一株产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及通过微生物学、分子生物学方法筛选得到一株产胞外多糖海水明串珠 乳酸菌，该菌株可用上海水鱼饲料微生态制剂。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌（Lactic acid bacteria)是一类能利用可发酵糖产生乳酸的细菌的通称。 乳酸菌通常是不运动、不产芽孢的革兰氏阳性菌，可在厌氧、兼性厌氧条件下生长。乳酸菌 通常耐酸，在pH为3. 0?4. 5时仍可生长，能耐受动物胃肠道的酸性环境，因此乳酸菌能在 恒温动物和鱼类胃肠道中广泛分布。
[0003] 乳酸菌胞外多糖（Exopoly Saccharides,EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到 细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜 多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物，乳酸菌 的胞外多糖具有免疫、抗肿瘤和抗溃疡活性，具有广阔的应用价值。
[0004] 作为鱼胃肠道固有菌群的组成部分，乳酸菌能定植于鱼类消化道，大量占据肠壁 上的靶细胞，形成生物保护屏障，抑制病原菌对肠壁的定植，维持肠道正常的微生态平衡， 其产生的多糖能提高鱼类自身的免疫力。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一株从海水鱼肠道分离得到的海水明串珠乳酸菌，该菌株具有产胞外 多糖的能力，并对海水鱼红细胞、血红素浓度有显著增加的效果。
[0006] 本发明公开了从海水鱼肠道筛选出产一种胞外多糖海水明串珠乳酸菌方法、该菌 的生物学特性、产胞外多糖的水平、作为微生态制剂应用的效果。
【附图说明】
[0007] 图1产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的多糖产生能力
【具体实施方式】
[0008] 1产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的筛选及鉴定
[0009] 1. 1产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的筛选
[0010] 无菌条件下对试验鱼进行活体解剖，取约4cm长的中肠段和幽门盲囊部用灭菌的 九盐溶液冲洗并研磨，分离上清液均匀涂布到海水MRS平板培养基，25°C厌氧培养直至长 出菌落；重复划平板厌氧培养，分离出单菌落。
[0011] 从黑鲷肠道分离得到呈乳白色，扁圆形凸状，直径1?3_的单菌落；分离菌株经 革兰氏染色后变紫色呈革兰氏阳性，无鞭毛、无芽孢；在25°C下有氧条件下培养48h后也有 乳白色扁圆形凸状菌落长出，可判断为兼性厌氧菌；40°C恒温培养箱中培养24h后，脱脂 乳试管出现凝固，无气泡，PH呈酸性；乳酸发酵表明，分离株产生的乳酸经H 2SO4和KMnO4处 理后能产生乙醛，使含氨的硝酸银滤纸条中硝酸盐溶液还原成金属银而变黑色。根据以上 结果初步确定分离株具有乳酸菌特征。
[0012] 1. 2产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的形态特征鉴定
[0013] 单菌落培养24h进行革兰氏染色，观察革兰氏染色结果和菌株菌体形态；分别进 行产酸试验、耐氧试验、试管凝固试验、发酵检测，并进行乳酸菌的生化鉴定。
[0014] 对分离菌株进行微量生化反应管鉴定显示，对葡萄糖、蔗糖、甘露醇、七叶苷、山梨 醇、甘露醇、麦芽糖、水杨苷、纤维二糖反应阳性，对还原性硝酸盐、精氨酸双水解酶、和明胶 液化液阴性，生化鉴定结果与伯杰氏细菌鉴定手册对比表明，分离株符合乳酸菌的生化反 应特性。
[0015] 1. 3产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的16S rDNA基因鉴定
[0016] 分离株 25°C厌氧培养 24h 提取基因组 DNA，引物 27F(5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）、1541R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）克隆 16S rDNA 基因，纯化后送大连宝生生物 技术有限公司测序；序列同源性与GenBank数据库进行比较，采用DNASTAR软件进行系统进 化分析。
[0017] 将分离株的16S rDNA基因序列在GenBank中进行同源性比较显示，与分离株同源 性超过98%的18条序列中，有16条属于肠膜明串珠乳酸菌属（Leuconostoc strain)。16S rDNA基因系统进化分析表明，分离株与Leuconostoc citreum st in的同源性最高，大于 99%，故将分离株归为肠膜明串珠乳酸菌。
[0018] 2产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的生物学特性
[0019] 2. 1酸、胆盐、蛋白酶、温度对产胞外多糖海水明串珠乳酸菌生长的影响
