野生型水稻中花11，HT表示高温，LT表示低温。
【具体实施方式】
[0032] 一种利用TALEN系统定点突变RNaseZS1培育水稻温敏不育系的方法，其包括以下 步骤：
[0033] 1)靶标序列设计：根据RNaseZS1在水稻的TMS5或0s02g0214300或LOC_ 0s02gl2290编码区分别设计左侧TALE识别序列、右侧TALE识别序列；
[0034] 2)将左、右侧TALE识别序列转化成识别模块：根据TALE蛋白RVD区碱基识别原 贝1J，将左、右两侧TALE识别序列转化成识别模块；
[0035] 3)构建含上述步骤2)识别模块的TALEN-L和TALEN-R载体；
[0036] 4)合成含TALEN-L和TALEN-R的双元载体；
[0037] 5)遗传转化获得阳性转基因植株；
[0038] 6)筛选阳性转基因植株中获得突变的植株；
[0039] 7)上述突变的植株传代种植，获得不带转基因成分且育性恢复可育的植株作为温 敏不育株。
[0040]具体地，步骤1)中，根据RNase ZS1在水稻的TMS5或0s02g0214300或LOC_0s02gl2290编码区分别设计左侧TALE识别序列、右侧TALE识别序列。左右侧识别序列一 般间隔13-22碱基，18个碱基为最佳，识别序列长度一般为16-20个碱基。
[0041] 具体地，步骤3)中，含上述步骤2)识别模块的TALEN载体为：首先合成与识别模 块每一个碱基对应的TAL识别模块，按照识别序列将所述TAL识别模块聚合，然后分别将两 个聚合的TALE模块链接到内切核酸酶FokI的N-末端，形成能特异性剪切DNA序列的内 切核酸酶TALEN;经酶切和测序获得阳性质粒；形分别成TALEN-L和TALEN-R。
[0042] 具体地，步骤4)中，合成含TALEN-L和TALEN-R的双元载体的步骤为：将TALEN-L 和TALEN-R载体中的TALEN表达盒切割下来链接到同一个双元载体中，形成TALEN双元载 体。
[0043] 具体地，步骤5)具体为：将TALEN双元载体通过农杆菌介导的遗传转化法或基因 枪法转化水稻愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，炼苗后将转基因植株种植于网室，通过 潮霉素检测并收集阳性转基因植株。
[0044] 具体地，步骤6)具体为：提取T。代阳性转基因植株的DNA，用引物SEQID NO. 5和 SEQID NO.6进行扩增，产物经纯化后送公司测序，测序结果与未转基因的野生型植株序列 比较，有替换或碱基缺失或插入的植株为突变成功的植株。
[0045] 具体地，步骤7)具体为：收获I；代实现定点突变的转基因植株的种子，在高温/长 日条件下种植代植株，通过表型观察和潮霉素阳性鉴定分离到不带转基因成分且表型不 育的植株种植于低温/短日条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得 温敏不育系。
[0046] 具体地，在本发明中步骤6)所述突变的植株表现为在RNaseZS1识别序列间缺失 碱基或插入碱基或碱基替换。
[0047] 以下是本发明具体的实施例。
[0048] 实施例1
[0049] 在粳稻品种中花11中利用TALEN系统定点突变RNaseZsl(0s02g0214300)培育温 敏不育系，具体步骤如下：
[0050] 1)靶标序列设计：
[0051]左侧TALE识别序列Target-TMS5-1L，序列为SEQ ID NO. 1 :CGGCCGAAGGCGAAGGC， 位于0s02g0214300编码区的61-77 ;
[0052]右侧TALE识别序列Target-TMS5-1R，序列为SEQ ID NO. 2 :CCACGGGGTAGCCCTC，位 于0s02g0214300编码区的94-109 ;
[0053] 2)将左、右两侧TALE识别序列转化成识别模块：
