海默病的风险达至少5%，例如10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%、100% 或更高的 ApoE 同种型。
[0008] 在某些实施方案中，本发明提供将保护性ApoE同种型递送至非啮齿类哺乳动物 的中枢神经系统的方法，所述方法包括以有效感染非啮齿类哺乳动物的室管膜细胞的方 式，将包含AAV衣壳蛋白和包含编码保护性ApoE同种型的核酸的载体的rAAV颗粒给予非 啮齿类哺乳动物的脑脊液（CSF)，使得室管膜细胞分泌ApoE进入哺乳动物CSF，所述核酸插 入一对AAV反向末端重复之间。在某些实施方案中，rAAV颗粒是以超过AAV4的感染率20% 的感染率，例如以超过AAV4的感染率的50%或100%、1000%或2000%的感染率，感染非啮齿 类动物室管膜细胞的rAAV2颗粒。
[0009] 在某些实施方案中，本发明提供治疗非啮齿类哺乳动物的疾病的方法，所述方法 将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE同种型蛋白的插入一对AAV反向末端重复之间 的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的室管膜细胞，从而将核酸递送至室管膜细胞中， 其中室管膜细胞分泌ApoE蛋白以治疗所述疾病。本发明提供将核酸递送至哺乳动物的室 管膜细胞中的方法，所述方法包括将包含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的AAV颗 粒给予哺乳动物，从而将核酸递送至哺乳动物的室管膜细胞中。
[0010] 在某些实施方案中，本发明提供将编码保护性ApoE同种型的核酸递送至哺乳动 物的室管膜细胞中的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端 重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒给予室管膜细胞，从而将核酸递送至室管膜细胞中。 [0011] 在某些实施方案中，本发明提供将编码保护性ApoE同种型的核酸递送至哺乳动 物的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端重复之间的核酸 的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的室管膜细胞，并将室管膜细胞输回给哺乳动物，从而将 所述核酸递送给哺乳动物。
[0012] 在某些实施方案中，本发明提供将编码保护性ApoE同种型的核酸递送到哺乳动 物的室管膜细胞中的方法，所述方法包括将包含AAV衣壳蛋白和含插入一对AAV反向末端 重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物，从而将核酸递送至哺乳动物的室管膜 细胞中。
[0013] 在某些实施方案中，本发明提供转染哺乳动物脑的室管膜细胞的方法，所述方法 包括以有效感染哺乳动物的室管膜细胞的方式，将包含AAV衣壳蛋白和含编码保护性ApoE 同种型的核酸的载体的rAAV颗粒给予哺乳动物的脑脊液（CSF)，使得室管膜细胞分泌作用 剂进入哺乳动物的CSF中，所述核酸插入一对AAV反向末端重复之间。
[0014] 在某些实施方案中，哺乳动物是非啮齿类哺乳动物。在某些实施方案中，非啮齿类 哺乳动物是灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。在某些实施方案中，灵长类动物是人。
[0015] 在某些实施方案中，保护性ApoE同种型与ApoE e 2具有至少约80%同源性。在 某些实施方案中，保护性ApoE同种型与ApoE e 2具有100%同源性。
[0016] 在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAV4颗粒。在某些实施方案中，AAV颗粒是rAAV2 颗粒。在某些实施方案中，rAAV2衣壳与AAV2衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3具有至少80% 同源性。在某些实施方案中，rAAV2衣壳与AAV2衣壳VP1、VP2和/或VP3具有100%同源 性。
[0017] 在某些实施方案中，本发明提供用于转染哺乳动物的室管膜细胞以产生治疗结果 的含有编码保护性ApoE同种型的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗 粒。
