白3肽的寡聚化）./ 15181 (2012年10月24日））。另外，最近体外证据证 实，ApoE4不能防止A0 诱导的突触丢失（M. Buttini 等，Modulation of Alzheimer-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation (转基因小鼠中通过人载脂蛋白E调节阿尔茨海默病样突触 和胆碱能缺陷取决于同种型、老化和淀粉状蛋白0肽的过量表达但不取决于斑块形成）. J Neurosci 22，10539 (2002 年 12 月 15 日）；A. Sen, D. L. Alkon, T. J. Nelson, Apolipoprotein E3 (ApoE3) but not ApoE4 protects against synaptic loss through increased expression of protein kinase C epsilon (载月旨蛋白 E3 (ApoE3)但非ApoE4 通过蛋白质激酶Ce表达增加防止突触丢失）.J Biol Chem 287，15947 (2012年5月4 日））。我们因此假设各个ApoE同种型的连续和弥散性分布不仅可差异性地影响AP沉积 的动力学和APP/PS小鼠脑中的清除，而且还可影响淀粉状蛋白沉积周围突触的完整性。
[0172] 采用阵列断层扫描术，一种基于超薄组织切片的免疫荧光染色的高分辨率技术， 测定了突触前和突触后成分（分别为突触蛋白-1和PSD95)的密度（K. D. Micheva，S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits (阵列断层扫描术：一种用于神经回路的分子 构造和超微结构成像的新的工具）? Afetfro/?55，25 (2007年7月5日）；R. M. Koffie等， Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques (寡聚淀粉状蛋白 0 与突触后密 度相关并与老年斑附近的兴奋性突触丢失关联）.Proc Natl Acad Sci U S A 106，4012 (2009年3月10日））。因为淀粉状蛋白寡聚体类显示高度集中于紧接淀粉状蛋白沉积的 附近，所以采用之前确立的方案，量化距离斑块远（> 50iim)或近（〈50iim)的突触蛋白-1 和PSD95点（R. M. Koffie等，Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques (寡 聚淀粉状蛋白0与突触后密度相关并与老年斑附近的兴奋性突触丢失关联）. Jcat/ 5bi " S J106, 4012 (2009年5月10日））。我们观察到，当减也幻万祿达 时，斑块附近突触前成分的丢失加剧，在注射AAV4-AP0E2或AAV4-GFP后不是这种情况（图 13A)。相比之下，突触后点的密度在GFP、Ap 〇E2和Ap〇E3注射小鼠之间保持不变，而Ap〇E4 治疗的动物显示淀粉状蛋白沉积周围PSD95的显著丢失，因此加强Ap 〇E4对AP的神经毒 性作用的有害作用（图13C)。当评价位于远离（> 50i!m)淀粉状蛋白沉积的区域的突触 成分的密度时，组间未能检出差异，表明了人ApoE变体本身对突触密度没有作用，而是表 明ApoE同种型对A 0诱导的神经毒性的重要作用。因此用ApoE3和ApoE4观察到的相对 突触丢失与每个斑块周围（在距其边缘〈50 iim的距离处）存在的A 0肽正相关。
[0173] 作为额外的神经病理学参数，我们还评价了 AAV4注射APP/PS1小鼠中与淀粉状蛋 白沉积有关的神经突营养不良的数目。除了老年斑周围的脊密度降低以外，老年斑还引起 神经毡更普遍的改变，其神经突弯曲增加，并出现浮肿性营养不良。这些病变有可能归因于 在斑块表面50Mm内的区域内富集的可溶性寡聚A0类。我们观察到与GFP、Ap〇E2和Ap 〇E3 相比，Ap〇E4的过量表达加剧与淀粉状蛋白沉积有关的SMI312阳性神经突营养不良的形成 (图13C)。该结果证实了以下观察结果：ApoE4同种型具有最强的作用，并且不仅仅调节斑 块形成而且还影响淀粉状蛋白相关的神经毒性。
[0174] 人ApoE蛋白更改另一种AD小鼠模型中间质液所含的寡聚A3类的量 我们接下来解决了 ISF内不同ApoE同种型的存在是否可改变在该同一胞外区室中可 溶性淀粉状蛋白物类的量的问题。我们选择了给另一种AD模型Tg2576小鼠注射，以证实 我们之前在不同转基因小鼠品系中的研究结果。Tg2576小鼠过量表达含有Swedish突变的 APP的突变形式并在指定年龄呈现比APP/PS1小鼠轻得多的表型。我们给16-18月龄动物 组群注射，使得淀粉状蛋白沉积在AAV4-AP0E转导时已存在。基因转移后3个月，将微透析 探头插入海马中，收集样品以表征与ISF内各个AP0E变体有关的早期变化。
