mRNA)来绕过siRNA转染进入细胞的可能作用。
[0122] 结果
[0123] 对于慢性或不愈合创伤模型，将慢性创伤渗出液添加至细胞培养物（500 y g/mL 的渗出液的总蛋白）。进行的实验描述在图1中：细胞或者不处理（T-E-)，或者用单独的 TGFf3 (T+E-)、单独的渗出液（T-E+)或TGF0和渗出液（T+E+)处理4天。使用之前描述的 测定法来评价分化的水平。慢性创伤渗出液降低a SMA (mRNA和蛋白，图2和图3)的表达。 这表明，慢性创伤渗出液明确抑制成纤维细胞分化。这与以下事实相关：在慢性创伤中，我 们可以发现无功能的成纤维细胞，也称为伪衰老成纤维细胞。
[0124] 为了分析慢性或不愈合创伤模型中成纤维细胞的不同处理后表达的基因，实现 mRNA深度测序。
[0125] 通过TRIzol提取总RNA。将不同处理细胞的等量的总RNA(5至6yg)通过补充乙 酸钠的无水乙醇沉淀，用于RNA测序。
[0126] 通过FasterisSA(Switzerland)进行mRNA测序。将RNA作为总RNA递送，两轮 polyA纯化后，进行逆转录和cDNA文库。在HiSeq2000(Illumina)上进行测序。
[0127] 一种基因可以包含不同的异构体，并且一些异构体可以共有一个或多个外显子。 不幸的是，当每种异构体中存在的阅读数被计数并在基因实体中融合时，有时相同阅读可 以计数几次，因此使具有许多异构体的基因的分析发生偏差。为了解决这个问题，决定针对 对应于外显子覆盖的最大部分的每个基因创建假想转录物，并计数这些实体中存在的阅读 数。差异表达步骤的标准化和分析之后，仅保留显示与1. 1(T3或更小的调整P值相关的差 异表达的基因。应用在logFC(倍数变化）上的补充过滤器来以研宄完整列表（logFC的绝 对值必须大于或等于2)。
[0128] 病理创伤愈合分析：慢性或不愈合创伤
[0129] 本发明的目的是了解基因在两种条件之间是否差异表达，从而确定该创伤是否是 慢性或不愈合创伤。
[0130] 比较两种条件之间的基因转录物的丰度，T-E-点（正常真皮成纤维细胞）作为参 照。考虑2个列表（如图4中定义）：列表II比较T-E+和T-E-，且列表III比较T+E+和 T-E-。列表II和III与正常真皮成纤维细胞的比较提供了在分化过程期间受慢性渗出液 影响的基因列表，事实上是在慢性创伤愈合中发现的病理情况中受影响的基因。因此，列表 II和III代表慢性或不愈合创伤情况。随着调整P-值和测定Log FC过滤器，在列表II中 409个基因被鉴定为差异表达，在表III中1006个基因被鉴定为差异表达。
[0131] -些基因，由于它们的高度增加或降低的表达，是特别感兴趣的。例如，PI 16的 表达在不愈合或慢性创伤中极大降低。
[0132] 而PI16 mRNA通常在TGF0处理后过表达，人们可以在这里注意到siRNA处理后 PI16 mRNA水平的有效敲低（图5A)。非常有趣的是，当PI16被下调时，我们可以注意到 a SMA(图5B)mRNA的TGF0诱导水平的总体（对于siRNA PI16_7)或部分（对于siRNA PI16_5)抑制。两种siRNA效果的这些差异可以与PI16mRNA敲低的效率相关。这些结果与 TGF0处理后PI16 mRNA的表达模式研宄完全一致。事实上，PI16 mRNA主要在TGF0处理 后被上调，以及用渗出液处理被完全下调（以较慢的延伸）（图6)。
[0133] 因此，我们表明，PI16的过表达与成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的增加相关。相 反，PI16的下调与成纤维细胞的非分化行为（用渗出液处理或siRNA方法）相关。因此， PI 16是最感兴趣的治疗候选物。本发明还涉及在于增加它们在慢性或不愈合创伤病症中 的表达的治疗。
【主权项】
1. 诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法，其包括测定来自哺乳动物的创伤样品中 编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中： -当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因显示 增加的表达： P0U2F2、AMIG02、CCL11、CDC4化、CSF2、CSF3、F0XS1、G0S2、IF44L、INHBA、KPRP、LCP1、 LPAR3、MICAL2、MT1F、MT1M、POLQ、RRM2、沈RPIM9、S0X9、STC1、TFIP2 和 UCN2， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少W下miRNA显 示降低的表达： AC084368. 1， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因 显示正常的表达： C順 1 和 KRT16， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因 显示降低的表达： ACTC1、ADAMTS7、CFB、COMP、ECM2、邸 IL3、EFHD1、FOLR1、ITGA11、KIT、LBH、LG 贴、MED 1 化、 MFAP5、NR4A3、0MD、PALM、PHACTR3、PI16、PPARG、PTH1R、PTX3、RCAN2、RSP01、SP0N2、TAGLN、 TMEM37、TMSB4Y、TXNIP 和 W抑Cl， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下 miRNA显示增加的表达； MIR147B 和 MIR1181。