[0018] 在某些实施方案中，本发明提供含有包含编码保护性ApoE同种型的插入一对AAV 反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒在制备用于治疗或预防动物（例如人）的阿 尔茨海默病的药物中的用途。
[0019] 本发明提供上述用于医学治疗或诊断的细胞。
[0020] 本发明提供上述细胞在制备用于治疗哺乳动物的阿尔茨海默病的药物中的用途。
[0021] 在某些实施方案中，本发明提供药盒，所述药盒包含含有具有编码保护性ApoE同 种型的插入一对AAV反向末端重复之间的核酸的载体的rAAV颗粒的化合物、容器和说明将 AAV颗粒给予CSF以治疗动物的阿尔茨海默病的包装说明书或标签。
[0022] 附图简沭 图1A-1B.脑室内注射AAV4-ApoE导致huAPOE的稳定表达和脑中重组huApoE蛋白的 持续检测。
[0023] 图2. ApoE各同种型的过量表达差异性地影响淀粉样变的进程。
[0024] 图3.淀粉状蛋白斑的大小随各ApoE同种型而变化。
[0025] 图4A-4B.淀粉状蛋白负荷的死后评价证实Ap〇E2和Ap〇E4对淀粉状蛋白沉积的 作用。
[0026] 图5A-5D.各ApoE同种型差异性地影响淀粉状蛋白沉积周围的突触密度。
[0027] 图 6A是AAV2 (SEQ ID N0:1)和 AAV4 (SEQ ID N0:2)蛋白质的比对，图 6B是根据 得自 AAV2 (NC_001401)和AAV4 (NC_001829)的序列的AAV2 (SEQ IDN0:3)和AAV4 (SEQ ID N0:4)核苷酸的比对。
[0028] 图7显示不同脑区TPP1活性升高。
[0029] 图8显示对照和经治疗的狗的T型迷津行为的结果。浅色圆圈为受感染的狗；深 色正方形为正常的狗，深色圆圈为用AAV2-CLN2治疗的TPP-/-狗。
[0030] 图9A-9B.脑室内注射AAV血清型4的也似5基因转移法的验证。GFP或ApoE的 免疫组织学标记显示GFP或人ApoE蛋白在室管膜中和脉络丛中的存在情况。（A)定量测 定经过注射的小鼠的脑匀浆物内重组人ApoE蛋白的浓度的物种特异性ELISA测定法的应 用。（B)每只小鼠的人ApoE蛋白与内源性apoE相比的百分比的评价。计算每只动物的人 ApoE和鼠内源性apoE的比率。使用特异性抗人ApoE抗体3H1，可在APP/PS1注射小鼠的 皮层实质内的某些淀粉状蛋白沉积周围检出重组蛋白的存在，重组蛋白趋于在淀粉状蛋白 沉积周围蓄积。通过蛋白质印迹在注射AAV4-AP0E4载体的雄7〇万K0小鼠的ISF样品中检 出ApoE。来自Millipore的高灵敏度（但非物种特异性）山羊抗apoE抗体（AB947)用作 检测抗体。白蛋白用作对照。n= 4-6只动物/组。*p〈0. 05。
[0031] 图10A-10D.不同等位基因的过量表达调节AP肽的水平和淀粉状蛋白沉积 的密度。（A)经注射的转基因小鼠的皮质（左图）和海马（右图）中淀粉状蛋白沉积的密 度的分析。在两个脑区可观察到类似趋势，但仅皮质中的数据达到统计显著性。（B)通过 ELISA测定甲酸（FA)级分中A0 4(l和AP 42肽的浓度。（C)脑室内注射各种AAV后5个月通 过ELISA定量测定TBS可溶性级分中AP 4Q和A3 42肽的水平。⑶APP/PS1小鼠脑室内注 射AAV-GFP和AAV-AP0E2/3/4载体后5个月定量测定A 0 4(|肽的血浆水平。n= 4-7只动物 / 组。*p〈0.05。
[0032] 图11A-11B.各也似5变体的过量表达体内差异性地调节淀粉样变的进展。脑室 内注射AAV-GFP、-AP0E2、-3或-4载体后一周（T0)、一月（T1)和两月（T2)，显现APP/PS1 小鼠中淀粉状蛋白沉积的体内双光子图像。在成像前进行葡聚糖（Dextran)、德克萨斯红 (70, 000 Da)的静脉内注射，使得可随时间推移跟踪同一视场。在2个月的时间内，可检出 少量新的淀粉状蛋白斑，而在1或2个月后不再可检出最初可见的临时沉积。（A)在7月龄 APP/PS1小鼠中，在脑室内注射AAV-GFP、-APOE2、-APOE3或AP0E4后的2个月时间内对淀粉 状蛋白沉积的体积皮质密度的评价。对每只动物的6-8个视场进行纵向成像，计算每体积 皮质的斑块密度，相对于基线每只动物的最初值（T0)予以报告。随时间观察到0.23的淀 粉状蛋白沉积密度的总体进展（T2/T1，p〈0. 011)。另外，相对于GFP，Ap〇E2显著降低密度 达 0? 66 (se=0. 21，p=0. 002)，相对于 ApoE3 达 0? 67 (se=0. 17, p〈0. 0001)，相对于 ApoE4 达 0.74 (Se=0.17，p〈0.0001)。（B) APP/PS1小鼠中基因转移后2个月内淀粉样变进展的线性 回归拟合显示，在这个时期仅AAV-AP0E4导致显著的正斜率。n= 4-6只动物/组。*p〈0. 05。