[0175] 我们观察到与AAV4-AP0E2相比，在注射AAV4-AP0E4后，使用特异性82E1/82E1 ELISA测定法测量的A 0寡聚体类的浓度显著较高（达42±7%)(图14)，这就表明了 ApoE 的存在可调节该胞外区室的淀粉状蛋白聚集体的性质。此外，当评价ISF中的总的AP 4(|和 八运42时，观察到相同的趋势，但未达到显著（图17A)，这就表明了 ISF中不同ApoE同种型 的存在影响淀粉状蛋白肽的聚集状态，某程度上超过对总量的影响。
[0176] 如所预期的，暴露于不同ApoE同种型的Tg2576小鼠脑的死后生化分析显示，甲酸 级分中八0 42的浓度在ApoE4治疗的动物中显著增加（图17B)，在第二种转基因模型中证 实了我们在APP/PS1小鼠中的观察。
[0177] 总之，这些生化测量表明，Tg2576小鼠中的ApoE表达诱导与APP/PS1小鼠中观察 到的类似的淀粉状蛋白生物学方面的变化。重要的是，观察到ISF内〇A0的含量的早期变 化，在ISF中这些神经毒性物类可与突触末端直接相互作用。
[0178] 讨论 对于AD的发生，增加风险的也似5￥等位基因的遗传与具有引人注目的相反作用的 也似52等位基因的遗传之间引人注目的关系引起了关于该风险是如何介导的多种提议。 ApoE被指作为参与AP清除的AP结合蛋白。然而，為敲除小鼠中的研究出人意料地报 告了 A 3沉积在apoE不存在时显著较低。用人也观'么也观'^域也观￥置换导致与在AD患 者中相同的顺序递增的淀粉状蛋白沉积，这被假设为通过对斑块启动或原纤维形成的作用 而发生。替代假设集中在对神经突生长的差异性作用，或甚至提出AP0E基因型对阿尔茨海 默病表型的作用是与染色体19上的也似5遗传失衡的另一个基因的结果。
[0179] 我们的数据，来源于采用之前在溶酶体贮积症和亨廷顿舞蹈病的背景下测试的方 法对2种不同的小鼠模型的研究，通过采用体内多光子成像、标准定量免疫组织病理学、突 触结构的阵列断层扫描术研究和允许检查寡聚AP的新的高分子量微透析方法的组合，直 接克服了这些问题。我们表明，改变患有已确立的疾病的动物中的ISF ApoE微环境对A3 体系（AP economy)具有引人注目的快速等位基因特异性作用。我们的研究证实了甚至递 送至ISF的Ap〇E4水平的适度（约10%)提高，都显著影响AP表型和清除动力学以及增加 的可溶性A 0以及原纤维状形式和甲酸可提取形式的Ap〇E4相关保留，增加以突触丢失和 加重的神经突营养不良为标志的斑块周围的神经毒性。相反地，apoE2降低AP，具有显著 的神经保护作用。
[0180] 因为ISF ApoE水平的适度变化具有如此显著的后果，所以这些结果可引起对可通 过影响也似5表达改变AD的风险或AD的进展的各种环境和遗传因素的作用的深入了解。大 大超过我们所证实的量值的ApoE的增加可发生在创伤、癫痫、缺血和高胆固醇饮食后，所 有这些与脑A 0升高有关。此外，之前发现的与也似等位基因遗传失衡的启动子多态性 影响表达。
[0181] CNS中影响ApoE或ApoE-脂蛋白稳态的其它操作明显改变A 3沉积。例如，在用 AP0E慢病毒的病灶基因转移（主要在海马神经元中）的实验中，相对于也似M，也似过量 表达对淀粉状蛋白发挥较强的作用。之前的研究还显示，具有多种作用（包括提高内源性 apoE合成）的RXR激动剂，或许通过对跨越血脑屏障的清除的作用，导致AP从脑中清除。 另外，CYP46A (其在CNS中代谢胆固醇并降低其水平）的脑转导，如增加脑中的LDL-R水 平那样降低AP沉积，已知增加脑中的LDL-R水平降低apoE水平。最后，遗传操作表明，改 变卻达达一半可影响AP表型。我们的结果引人关注地表明较适度的变化也可具有 巨大作用。
[0182] 我们的数据直接解决了 AP0E-阿尔茨海默病文献中4个其它重要的争议方面。1) 我们证实了 ApoE同种型对通过突触丢失和神经突营养不良（两者都可能与神经元系统功 能受损有关）评价的神经毒性的明确作用。因为这些作用在紧接斑块的附近明显，但在远 离斑块的区域不明显，因此与Ap 〇E4相比，Ap〇E2的突触保护性质可能通过对斑块周围A3 的作用而不是因ApoE对突触稳定性的直接作用而介导。2)采用纵向多光子体内成像对斑 块沉积和生长的动力学的直接观察结果显示，Ap 〇E4提高斑块沉积和生长，而Ap〇E2实际上 与斑块溶解有关--这就表明了 ApoE同种型除对原纤维状斑块形成的初期作用以外，还对 疾病的步伐和进展具有强大的作用。