修饰的真菌细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明遗传修饰的木霉属（Trichoderma)真菌。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁由具有各种组成的e_(1，4)-连接的葡萄糖聚合物纤维素、半纤维素 多糖和木质素组成。前两种由植物分别以约7. 2和6X1010吨的年生产速度形成。因此它 们是地球上可再生碳来源的最大储存库，其可以用于生产生物燃料和其他生物炼制产品， 由此代替衍生自化石碳组分的产品。虽然用于使这些聚合物水解的化学和酶促方法是已知 的，但是酶促水解是优选的，因为其没有产生抑制性的副产物，并且因此具有环境相容性。
[0003] 里氏木霉（Trichodermareesei)在工业生产纤维素水解酶和半纤维素水解酶 中使用最为广泛，并且已经成为用于对这些酶进行研宄的范例。因此，与这些纤维素酶和 半纤维素酶的结构和功能有关的很多细节已经得到阐明，并且它们表达并且分泌到培养基 中的调控的若干方面也已有描述。里氏木霉的基因组序列已经公开（Martinez等，Nat. Biotech. 26 (2008)，553-560 ;包括UniProt数据库登录号G0RL42 (2011))。
[0004]Mukherjee等（AppliedandEnvironmentalMicrobiologyAPR 76 (2010) ,2345-2352)报道了通过VELVET蛋白veil对绿木霉（Trichodermavirens)中的 形态发生和生物控制性能的调控。Kubicek等（BiotechnologyforBiofuels2(2009)，19) 公开了用于通过红褐肉座菌（Hypocreajeorina(T.reesei))改善纤维素生成的代谢 改造策略。W0 2011/161063A1公开了具有转录促进蛋白甲基转移酶活性的多肽。TO 2010/060188A1公开了用于纤维素生成的宿主和发酵方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供提高纤维素水解酶和半纤维素水解酶和经受相同调控 环路的其他酶例如碳水化合物酯酶和几丁质酶在木霉属中的生产的方法。本发明还有一个 目的是提供经过修饰的木霉属真菌，所述经过修饰的木霉属真菌显示出与它们的野生型细 胞相比增加的纤维素水解酶和半纤维素水解酶的生成。
[0006]因此，本发明涉及肉座菌科的优选为木霉属或者肉座菌属的遗传修饰的真菌细 胞，所述真菌细胞能够以与没有修饰的野生型真菌细胞相比较高的量表达调控蛋白VEL1。
[0007] 今天，已知三种转录激活子即XYR1、ACE2和HAP2/3/5复合物以及两种抑制子CRE1 和ACE1参与纤维素酶调控。多细胞真菌中发育特异性基因表达的一个核心调节子（目前 还不知道影响纤维素酶和半纤维素酶基因表达）是VELVET(VeA，VEL1)。velvet调控蛋白 家族具有真菌特异性，但是在子囊菌（ascomycetes)和担子菌（basidiomycetes)中是高度 保守的。VeA最早在构巢曲霉（Aspergillusnidulans)中发现。在所述蛋白中携带有特异 性点突变的菌株产生比带有完整的VeA蛋白的野生型菌株更多的分生孢子和更少的子实 体。VeA同系物在其他子囊菌中的作用是多样化的，但是总是与发育和次生代谢有关。最 近的研宄已经证明，VeA还参与不同的曲霉（Aspergillusspp.)、产黄青霉（Penicillium chrysogenum)、顶头抱霉（Cephalosporiumacremonium)和绿木霉（Trichodermavirens) 的次生代谢（BayramandBraus，FEMSMicrobiolRev. 36 (2012):l-24)〇
[0008] 在2008年，发现在构巢曲霉（A.nidulans)中，VeA(VELl)和第二velvet家族蛋 白VelB与LaeA/LAEl形成三聚体复合物，该复合物对于协调次生代谢和黑暗中的发育是必 须的（Bayram等，Science320 (2008): 1504-1506)。然而，对于木霉属和任何其他真菌，还 没有描述涉及VEL1蛋白的纤维素酶和半纤维素酶基因表达的发育调控。
