2:695-698)。在创伤中，人成纤维细胞 也与APA-1(诱导基质重塑的蛋白）的上调相关，表明伪衰老成纤维细胞表型不受端粒损 耗诱导（Benanti JA，Williams DK，Robinson KL，0zer HL，Galloway DA (2002) Induct ion of extracellular matrix-remodeling genes by the senescence-associated protein APA-1.Mol Cell Biol 22:7385-7397)。因此，慢性创伤中的衰老成纤维细胞将特别由于 慢性炎症而显得比端粒缩短更多（Telgenhoff D, Shroot B(2005)Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death Differ 12:695-698)。
[0088] 某些生物标志物，诸如TAGLN，描述于现有技术中（Thweatt R, Lumpkin CK, Jr. , Goldstein S(1992)A novel gene encoding a smooth muscle protein is overexpressed in senescent human fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun 187:1-7)。在该出版物中，基因表达在衰老细胞中增加，而在本发明人使用的慢性或不愈合 创伤模型中，当与正常成纤维细胞基因表达相比时，TAGLN的基因表达降低。
[0089]在（Yoon IK, Kim HK，Kim YK，Song IH，Kim W，Kim S，Baek SH，Kim JH，Kim JR(2004)Exploration of replicative senescence-associated genes in human dermal fibroblasts by cDNA microarray technology. Exp Gerontol 39:1369-1378)中，G0S2被 描述为在包皮成纤维细胞衰老细胞中过表达。然而，在这篇文章中，成纤维细胞是复制型衰 老，在超过20倍增群体之后获得，而在本发明中，由于本发明人在慢性或不愈合创伤模型 上进行工作，所以成纤维细胞是伪衰老的，而不是复制型衰老。
[0090] 真皮成纤维细胞是一种良好的实验材料，因为人细胞可以从不同供体中获得。顺 便提一下，成纤维细胞代表创伤愈合中的关键细胞，因为它们分泌ECM蛋白，并且在肌成纤 维细胞中分化，这导致创伤收缩。
[0091] 已经在来自不同组织的成纤维细胞上描述了一些生物标志物：例如，肺中 的 CCL11 (Puxeddu I,Bader R,Piliponsky AM, Reich R,Levi-Schaffer F,Berkman N (2006), The CC chemokine eotaxin/CCLll has a selective profibrogenic effect on human lung fibroblasts, J Allergy Clin Immunol 117:103-110)或滑膜成纤维细 胞中的 TFIP2(Scaife S, Brown R, Kellie S, Filer A, Martin S, Thomas AM, Bradfield PF, Amft N, Salmon M, Buckley CD(2004)Detection of differentially expressed genes in synovial fibroblasts by restriction fragment differential display. Rheumatol ogy{Oxfor)43:1346-1352)。
【附图说明】
[0092] 图1:用人正常真皮成纤维细胞进行的实验的示意图
[0093] 图2:在不同实验中通过定量RT-PCR测定的a SMA mRNA的水平
[0094] 图3:在不同实验中通过Western印迹测定的a SMA和微管蛋白的表达
[0095] 图4:列表II、III的定义
[0096] 图 5A:PI16mRNA 表达（模拟 siRNA 或 PI16 siRNA)
[0097]图 5B: a SMA mRNA 表达（模拟 siRNA 或 PII6 siRNA)
[0098] 图6A:在T+E-条件下在不同时间点的PI 16 mRNA表达
[0099] 图6B:在T-E+条件下在不同时间点的PI 16 mRNA表达
[0100] 图6C:在T+E+条件下在不同时间点的PI 16 mRNA表达
[0101] 表1:对于不愈合或慢性创伤的基因标签列表
[0102] 表2:在所有进行的实验中鉴定的所有基因转录物的列表（列表II和III)。
【具体实施方式】
[0103] 响应于病变，成纤维细胞迀移进入创伤，在创伤中它们分化为可收缩的肌成纤维 细胞，所述肌成纤维细胞在重塑阶段期间将最终进入细胞凋亡。这种分化过程可以在环境 受控的组织培养条件中进行离体研宄，并且因此可以解决不同基因表达模式的及时控制连 续。
[0104] 材料与方法
[0105] 慢性创伤的离体模型的建立