[0033] 图12.在输注Ap〇E2、-3和-4后1和2个月淀粉状蛋白沉积大小的演变。表示 T1和T0间的斑块大小比率的散点图显示，一个月后，与Ap 〇E2和Ap〇E3两者相比，Ap〇E4与 斑块生长加快相关。2个月后，这种作用不会持续。3-4只动物内每组测量n> 50个斑块。 *p〈0.05。
[0034] 图13A-13C.与淀粉状蛋白沉积相关的神经病理学改变受各AP0E变体的差异性 影响。APP/PS1小鼠中，脑室内注射AAV-GFP、-AP0E2、-AP0E3和-AP0E4后2个月制备针对 PSD95 (突触后成分）和淀粉状蛋白沉积免疫染色的阵列断层扫描术（array tomography) 切片的图像。淀粉状蛋白沉积使用抗体NAB61标记，所述抗体NAB61之前显示优先标记毒 性AP寡聚体类。（A)与6F/域也幻万身目比，当两者表达时，在淀粉状蛋白 斑附近观察到突触蛋白-1标志物显著较高的丢失。（B)当定量测定突触后成分时，观察到 类似作用，使得在脑室内注射AAV4-AP0E4后2个月，沉积周围的PSD95的密度降低。作为 神经病理学改变的其它参数，在针对ThioS和轴突标志物SMI312免疫染色后，在注射APP/ PS1小鼠的脑中，评价每淀粉状蛋白斑的神经突营养不良（neuritic dystrophy)的数目。 (C)与Ap〇E3和Ap〇E2组相比，当输注Ap 〇E4的小鼠表达时，观察到朝着较高数目的营养不 良的显著改变，因此表明Ap〇E4可能具有淀粉状蛋白斑形成以外的有害作用，并可调节较 小的寡聚淀粉状蛋白聚集体的神经毒性潜力。n= 4-6只动物/组。*p〈0. 05。
[0035] 图14. Tg2576小鼠中在脑室内注射AAV4-AP0E2、-3、-4后在ISF中观察到寡聚 八3物类含量的早期改变。采用82￡1/82￡1￡1^154测定法的(^0中15?含量的定量测定表 明，与AAV4-AP0E2和-GFP相比，在注射AAV4-AP0E4后存在较高浓度的寡聚淀粉状蛋白3 类，而AAV4-AP0E3注射小鼠达到中间水平。n= 3-6只动物/组。*p〈0. 05。
[0036] 图15A-15B. APP/PS1小鼠中在脑室内注射AAV4后人和内源性鼠AP0E mRNA和蛋 白质的检测。（A)箱形图表示经注射的小鼠的脑中内源性鼠ApoE蛋白的量。（B) APP/PS1 小鼠中在脑室内注射AAV4后2和5个月ApoE蛋白水平的比较（在2和5个月时将来自所 有ApoE注射小鼠的样品合并在一起，不区分AP0E变体）。n= 4-6只动物/组。*p〈0.05。
[0037] 图16A-16B.在短期（2个月）暴露后对A 3的作用与各ApoE同种型相关。在注 射后2个月在APP/PS1小鼠中制作淀粉状蛋白沉积的图像。使用BamlO抗体和ThioS的两 种免疫染色用来分别使所有淀粉状蛋白沉积或致密中心斑染色。（A)皮质中淀粉状蛋白沉 积的密度的体视学分析显示也幻份的过量表达早在注射后2个月便引起斑块数增加，而在 其它实验组间未观察到差异。（B)另一方面，BamlO和ThioS染色间的比率，在所有不同组 中保持不变。（C)在用不同ApoE变体的短期暴露后不溶性甲酸提取物中AP 4Q (左图）和 A342 (右图）肽浓度的测定。n= 3-5只动物/组。*p〈0.05。
[0038] 图17A-17B. Tg2576小鼠中注射后3个月检测到的可溶性和不溶性AP类的变化。 (A) A 3 4(|和 A P 42 (B)中 ISF 含量的 ELISA 定量测定显示，与 AAV4-AP0E2、-AP0E3 和-GFP 相比，注射AAV4-AP0E4后存在朝向较高浓度的可溶性淀粉状蛋白0肽的趋势。（B)如之前 在APP/PS1小鼠中观察的，用Ap 〇E4观察到较强作用，Ap〇E4引起Tg2576小鼠的甲酸级分 中显著较高量的A0 42。n= 3-5只动物/组。*p〈0. 05。
[0039] 发明详沭 有几种不同的人载脂蛋白E (ApoE)同种型，这些同种型有一些在脑中的存在增加阿尔 茨海默病（AD)的风险，而其它同种型的存在降低AD的风险。ApoE e 4同种型的存在是迟 发性偶发性 AD 的强遗传风险因子。（Casellano等，5bi 3(89) :89ra57 (2011 年6月29日））。ApoE e4等位基因极强地增加AD风险并减低发病年龄。另一方面，ApoE e 2等位基因的存在似乎降低AD风险。人ApoE同种型被认为在体内差异性地影响淀粉状 蛋白-P (A 3 )的清除或合成。