该结果强化了这样的构想，即就淀粉状蛋白沉积和神 经毒性两者而言，Ap 〇E4可加快疾病过程（因此导致较早的发病年龄），而Ap〇E2反其道而 行之，这就产生了这样的可能性，即将ApoE2 (或ApoE2模拟物）导入CNS中可能甚至在疾 病已充分确立之后还具有治疗价值。3)之前已表明ApoE作为AP从脑清除的机制或作为 延长清除半寿期的保留分子；我们的现有结果表明，除Ap 〇E2之外，将适量的ApoE导入ISF 中足以提高AP在CNS中的保留。4)长期以来不清楚AD中显著保护作用的机制，部 分是因为Ap 〇E2相对差地结合ApoE受体。我们现有的数据表明，除了对AP清除至血浆的 中性作用或无作用以外，Ap〇E2具有功能获益-实际上能够逆转已建立的AP沉积，以及 支持突触和神经突的可塑性。这表明了遗传也幻万存P等位基因的患者间发病年龄几 十年长的差异可反映在AP沉积和清除动力学中的不同引发点和持续差异两者以及在与 沉积相关的神经毒性的程度方面的等位基因特异性差异。Ap 〇E2的这种双重功能可导致旨 在模拟其斑块清除和突触恢复能力的治疗方法。
[0183] 这些结果与以下方面一致：其中apoE起AP寡聚化的支架作用的模型、寡聚A3 的形成和稳定的效率为Ap 〇E4>Ap〇E3>Ap〇E2和我们的最新观察结果，即在患有AD的Ap 〇E4 >Ap〇E3人患者的CNS中寡聚A 0升高（甚至当斑块负荷在这些情况中归一化时）。如果 ApoE，尤其是ApoE4,介导神经毒性寡聚A 0的形成，我们预测升高的ApoE4可导致突触和神 经突改变增加，现行数据似乎正是如此。根据这些结果，就在遗传了也似等位基因的AD 患者脑中可提高ApoE水平的作用剂而言，应谨慎行事。
[0184] 最后，我们的数据证实AAV介导的室管膜转导将分泌的蛋白质递送至脑中及在此 递送至整个皮质中的能力。降低ap〇E4或增加ap〇E2的基因转移或其它方法是影响AD疾 病进展的有力手段。
[0185] 材料与方法 动物。使用以下两种小鼠进行了实验：APPsWe/PSldE9 (APP/PS1)双重转基因小鼠（D. R. Borchelt 等，Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins (在共表达突变 型早老蛋白1和淀粉状蛋白前体蛋白的转基因小鼠脑中淀粉状蛋白沉积加快.Afeyro/?19， 939 (1997 年 10 月））（获自 Jackson laboratory，Bar Harbor，Maine)和 Tg2576 小 鼠(K. Hsiao 等，Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice (转基因小鼠中相关性记忆缺陷、AP升高和淀粉状蛋白 斑）? 5bie/?ce274, 99 (1996 年 10 月 4 日））。将含有 Swedish 双重突变 K594N/M595L 的 人突变型淀粉状蛋白前体蛋白基因在朊病毒蛋白质启动子控制下插入这两个小鼠品系的 基因组中。另外，APP/PS1小鼠模型过量表达外显子9缺失的早老蛋白1基因的变体（由 同一启动子驱动）。APP/PS1小鼠中APPswe和PSEN1的同时过量表达导致更严重的表型，其 大量淀粉状蛋白沉积在早至6月龄时便可见。另一方面，Tg2576小鼠品系是轻微得多的模 型，只在1岁左右形成淀粉状蛋白斑。为了测定不同ApoE同种型的导入是否会影响疾病的 进展，我们分别给7月龄和16月龄APP/PS1 (每种情况4和7只动物）和Tg2576 (每种 情况3-5只动物）小鼠注射。还使用了 AP0E缺陷型小鼠（ApoE-KO, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)。按照NIH和协会准则进行实验。
[0186] 病毒载体构建和产生 乂/幻万-么->5和 _￥cDNA 由 University of Illinois (Chicago)的 LaDu 博士惠赠。在 通过PCR扩增后，其每种用BamHI消化，并插入AAV2-pCMV-hrGFP骨架中。由University of Iowa，Iowa City的基因转移载体中心（Gene Transfer Vector Core)使用杆状病毒系 统生产高滴度的 AAV 血清型 4 载体（AAV4-AP0E2、AAV4-AP0E3、AAV4-AP0E4 和 AAV4-GFP)。 采用定量PCR对病毒进行滴定。