[0106] 通过在培养的成纤维细胞上添加来自慢性创伤的渗出液而建立慢性或不愈合创 伤的离体模型，从而复制病理状态。然后，研宄基因表达，以定义慢性或不愈合创伤的分子 标签。
[0107] 从人外植体分离的NHDF购自Promocell。将NHDF在补充有10 % FCS (Invitrogen, 5 y g/ml 膜岛素和 Ing/mL b_FGF (PromoKine))的 DMEM-F12 (Invitrogen) 中培养。
[0108] 为了收集渗出液，招募四位具有混合性溃疡的患者（平均年龄，76岁；范围57-88 岁）。对于患者选择，决定排除任何其它可能参与创伤病因的疾病因素：糖尿病、外周动脉 疾病、营养不良。从负压治疗收集渗出液。将所有渗出液以1，500 x g离心3分钟以去除 细胞碎片。将上清液过滤并储存在_80°C直至使用。根据BCA方法（Sigma)使用等分试样 来测定蛋白浓度。
[0109] 对于实验，在48小时期间将细胞剥夺胰岛素和b-FGF。然后，将细胞在胶原蛋白包 被的培养板上在补充有10% FCS、10ng/mL TGF-0 1 (Promocell)的DMEM-F12中培养4天。 测试四个点以理解渗出物对成纤维细胞分化的影响：未处理细胞（T-E-)、用TGF-M处理 的成纤维细胞（T+E-)、用渗出液处理的细胞（T-E+)和最后同时用TGF-M和渗出液处理的 细胞（T+E+)。
[0110] 通过分析成肌纤维细胞标志物a平滑肌肌动蛋白（a SMA)的表达来评估成纤维 细胞分化的效率。
[0111] 通过RT-qPCR (mRNA水平）并通过Western印迹（蛋白）评价这种a SMA表达。
[0112] Western 印迹测定
[0113] 通过用裂解缓冲液（TRIS、NaCl、NP40、EDTA、MDTT)刮擦细胞提取总蛋白并在 冰中孵育30分钟。为了去除细胞碎片，将样品在4°C以13, 000 x g离心10分钟，并储存 在-20°C直至使用。根据BCA方法（Sigma)测定蛋白浓度。将等量总蛋白（20yg)装载至 NuPAGE 10% BIS-Tris凝胶（Invitrogen)，通过在150V迀移分离，并在30V转移到硝酸纤 维素膜（Whatman) 1小时。然后，针对a-SMA(Abeam)和微管蛋白（Abeam)将膜染色。随后 通过次级抗体，即分别用辣根过氧化物酶（HRP) (Promega)缀合的山羊抗兔IgG和山羊抗小 鼠IgG孵育。使用UptiLight HS WB基底（Uptima，Interchim)通过ECL化学发光法检测 信号。用扫描仪将条带数字化，并通过软件（ImageJ 1.43u，64-bit)计算相同印迹的所有 条带密度之间的比率。将相对a-SMA表达标准化至微管蛋白的相应值。
[0114] 总RNA样品制备
[0115] 四天实验后，将处理的成纤维细胞用TRIzol试剂（Invitrogen)裂解并储存 于-80°C。然后使用氯仿纯化RNA，并通过异丙醇沉淀。将总RNA在NanoDrop 2000c分光光 度计（Thermo Scientific)上进行定量。使用 Superscript III RT (Invitrogen)和 RNAse OUT (Invitrogen)用 oligot dT (Invitrogen)进行 500ng 总 RNA 至 cDNA 的逆转录。将 cDNA 储存在-20°C。
[0116] 定量实时RT-PCR
[0117] 使用 Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(Fermentas)在 LightCycler480 系统（Roche)上使用5 y L 1:20稀释的cDNA进行定量实时PCR (RT-qPCR)。正向和 反向引物由 Eurofins 设计（MWG，a SMA 正向：CTGITITCCCATCCAITGTG，a SMA 反向： CCATGITCTATCGGGTACTT)，并将100 y M储液储存在-20°C。对于每个RT-qPCR反应使用正 向和反向引物。循环条件如下：初始95°C持续10分钟，随后45个循环的95°C持续15秒， 58°C持续30秒，72°C持续20秒。使用LightCycler 480 SW 1. 5来评价TM曲线，以测定Cp 并近似计算每个扩增反应的相对浓度。
[0118] 表达时机
[0119] 如之前所述，对于不同时间（lh至96h)，用TGF0和/或渗出液处理NHDF(正常人 真皮成纤维细胞）。处理后，提取mRNA并通过RTqPCR评价PI 16mRNA的水平。
[0120] siRNA 转染
[0121] 通过用特异性小干扰RNA(Qiagen)瞬时转染人真皮成纤维细胞来敲低PI16的表 达。测试两种不同的siRNA。对于转染，将成纤维细胞胰蛋白酶化并接种在胶原蛋白包被的 6孔板中。如之前所述，将TGF-M和/或渗出液添加至培养基中。然后，根据制造商的说 明书用10nM siRNA和4yL INTERFERin试剂（PolyPlus)处理NHDF 6天。为了维持足够 的敲低，在48h进行第二次转染。通过RT-qPCR证实目标mRNA的敲低。作为对照，使用模 拟siRNA (针对外源性和非本GFP