[0054]Target-TMS5-1L转化成TALE识别模块（其中每两个氨基为一个模块）的RVD 序列为SEQIDNO. 3：HisAspAsnAsnAsnAsnHisAspHisAspAsnAsnAsnlieAsn lieAsnAsnAsnAsnHisAspAsnAsnAsnlieAsnlieAsnAsnAsnAsnHisAsp； Target-TMS5-1R转化成TALE识别模块的RVD序列SEQIDNO. 4：HisAspHisAspAsnlie HisAspAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnGlyAsnlieAsnAsnHisAspHisAsp HisAspAsnGlyHisAsp；
[0055] 3)构建含上述左、右两侧TALE识别模块的TALEN载体：
[0056] 分别合成每一个碱基对应的TAL识别模块，按照识别序列所述识别模块聚合， 分别将两个聚合的TALE模块链接到内切核酸酶FokI的N-末端，形成能特异性剪切 DNA序列的内切核酸酶TALEN;经酶切和测序验证阳性质粒，分别形成TALEN-TMS5-1L和 TALEN-TMS5-1R；
[0057] 4)构建含TALEN-TMS5-1L和TALEN-TMS5-1R的TALEN双元载体：
[0058] 将TALEN-TMS5-1L和TALEN-TMS5-1R载体中的TALEN表达盒切割下来链接到同一 个双元载体中，形成TALEN-TMS5-1载体；
[0059] 5)遗传转化获得阳性转基因植株：
[0060] 将含靶标的TALEN-TMS5-1载体通过农杆菌介导的遗传转化转化水稻愈伤组织； 经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴定阳性转基因植株；
[0061] 6)阳性转基因植株经纯化后获得突变的植株：
[0062] 提取T。代阳性植株的DNA，用引物TMS5sF，序列为SEQIDNO. 5 : AACCTCTTACAGGCTAGATG和TMS5sR，序列为SEQIDNO. 6:TCGTGCTCCTGACCAATCTC扩增上 述DNA，产物经纯化后送公司测序，测序结果与转基因前的野生型植株序列比较，分析突变 情况，具体参见SEQIDNO. 7-SEQIDNO. 9;
[0063] WT(SEQ ID NO. 7) ：CGGGTCGGCCGAAGGCGAAGGCGCCGCCCCTCACCGTCGAGGGCTACCCCGTG GAGGGCA
[0064] TMS5-卜1(SEQIDNO. 8) :CGGGTCGGCCGAAGGCGAAGGCGCCGCCCC**ACCGTCGAGGG CTACCCCGTGGAGGGCA
[0065]TMS5-1-2(SEQIDNO. 9):CGGGTCGGCCGAAGGCGAAGGCGCCGCC*******GTCGAGGG CTACCCCGTGGAGGGCA
[0066] 其中，TMS5-1-1和TMS5-1-2表示不同的转基因株系；WT表示野生型；序列中 表不喊基缺失；测序结果显不：突变植株占总阳性转基因植株的5. 7%，喊基的缺失说明定 点突变成功；及该突变类型为碱基缺失；
[0067] 7)上述突变的植株传代种植，获得育性恢复可育的植株作为温敏不育株：
[0068] 收获I；代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植Ti代植株，通过 育性观察和潮霉素阳性鉴定分离到不带转基因成分且表型不育的植株种植于短日/低温 条件下，花粉育性可恢复的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系；结果参见图1 和2〇
[0069] 图1的结果表明，1\代植株中2和5是不带转基因成分的；图2结果表明，2号植 株在高温下表现为花粉败育，而低温下表现为育性恢复。
[0070] 实施例2
[0071] 在粳稻品种中花11中利用TALEN系统定点突变RNaseZsl(0s02g0214300)培育温 敏不育系，具体步骤如下：
[0072] 1)靶标序列设计：
[0073]左侧TALE识别序列Target-TMS5-2L，序列为SEQIDNO. 10 :CACCGTCGAGGGCTAC， 位于 0s02g0214300 编码区的 87-102;
[0074] 右侧TALE识别序列Target-TMS5-2R，序列为SEQI