培育水稻温敏不育系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水稻温敏不育系的培育方法，具体涉及一种利用TALEN系统定点突变 RNaseZS1培育水稻温敏不育系的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是最主要的粮食作物，全世界超过一半的人口以水稻为 主食。随着人口的增长以及可耕地面积的减少，粮食的供需不平衡变得日益显著，增加粮食 单位面积产量是解决粮食供需不平衡的主要措施之一。幸运的是，杂交水稻可以比常规水 稻提高20-30%的产量，在解决粮食不足的问题上起到了非常重要的作用，因此，杂交水稻 的种植面积稳步上升，现在大约占水稻种植面积的60%左右。
[0003] 根据所使用的不育系类型的不同可以将杂交水稻育种的方法分为两系法和三系 法。三系法使用细胞质雄性不育系和恢复系生产杂种匕代种子，通过保持系和细胞质雄性 不育系杂交繁殖细胞质雄性不育系；但是可以作为恢复系的水稻品种在常规水稻中大约只 占5%，这大大降低了恢复系和不育系间的遗传多样性，限制了杂种优势的利用。而两系法 主要用光/温敏雄性核不育系作为不育系和保持系，因为光/温敏不育系育性受光周期和 温度调控，在不育条件下可作为不育系，在可育条件下可作为保持系，一系两用。而且因为 不受核质互作影响，几乎所有的正常品种都是可以作为恢复系的。基于这些本质上的差异， 两系法杂交水稻技术具有更为广泛的恢复系，不需要利用特殊的恢复基因，使得组合配制 更加自由，有利于亚种间杂种优势的利用，对提高杂交水稻组合的米质、产量、抗性等存在 更大的潜在优势；光/温敏不育系可一系两用，不需要保持系，简化生产程序；温敏不育性 受核基因控制，与细胞质无关，丰富了细胞质遗传的多样性，避免了三系杂交稻不育细胞质 的负效应以及细胞质单一可能带来的潜在危险。因此温敏不育系在杂交水稻育种中存在巨 大潜力，相比而言，目前在两系杂交水稻育种中广泛应用的为温敏不育系。
[0004] 安农S-1温敏不育系是第一个被发现的籼型温敏不育突变体，温敏不育材料往往 通过自然突变或人工诱变获得，但是突变频率非常低，而利用传统育种手段将突变获得的 温敏不育材料培育成为温敏不育系需要漫长的过程，提高温敏不育系的培育效率缩短培育 进程已经成为迫切需要解决的关键问题。因此必须使用遗传工程手段，突破传统育种的局 限。尽管，RNAi和反义RNA技术可实现对靶基因的抑制表达，但是并不能彻底去除基因的功 能，基因残留的功能往往会提高转基因植株的不育起点温度，不利于育种的安全，而且这些 转基因植株中不可避免的会残留外源序列，涉及转基因食品安全问题。最近，靶向突变技术 取得了突破性进展，已广泛应用于各类生物中。这些方法都是通过特异的靶识别序列或引 导序列将核酸内切酶引导到靶标位置，然后核酸内切酶切割靶标DNA，在细胞自身修复系统 的帮助下将切断的DNA修复链接起来，但是在修复过程中经常会导致碱基丢失或增加。目 前，虽然已经通过RNAi技术干涉RNaseZS1，获得温敏不育植株；但是RNAi技术只是部分降 低了RNaseZS1的表达量，并不能使其彻底失活，使得转基因植株的不育起点温度较高，并且 不育起点温度不稳定，影响制种安全。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利利用TALEN系统定点突 变RNaseZS1培育水稻温敏不育系的方法，通过TALEN系统定点突变失活RNaseZS1蛋白的 活性，获得人工培育不带转基因成分的实用型温敏不育系，具有目的性强，基因组损伤小， 规避了转基因带来的可能风险。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 一种利用TALEN系统定点突变RNaseZS1培育水稻温敏不育系的方法，其包括以下 步骤：
[0008] 1)靶标序列设计：根据RNaseZS1在水稻的TMS5或0s02g0214300或LOC_ 0s02gl2290编码区分别设计左侧TALE识别序列、右侧TALE识别序列；
[0009] 2)将左、右侧TALE识别序列转化成识别模块：根据TALE蛋白RVD区的碱基识别 原则将左、右两侧TALE识别序列转化成识别模块；