[0009] 令人惊讶的是，木霉属真菌中的VEL1的过表达被证明导致细胞中的纤维素酶、半 纤维素酶、碳水化合物酯酶和/或其他同多糖和杂多糖降解酶优选的是几丁质酶的生成的 显著增加。这些蛋白/酶的表达的这种增加是特别有利的，因为其允许例如包括例如纤维 素水解底物等生物底物降解得更好、更快并且降解得到改善。而且，工业有关的纤维素酶、 半纤维素酶、碳水化合物酯酶和其他同多糖和杂多糖降解酶如几丁质酶的生成能够比野生 型真菌细胞有效得多。
[0010] 术语"遗传修饰的"或者"重组的"在本文中根据它们确定的意思使用，以将"遗传 修饰的"或"重组的"细胞或核酸分子与天然存在的细胞或者核酸分子尤其是这些细胞或者 核酸分子的天然存在的相应物区分开。
[0011] 本文使用的术语"能够以与未修饰的野生型真菌细胞相比较高的量表达调控蛋白 VEL1"是指本发明的细胞以该细胞能够以比未修饰的细胞表达的VEL1的量更高的量表达 Veil的方式进行遗传修饰。可以通过使用相应的PCR技术测量mRNA转录本、通过使用基于 酶特异性抗体的方法（例如ELISA)测定所生成的酶的量、或者通过测定过表达的酶的酶促 活性来确定遗传修饰细胞和野生型细胞的VEL1表达的差异。相应的方法和措施在本领域 中是已知的。
[0012] 对于本领域技术人员来说，用于对真菌特别是肉座菌科的真菌进行遗传修饰的方 法是熟知的。
[0013] 根据本发明的一个优选的实施方式，编码所述VEL1蛋白的天然存在的基因被可 操作地连接至能够诱导与未修饰的野生型真菌细胞相比增加的VEL1蛋白的表达的重组启 动子。
[0014] 为了在本发明的所述遗传修饰的真菌细胞中过表达VEL1，编码真菌细胞的VEL1 蛋白的天然存在的基因被可操作地连接至重组启动子，该重组启动子不是野生型真菌细胞 的固有的Veil启动子。野生型veil启动子的交换允许提高真菌细胞中的VEL1蛋白的表 达速度，当然前提是所述重组启动子在所述遗传修饰的真菌细胞中具有更高的活性。将启 动子重组地导入到真菌尤其是木霉属真菌的染色体DNA的特定位点的方法对于本领域技 术人员来说熟知的。
[0015] VEL1蛋白过表达的条件取决于所使用的启动子。如果所述启动子是诱导型启动 子，那么必须采用相应的条件或者物质以开启或者调解该启动子的活性。
[0016] "被可操作地连接"是指并置情况（juxtaposition)，其中所述及的组分处于允许 它们以它们的所期望的方式发挥作用的关系。"被可操作地连接"至编码序列的启动子存在 于细胞中使得所述编码序列的表达受到所述启动子的直接影响。
[0017] 根据本发明的另一个优选的实施方式，所述真菌细胞包含表达载体，所述表达载 体携带编码VEL1蛋白的被可操作地连接至启动子的基因。
[0018] 为了提高VEL1在木霉属宿主细胞中的表达速度，可以向宿主细胞中导入携带有 编码所述VEL1蛋白的基因，所述基因被可操作地连接至启动子。由于肉座菌科的细胞特别 是木霉属的细胞天然地表达VEL1，因此所述载体可以包含被可操作地连接至veil基因的 野生型veil启动子。在同一启动子的控制下veil基因存在多于一个的拷贝已经导致VEL1 在这些细胞中的表达增加。
[0019] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述启动子选自由如下启动子组成的组： tefl启动子（转录延长因子1)、gpdl启动子、pkil启动子、enol启动子、pgkl启动子 和cdnal启动子（UzbasF等.ApplMicrobiolBiotechnol93(2012): 1601 - 1608; Trire2:110879,GenBankAccessionNo:GL985078. 1 ;Trire2accessionnumber accordingtoMartinezD等.NatBiotechnol.26(2008)，553-560)〇
