低样本容量的凝血检测的制作方法
【专利说明】低样本容量的凝血检测
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请声明拥有2012年7月18日提交的美国临时申请序列号61/673, 227的权 益，将其以引用方式完全纳入本文。
[0003] 背景资料
[0004] 凝血是一个复杂的过程，血液或血浆通过该过程形成血凝块。它是机体内稳态的 重要部分，停止自损伤血管的失血，且受损血管管壁通过血小板和含有纤维蛋白的血凝块 覆盖进行止血，并开始损伤血管的修复。由于凝血不充分可以导致出血风险增加（出血）， 而过度凝血可以导致阻塞性血块（血栓形成），所以凝血过程在整个生物机体中被严格地 控制并处于高度守恒状态。
[0005] 凝血异常非常危险，而且很难对处理和控制凝血的治疗方法进行管理，实施起来 也很危险。除此以外，许多患者长期服用抗凝药进行治疗，例如心脏瓣膜置换后使用华法 令，需要对抗凝效果进行监测。能够将凝血参数，特别是凝血时间（"PT"，也可以用数学转 换形式表达为国际标准化比值："INR"）和激活部分凝血时间（"aPTT"）作为更全面的健 康和治疗检测项目的一部分进行监测是极为有益的，这些项目是对一些生物标记物和其他 治疗性药物进行测定。PT、INR和aPTT可以在临床实验室通过传统方法进行测定，但需要 相对较大的血液或血浆容量，通常是采集5mL样本至容量固定的真空试管内。为了提高对 患者凝血参数的监测，需要改进凝血检测的实施方法和凝血参数的测定方法。
[0006] 摘要
[0007] 发明者认识到需要使用和提供一种方法，通过微量血液样本来测定凝血参数。有 利的是，此处所描述的方法可以通过一滴血（大约20μυ中的一个微量全血或血浆进行检 测，同时通常保留出足够量的样本用于执行其他测定，可选择地以一种复合检测的模式进 行。该方法和设备不需要有经验的操作人员，并且可以在定点服务场所进行，这对于凝血异 常的处理以及治疗非常重要，可以提供有用的信息用以调整药物使用剂量和次数。
[0008] -些实例中，用来检测凝血的方法包括：Α)对一份微量血液样本（例如20 μ 1或 更少）的凝血进行监测；Β)对一份血液样本的全部或一部分进行稀释，使用稀释后的血液 样本进行检测，这样可以减少用于该检测的总样本量。
[0009] -方面，多种技术被提供用来对稀释后或未稀释的样本进行凝血检测。一个实例 中，一种凝血检测在一个小容器内进行，该容器含有较高的表面积/体积比值，有助于初始 血凝块附着到该容器的表面。另一个实例中，一种外源性的可以在凝血过程中生成的物质 (例如纤维蛋白原）被添加至样本中，以增加血凝块的强度和（或）浊度。另一个实例中， 一些小滚珠被添加至一份血样中，并使用视频成像跟踪该滚珠因重力所致的沉淀运动，当 血凝块形成后这种运动则会减小或终止。另一个实例中，一些小荧光滚珠被添加至一份血 样中，并使用荧光显微镜跟踪该滚珠因布朗运动、以及因对流和（或）气流所致的运动，当 血凝块形成后这种运动则会减小或终止。在另一个实例中，一份血液样本在外力推动下通 过一个容器，视频成像被用于跟踪该样本运动，当血凝块形成时该样本在容器中的运动会 减小或终止。
[0010] 一方面，此处所提供的方法用于测定一个研究对象血液样本的凝血时间。该方法 含有（a)启动该研究对象血液样本的一个凝血反应；(b)获得一套凝血反应图像；（c)对该 套图像进行分析以测定该血液样本的凝血时间。
[0011] 一方面，此处所提供的方法用于测定一个研究对象血液样本的凝血时间。该方法 含有（a)通过非静脉途径从研究对象处获得一份血液样本；(b)启动该血液样本的一个凝 血反应；（c)获得一套凝血反应图像；（d)对该套图像进行分析仪测定该血液样本的凝血时 间，其中执行步骤（a)到（d)所需时间小于或大约为1小时。一些实例中，执行步骤（a)到 (d)所需时间小于或大约为30分钟。一些实例中，执行步骤（a)到⑷所需时间小于或大 约为10分钟。
[0012] 在一些实例中，20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1以1或 更少量的血样被用于凝血检测。
[0013] 在一些实例中，该凝血反应的血容量少于或大约为20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1μ 1。