[0020] 2. I. IpH值对乳酸菌存活的影响
[0021] 用lmol/L HCI调节MRS液体培养基pH值在1. 5至4. 5,以MRS液体培养基原液 (pH5. 5)为对照。28°C常规培养4h后培养后平板计数，结果表明凝乳乳酸球菌在p H > 2. 5 至5. 5之间时，存活数维持在106mL-l，该乳酸菌对p H > 2. 5酸性环境具有一定的耐受性， p H = 1. 5时，存活数为4. 3X105,说明该乳酸菌对酸有较好耐受性。
[0022] 2. 1. 2胆盐对乳酸菌存活的影响
[0023] 试验添加不同浓度胆盐（0,1，2, 3和4g/L)，到pH值5. 5培养基，接种量为体积分 数的5%，28°C静置培养Ih后，平极计数结果：胆盐对凝乳乳酸球菌的存活有一定的影响， 在胆盐质量浓度为lg/L时，凝乳乳酸球菌的存活数均较高，为4. 2 X 106Π 1Γ1，经1?4g/L的 胆盐处理Ih后，凝乳乳酸球菌的存活数均在IO6Hir 1以上，说明凝乳乳酸球菌对胆盐有一定 的耐受性。
[0024] 2. 1. 3蛋白酶对乳酸菌存活的影响
[0025] 实验设4个不同质量浓度的胃蛋白酶处理（分别为4,6,8和10g/L)，以不加蛋白 酶（〇g/L)的培养基（pH5. 5)为对照，各处理组培养基均用lmol/L的NaOH和HCI溶液调 节pH于对照组相同。向各处理组及对照组培养基中分别接种活化菌种，接种量为体积分 数的5%。28°C条件下静置培养30min，取样进行平板菌落计数。胃蛋白酶对凝乳乳酸球菌 的存活有一定的影响，经4?10g/L的胃蛋白酶处理30min后，凝乳乳酸球菌的存活数均在 IO6Hir1以上，说明凝乳乳酸球菌对胃蛋白酶有一定的耐受性
[0026] 2. 1. 4温度对乳酸菌存活的影响
[0027] 将活化的乳酸菌菌液按体积分数5 %接种于MRS液体培养基，取菌液分别在28 (对 照），40,60,80°C处理30min，取样进行平板菌落计数。凝乳乳酸球菌活菌数随着处理温度 的升高而下降，70°C时，凝乳乳酸球菌存活数低于5. 0X IO4HiL'提示凝乳乳酸球菌对高温 的耐受能力较差。
[0028] 2. 2产胞外多糖海水明串珠乳酸菌抑制病原菌的能力
[0029] 将分离株接种于装有海水MRS液体培养基的厌氧试管25°C厌氧培养，于24、32、 40、48、56、64h各取出一管干燥称重法测定菌体浓度，另一管离心（2000r/min，IOmin)后取 上清液通过管碟法进行抑菌试验，测定抑菌圈直径。分离株培养24、32、40、48、56、64h的上 清夜，对三种致病性弧菌的抑制作用明显（表1);但进入稳定生长期（24-56h)后（菌体浓 度为I. 12-1. 23g/L)，对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的抑菌圈直径在I. 14-1. 22cm 之间，不同时间上清液的抑菌效果相互间没有明显变化（P>〇. 05)(表1)。
[0030] 表1不同培养时间的分离株上清液对致病性弧菌抑制效果
[0031]
【主权项】
1. 一株产胞外多糖海水明串珠乳酸菌，包括以下内容： (1) 一株产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的生物学特性； (2) -株产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的多糖产生水平； (3) 以分离得到的产胞外多糖海水明串珠乳酸菌作为海水鱼微生态制剂。
2. 根据权利要求1所述的一株产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的生物学特性，其特征在 于酸、胆盐、蛋白酶及温度对产胞外多糖海水明串珠乳酸菌生长的影响及产胞外多糖海水 明串珠乳酸菌对致病性弧菌的抑制效果。
3. 根据权利要求1所述的一株产胞外多糖海水明串珠乳酸菌产胞外多糖的能力,其特 征在于在MRS海水培养基中培养后产胞外多糖海水明串珠乳酸菌能产生胞外多糖的水平。
4. 根据权利要求1所述的以本产胞外多糖海水明串珠乳酸菌作为海水鱼微生态制剂， 其特征在于产胞外多糖海水明串珠乳酸菌所产胞外多糖能促进红细胞、血红素浓度显著增 加。
【专利摘要】乳酸菌(Lactic？acid？bacteria)是一类能利用可发酵糖产生乳酸的细菌的通称。乳酸菌通常是不运动、不产芽孢的革兰氏阳性菌，可在厌氧、兼性厌氧条件下生长。乳酸菌胞外多糖(Exopoly？Saccharides，EPS)是乳酸菌在生长代谢过和中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，具有免疫、抗肿瘤和抗溃疡活性。本发明从海水鱼肠道筛选一种产胞外多糖海水明串珠乳酸菌，该菌株具有产胞外多糖的能力，
【发明内容】
包括产胞外多糖海水明串珠乳酸菌的筛选及其生物学特性、产胞外多糖的水平以及以该菌为原料作为海水鱼微生态制剂的应用。
【IPC分类】C12R1-01, C12P19-04, C12N1-20, A23K1-18
【公开号】CN104560761
【申请号】CN201310472935
【发明人】戴贤君, 章蔚, 朱平杰
【申请人】中国计量学院, 戴贤君, 章蔚
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月11日