[0040] 腺伴随病毒（AAV)是细小病毒科的小的不致病病毒。AAV因其复制依赖于辅助病 毒而不同于该科的其它成员。在辅助病毒不存在时，AAV可以基因座特异性方式整合至染 色体19的q臂上。AAV的大约5 kb基因组由一段正或负极性的单链DNA组成。基因组的 末端是短的反向末端重复，其可折叠成发夹结构，并用作病毒DNA复制的起点。实体上，细 小病毒病毒粒子是无包膜的，且其二十面体衣壳的直径约为20 nm。
[0041] 迄今已鉴定出8种血清学上不同的AAV，已从人或灵长类动物中分离出5种，称 为 AAV 1-5 型。Govindasamy 等，"Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4 (对腺伴随病毒血清型4的各种表型在结构上作 图），" 7； K/r.，80 (23) : 11556-11570 (2006)。AAV2 基因组的长度为 4680 个核苷酸，含 有2个可读框（0RF)。左0RF编码非结构的R印蛋白，R印40、R印52、R印68和R印78， 除产生单链子代基因组以外，R印蛋白还参与复制和转录的调节。此外，R印蛋白中的两种 与AAV基因组优先整合入人染色体19的q臂区有关。R印68/78还显示具有NTP结合活性 以及DNA和RNA解旋酶活性。Rep蛋白具有核定位信号以及几个潜在的磷酸化位点。这些 激酶位点之一的突变导致复制活性的丧失。
[0042] 该基因组的末端是短的反向末端重复（ITR)，其具有折叠成用作病毒DNA复制起 点的T形发夹结构的潜力。描述了 ITR区内对ITR的功能是关键的2个元件，GAGC重复基 序和末端解离位点（trs)。当ITR呈线性或发夹构象时，该重复基序显示结合R印。这种结 合提供R印68/78位用于在trs上切割，这以位点特异性和链特异性方式发生。除了其在复 制中的作用以外，这2个元件似乎对病毒整合是关键的。包含在染色体19整合基因座内的 是具有邻接trs的R印结合部位。这些元件显示对于基因座特异性整合是功能性的和必须 的。
[0043] AAV2病毒粒子是无包膜的，二十面体颗粒的直径约25 nm，由称为VP1、VP2和VP3 的3个相关蛋白质组成。右01^编码衣壳蛋白￥?1、￥?2和￥?3。这些蛋白质分别以1 :1:10 的比率存在，全部来源于右手0RF。衣壳蛋白因使用可变剪切和非常见起始密码子而彼此不 同。缺失分析表明，VP1 (自选择性剪接的信使RNA翻译）的剔除或改变导致感染颗粒产 量降低。VP3编码区内的突变导致任何单链子代DNA或感染性颗粒的产生失败。AAV2颗粒 是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。AAV2衣壳多肽可编码完整VP1、VP2和VP3多肽。颗粒 可以是包含AAV2和其它AAV衣壳蛋白（即嵌合蛋白，例如AAV4和AAV2)的颗粒。本文考 虑AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变异，只要包含AAV2衣壳的所得病毒颗粒保持在抗原上 或在免疫上不同于AAV4,如可通过标准方法常规测定的。具体地说，例如，ELISA和蛋白质 印迹可用来测定病毒颗粒是否在抗原上或免疫上不同于AAV4。此外，AAV2病毒颗粒优选保 持不同于AAV4的组织嗜性。
[0044] AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。编码完整VP1、VP2和VP3多肽的 AAV2衣壳多肽可与具有SEQ ID N0:1所示的由核苷酸编码的氨基酸序列的多肽（AAV2衣壳 蛋白）总体上有至少约63%同源性（或同一性）。衣壳蛋白可与SEQ ID NO: 1所示蛋白质 具有约70%同源性、约75%同源性、80%同源性、85%同源性、90%同源性、95%同源性、98%同 源性、99%同源性或甚至100%同源性。衣壳蛋白可与SEQ ID NO: 1所示蛋白质具有约70% 同一性、约75%同一性、80%同一性、85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性、99%同 一性或甚至100%同一性。颗粒可以是包含AAV4和AAV2衣壳蛋白两者（即嵌合蛋白）的 颗粒。本文考虑AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变异，只要所得的包含AAV2衣壳的病毒颗 粒保持在抗原上或在免疫上不同于AAV4,如可通过标准方法常规测定的。具体地说，例如， ELISA和蛋白质印迹可用来测定病毒颗粒是否在抗