[0010] 3)构建含上述步骤2)识别模块的TALEN载体；
[0011] 4)合成含TALEN-L和TALEN-R的双元载体；
[0012] 5)遗传转化获得阳性转基因植株；
[0013] 6)筛选阳性转基因植株获得突变的植株；
[0014] 7)将上述突变的植株传代种植和分离，获得育性恢复可育且不带转基因成分的植 株作为温敏不育株。
[0015] 具体地，步骤1)中，根据RNaseZS1在水稻的TMS5或0s02g0214300或LOC_ 0s02gl2290编码区分别设计左侧TALE识别序列和右侧TALE识别序列。左右侧识别序列一 般间隔13-22碱基，18个碱基为最佳，识别序列长度一般为16-20个碱基。
[0016] 具体地，步骤3)中，含上述步骤2)识别模块的TALEN载体为：首先合成与识别模 块每一个碱基对应的TAL识别模块，按照识别序列将所述TAL识别模块聚合，然后分别将两 个聚合的TALE模块链接到内切核酸酶FokI的N-末端，形成能特异性剪切DNA序列的内 切核酸酶TALEN;经酶切和测序获得阳性质粒；分别形成TALEN-L和TALEN-R。
[0017] 具体地，步骤4)中，合成含TALEN-L和TALEN-R的双元载体的步骤为：将TALEN-L 和TALEN-R载体中的TALEN表达盒切割下来链接到同一个双元载体中，形成TALEN双元载 体。
[0018] 具体地，步骤5)具体为：将TALEN双元载体通过农杆菌介导的遗传转化法或基因 枪法转化水稻愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素 鉴定并收集阳性转基因植株。
[0019] 具体地，步骤6)具体为：提取T。代阳性转基因植株的DNA，用引物SEQIDNO. 5和 SEQIDNO. 6进行扩增，产物经纯化后送公司测序，测序结果与转基因前的野生型植株序列 进行比较，碱基缺失、插入或替换的植株为突变成功的植株。
[0020] 具体地，步骤7)具体为：收获I；代实现定点突变的植株的种子，在高温/长日条 件下种植1\代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的 植株种植于低温/短日条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏 不育系。
[0021] 具体地，在本发明中步骤6)所述突变的植株表现为碱基缺失或碱基插入或碱基 替换。
[0022] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0023] 1.本发明所述的利用TALEN系统定点突变RNaseZS1培育水稻温敏不育系的方法 将定点突变得到温敏不育突变体，实现了人工培育实用型温敏不育系，且这种温敏不育系 是可以不带转基因成分的，具有目的性强，基因组损伤小的优点，能够规避转基因可能带来 的风险；
[0024] 2.本发明所述的利用TALEN系统定点突变RNaseZS1培育水稻温敏不育系的方法 缩短了培育温敏不育系的时间，加快了育种的进程，节省了成本；
[0025] 3.本发明所述的方法基本不改变受体材料的遗传背景，并可以通过将三系杂交水 稻的保持系定点突变为温敏不育系，可将三系杂交稻改为两系杂交稻，拓展恢复系的筛选 范围，提尚杂种优势利用效率，进而提尚广量、抗性和稻米品质；
[0026] 4.本发明克服了自然突变或传统的人工诱变TMS5(RNaseZS1)失活的新突变所存 在的难题；诱变新的可用于两系杂交育种的温敏不育系。
[0027] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例1所获得的TMSS-l-lTdf植株潮霉素鉴定结果，其中1-7分 别为代植株中的7株；
[0029] 图2为实施例1中所获得的TMS5-1-2植株在不同温度条件下的花粉育性，其中， HT表示高温，LT表示低温，WT表示转基因前的植株；
[0030] 图3为本发明实施例2获得的11^5-2-1!\代植株潮霉素鉴定结果，其中1-8分别 为代植株中的8株；
[0031] 图4为本发明实施例2TMS5-2-1第7株植株不同温度条件下的花粉育性，其中 ZH11表示