[0187] 体定位凝室7^法#。如前所述进行AAV血清型4载体的立体定位脑室内注射 (T. L. Spires 等，Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy (通过基因转移和活体内多光子显微术证实淀粉状蛋白前体蛋白转基因小鼠中 的树突棘异常）? /Afe?r〇>sci25，7278 (2005年8月 3 日）；G. Liu, I. H. Martins, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Adeno-associated virus type 4 (MV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS (腺伴随病毒4型（AAV4)革巴向脑 室下区和RMS中的室管膜和星形细胞）.1503 (2005年10月））。通过腹膜 内注射氯胺酮/赛拉嗪（分别为l〇〇mg/kg和50mg/kg体重）使动物麻醉，并定位于立体定 位支架 G)avid Kopf Instruments，Tujunga，CA)上。使用连接至 10_Ml Hamilton 注射器 (Hamilton Medical，Reno, NV)的33规尖头微量移液管，以0? 25 W/分钟的速率，在各侧 脑室中，用5iU的病毒制备物（滴度2X1012 vg/ml)进行载体注射。计算注射部位距前囟 的立体定位坐标（前后位+0? 3 mm,中侧± 1mm和背腹侧-2mm)。
[0188] 廣畜窗A廣多尤子成歲。脑室内注射后一周，小鼠用异氟烷（1. 5%)麻醉，通过取 出一片颅骨并用8mm直径的玻璃盖玻片替换颅骨植入颅窗（如以前所述，T. L. Spires 等，Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy (通过基 因转移和活体内多光子显微术证实淀粉状蛋白前体蛋白转基因小鼠中的树突棘异常）./ 7278 (2005年8月3日））。对于成像，沿窗的边界制作蜡环以产生用于物镜 的一汪水（20X物镜，数值孔径为0.95,01ymp US)。为了观测淀粉状蛋白沉积，在手术前24 小时，转基因动物接受腹膜内注射methoxy-X04 (5mg/kg)，一种跨越血脑屏障并与淀粉状 蛋白沉积结合的突光化合物（B. J. Bacskai, W. E. Klunk, C. A. Mathis, B. T. Hyman, Imaging amyloid-beta deposits in vivo (体内使淀粉状蛋白 沉积成像）? /CfereA 财oot/付挪ifete622，1035 (2002年9月））。在成像前，将德克萨斯红葡聚糖（70, 000 Da 分子量；12.5 mg/ml，在无菌PBS中；Molecular Probes, Eugene, OR)注射至外侧尾静脉 以提供荧光血管造影片，使得血管系统的形状可用作跟踪随着时间推移确切相同的视场的 界标。AAV注射后一周给小鼠成像以评价淀粉状蛋白沉积的基线水平，然后在注射后1和2 个月成像。
[0189] 装在多光子成像系统（Bio-Rad 1024ES，Bio-Rad, Hercules, CA)中的模式锁定 的 Ti:蓝宝石激光器（MaiTai, Spectra-Physics，Mountain View，CA)产生 860 nm 双光 子荧光激发光。通过装有3个范围为380 - 480、500 - 540和560 - 650 nm的光电倍增管 (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ)的定制外部检测器收集发射光。同时获得斑 块和血管造影术的两色图像。获得低放大倍数体内图像（615 X 615 步长，2 ym， 深，~200 y m)，对6-8个视场拍摄以覆盖大的皮质区。
[0190] 夏歲必邀分教。应用Image J，通过报告每体积所成像的皮质的淀粉状蛋白沉积 的总数，定量测定每个视场中斑块的密度。我们考虑了自表面上堆栈的第一个切片开始 到其中可检测淀粉状蛋白沉积的最后一个切片的皮质体积。通过测量二维投影后其来自最 大强度的横截面积，来评价随着时间推移的淀粉状蛋白沉积的大小。对于每个斑块，计算初 始时间点和第1个月（T1/T0)之间或第2个月和第1个月（T2/T1)之间的面积的比率。
[0191] 多光子显微镜的设置（激光功率和PMT)在整个实验期间在不同成像时段全都保 持不变。
[0192] 徵遂教采样。在脑室内注射各AAV4后3个月，对Tg2576小鼠进行了脑间质 A3 和 ApoE 的体内微透析米样（S. Takeda 等，Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse (评价自由运动的小鼠中的 神经肽和大分子的新的微透析方法? Afe