[0014] 一些实例中，该套图像中的一幅单独图像被像素化，含有至少1、10、100、500、 1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000 或 10000 个像素。
[0015] 一些实例中，该方法还进一步含有对该血液样本进行稀释，这样稀释后该样本的 凝血时间会介于30秒到10分钟之间。
[0016] 一些实例中，该方法进一步含有向凝血反应中添加纤维蛋白原。
[0017] -些实例中，其起始步骤含有向该血液样本中加入一种凝血启动试剂。
[0018] 一些实例中，该血液样本是一份血浆样本。
[0019] 一些实例中，该血液样本通过指尖采血获得。
[0020] -些实例中，该图像是凝血反应的光散射图像。
[0021] 一些实例中，凝血时间根据该散射光强度的转变进行测定。
[0022] -些实例中，该方法进一步含有在获得整套图像前向该血液样本中添加一种多元 化的滚珠。例如，至少有2、3、4、5、10、100或1000个滚珠可能被添加至该血液样本内。
[0023] 一些实例中，该多元化滚珠至少包括两种不同的尺寸。
[0024] -些实例中，该多元化滚珠的尺寸从1 μ m到5 μ m。
[0025] 一些实例中，该多元化滚珠的尺寸从5 μ m到50 μ m。
[0026] -些实例中，该多元化滚珠包括一种或多种聚苯乙烯、乳胶、丙烯酸塑料或玻璃材 料。在特定方面，这些滚珠可能具有与反应介质不同的折射率（例如高于或低于1、2、3、4、 5、8、10、15、16、20、25、30、35、40或50% )，或者可能是不透光的。而且，这些滚珠可能具 有与反应介质不同的密度（例如高于或低于1、2、3、4、5、8、10、15、16、20、25、30、35、40或 50%)。一些检测中，该反应介质的密度为1.01g/cc。
[0027] -些实例中，对该套图像的分析步骤含有对滚珠大致上变为无运动时的时间点进 行设置。
[0028] -些实例中，对该套图像的分析步骤含有对滚珠运动能力发生变化时的时间点进 行设置。
[0029] -些实例中，滚珠运动能力发生变化可通过该滚珠在凝血反应中的沉淀减速来得 以证实。
[0030] -些实例中，对该套图像的分析步骤含有对该套图像中的两幅图像进行比较，以 测定滚珠的运动状态。
[0031] 一些实例中，如果两幅图像大致相同，说明该滚珠基本上无运动。
[0032] 一些实例中，该滚珠被标记。
[0033] -些实例中，该滚珠被一种突光标记物标记。
[0034] 另一方面，一种方法被提供用于测定一个研究对象血液样本中的多个凝血参数。 该方法含有（a)获得该研究对象的血液样本，而该血样少于或大约50 μ 1，（b)从该血液样 本中制备血浆样本。（C)通过该血浆样本实施多个检测以测定多个凝血参数，其中多个参数 中至少有一个是凝血时间。
[0035] 一些实例中，其中的一个凝血参数从下列一组参数中选择：激活部分凝血时间 (aPTT)、凝血时间（PT)、国际标准化比值（INR)、出血时间、凝血因子、抗磷脂抗体、稀释拉 塞尔氏蝰蛇毒试验（dRVVT)以及血小板功能、血栓弹力图（TEG或Sonoclot)和优球蛋白溶 解时间（ELT)。
[0036] 一些实例中，使用不到10 μ 1的血浆样本进行多项检测中的一项单独检测。一些 实例中，使用不到2μ 1的血浆样本进行多项检测中的一项单独检测。
[0037] -些实例中，该多项检测中的一些检测或每一项检测，其反应容量大约或少于 6 μ 1。一些实例中，该多项检测中的一些检测或每一项检测，其反应容量大约或少于10 μ 1。
[0038] 一些实例中，进行凝血测定检测的时间少于或大约为1小时、30分钟、10分钟、5分 钟或1分钟。
[0039] -些实例中，获得一套凝血反应图像包括（i)获得一套该多项检测中至少一项检 测的图像；（ii)对该套图像进行分析以测定凝血时间。
[0040] 一方面，一个用于测定一个研究对象血液样本凝血时间的设备被提供。该设备含 有（a) -个组成部分设计用来在一种适合血凝块生成的条件下，向来自研究对象的血液 样本中添加一种凝血启动试剂，以启动凝血反应；(b) -个组成部分设计用来获得一套该 凝血反应的图像；(c) 一个组成部分用于对该套图像进行分析以测定该血液样本的凝血时 间。
[0041] 一方面，一个用于测定一个研究对象血液样本凝血时间的系统被提供。该系统含 有（a) -个设备设计用来在一种适合血凝块生成的条件下，向来自研究对象的血液样本中 添加