2. 根据权利要求1所述的诊断或预后不愈合或慢性创伤组织的方法，其包括测定来自 哺乳动物的创伤样品中编码不同分子标志物的基因的表达水平的步骤，其中： -当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因显示 降低的表达： ACTC1、ADAMTS7、COMP、ECM2、邸IL3、EFHD1、F0LR1、ITGA11、LBH、LG贴、MED1化、MFAP5、 0MD、PALM、PHACTR3、PI16、PTH1R、RSP01、SP0N2、TAGLN、TMEM37、TMSB4Y、TXNIP 和 WFDC1， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少W下miRNA显 示降低的表达： AC084368. 1， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因 显示正常的表达： C順 1 和 KRT16， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因 显示增加的表达： CCL11、CDC4化、CSF2、CSF3、G0S2、IF44L、KPRP、LCP1、LPAR3、MT1F、MT1M、P0LQ、RRM2、 沈RPINA9、STC1 和 TFIP2， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下 miRNA显示增加的表达； MIR147B 和 MIR1181。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，此外： -当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因显示 降低的表达： ACTA2、AP孤、FGF9、ID4、POSTN 和 SMAD3， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因 显示增加的表达： CX化 1、CX化5、CX化6、MMP10、MMP3、沈RPINB2、SPHK1、HALPN1 和 CTGF。
4. 根据前述权利要求之一所述的方法，其中，此外： -当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因显示 降低的表达： ACTA2、FGF9、ID4 和 POSTN， -或者当与所述哺乳动物的正常真皮成纤维细胞中的表达相比时，至少一种W下基因 显示增加的表达： CX化 1、CX化5、CX化6、MMP10、MMP3 和沈RPINB2。
5. 根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述创伤组织是人创伤组织，并且正常真 皮成纤维细胞是正常人真皮成纤维细胞（NHD巧。
6. 根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述正常真皮成纤维细胞产生自所述哺乳 动物的健康皮肤，并且更优选地，所述创伤组合和所述正常真皮成纤维细胞产生自相同动 物或个体。
7. 根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述基因表达水平通过定量相应RNA来测 定。
8. 根据权利要求9所述的方法，其中所述RNA选自mRNA和miRNA。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述基因表达水平通过定量除了 miRNA表达W外的相应编码的蛋白来测定。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述蛋白通过使用抗体来测量。
11. 用于进行上述根据权利要求1-10中任一项所述的方法中任何一种或多种的试剂 盒，其中所述试剂盒包含： (1) 用于检测和定量表1中指定的所有基因的表达水平的多个探针， (2) 任选地，适于使用所述探针的试剂和说明书。
12. 用于测定哺乳动物创伤的预后的试剂盒，其包含： (1) 用于检测和定量表1的每一种基因的至少一种RNA或蛋白的表达水平的多个探针， (2) 任选地，适于使用所述探针的试剂和说明书。
13. 微阵列，其由任何一种或多种权利要求11-12所述的探针组组成。
14. 用于确定患者的创伤结果的试剂盒，其包含： 至少两个微阵列，包含用于检测和定量权利要求1-10中任一项指定的所有基因的表 达水平的多个探针。
15. 用于治疗创伤的方法，其包括W下步骤；进行根据任何一种或多种权利要求1-10 所述的方法的用于测定创伤组织的分类或预后W鉴定所述创伤组织是否是慢性或不愈合 的，和基于创伤组织的分类或预后选择适当的治疗。
16.疗法，其在于增加慢性或不愈合创伤病症中PI16的表达。
【专利摘要】本发明涉及用于分类和预后哺乳动物、特别是人中的创伤的方法和试剂盒。所述方法定义了使本领域技术人员能够表征病理创伤愈合，诸如慢性或不愈合创伤的分子标签。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104540963
【申请号】CN201380024589
【发明人】C·迪加迪尔扎克, X·迪尔扎克, M·努瓦泽, E·拉古特, H·勒斯特克罗利于斯, M·格拉蒂尼, M·布施巴舍尔
【申请人】维瓦特什公司, 国家科学研究中心, 狄德罗-巴黎第七大学, 巴黎高等师范学院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年3月29日
【公告号】CA2868606A1, EP2831267A1, EP2831269A1, US20150087527, US20150126447, WO2013144348A1, WO2013144349A1, WO2013144672A1