[0020] 优选的启动子还选自由如下如下启动子组成的组：pkil、gpdA、gpdl 和hexl启动子。进一步优选的启动子还公开在例如Nakari-Setdla等（Appl. Env.Microbiol.61(1995)，3650_3655)、Rahman等（Biosci.Biotechnol. Biochem. 73 (2009)，1083-1089 ;egl3 和xyn3 启动子）、W0 98/23764A1 (短cbhl启动子）、 EP0 952 223A1 (绿色木霉（Trichodermaviride)的cbhl-启动子）、US7,393,664、US 7, 517, 685(hexl启动子）和Mach等（Curr.Genetics25 (1994): 567-570 ;pkil)中。在本 发明的一个优选的实施方式中，所述启动子可以具有异源或者同源的来源。
[0021] 最优选的启动子是tefl启动子、cdnal启动子、pgkl启动子和pkil启动子。
[0022] 当然，也可以使用能够用来调控宿主生物体例如里氏木霉（Trichodermareesei) 中的基因表达的其他任何启动子。特别优选的启动子是调控里氏木霉中的如下蛋白的 蛋白表达的那些启动子：GH5糖苷水解酶（蛋白ID81087)、慢生根瘤菌博来霉素抗性 (Bradorhizobiumbleomycinresistance)(蛋白ID103009)、未知的假定蛋白（蛋白ID 106270)、HHE域蛋白、保守的（蛋白ID70608)、假定保守蛋白（蛋白ID109925)、PTH11-型 GPCRs(蛋白ID109146)、MSF通透酶（蛋白ID78585)、谷胱甘肽-S-转移酶（蛋白ID 112022)、过氧化氢酶（蛋白ID58472)、甘露糖-6-磷酸异构酶（蛋白ID60445)、未知蛋 白（蛋白ID105287)、翻译起始调节子Gnc20(蛋白ID22839)、咪唑丙酸酶（imidazole proprionase)相关的氨基水解酶（蛋白ID110757)、MSF转运子（蛋白ID3405)、短链 脱氢酶/还原酶（蛋白ID106164)、MSF通透酶（蛋白ID79202)、未知蛋白（蛋白ID 60370)、假定分泌蛋白（蛋白ID122889)、黄酮醇还原酶/肉桂酰基-CoA还原酶（蛋白ID 111716)、锌结合氧化还原酶（蛋白ID23292)、假定蛋白（蛋白ID124198)、未知蛋白（蛋 白ID109523)、犬尿氨酸氨基转移酶、谷氨酰胺转氨酶K(蛋白ID122820)、GPR1/FUN34/ yaaH-样蛋白（蛋白ID60810)、假定蛋白（蛋白ID54352)、预定Zn-依赖型水解酶（0-内 酰胺酶超家族）（蛋白ID70197)、亚硫酸盐报告子ssul(蛋白ID2076)、未知蛋白（蛋白 ID4851)、未知分泌蛋白（蛋白ID110830)、未知酯酶/脂肪酶（蛋白ID70491)和MSF通 透酶（蛋白ID105260)。这些基因在纤维素诱导条件（例如里氏木霉在乳糖上的培养）下 受调控地上调。
[0023] 肉座菌科的真菌细胞优选为木霉属或者肉座菌属的真菌细胞。
[0024] 肉座菌科是奠壳菌纲（Sordariomycetes)中的一个科。这个科的真菌包括若 干个属：Aphysiostroma、葡枝霉属（Cladobotryum)、胶枝霉属（Gliocladium)、肉座菌 属、类肉座菌属（Hypocreopsis)、菌寄生属（Hypomyces)、琉孢霉属（Mycogone)、丛赤壳 属（Nectria)、肉棒菌属（Podostroma)、Protocrea、Rogersonia、Sarawakus、黄瘤抱属 (Sepedonium)、泥炭藓属（Sphaerostilbella)、Sporophagomyces、冠抱属（Stephanoma)和 木霉属，由此准备根据本发明进行遗传修饰的所述真菌细胞优选为木霉属或者肉座菌属的 真菌细胞。
[0025] 木霉属包括若干个种，由此里氏木霉是最优选的代表。
[0026]VEL1蛋白的氨基酸序列和编码VEL