一种提高氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酮基-l-古龙酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种提高氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酬基-k古龙酸的方法，属于基因 工程技术领域。
【背景技术】
[000引维生素"Vitamin C，VC)，又称抗坏血酸（Ascorbic acid)，是一种人体必需的 维生素和抗氧化剂，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等工业。目前国内维生素C工 业化生产采用两步发酵法，该方法第二步发酵，即将山梨糖转化2-KLG，是由巨大芽抱杆菌 炬acillus megaterium)和普通生酬基古龙酸菌（Ketogulonigenium vulgare)组成的混菌 发酵系统实现的。在该系统中，执行糖酸转化的微生物只有小菌化vulgare)，然而小菌单 独生长困难，需要大菌化megaterium)伴生才能正常生长。混菌发酵控制为生产工艺增加 了很大困难，且小菌产酸性状不稳定，经常因菌种退化造成倒罐，导致生产屡受重创。我国 维生素C生产由3种细菌参与，势必在微生物代谢过程中造成底物和培养基的大量浪费，而 两步发酵过程不但延长了生产周期还增加了能源和人力成本。因此，现有维生素C两步发 酵工艺尚存在巨大的发展潜力。
[0003] 氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)是两步发酵法生产2-KLG中第一步 发酵过程常用菌种，通过基因工程手段将维生素C两步发酵有关基因克隆到G. oxydans中 构建得到一步发酵菌株，实现由山梨醇经单菌一步发酵生成2-KLG，解除了小菌对伴生菌依 赖的问题，简化了维生素C生产工艺。
[0004] 化tA是一种微生物调节蛋白，可形成=聚体结构，并且具有交联作用。本发明利 用CutA蛋白S聚体交联作用，结合内蛋白（包括接头蛋白和配体蛋白）的自聚集作用，将 化tA基因与糖酸转化中的关键酶基因融合表达，改造G. oxydans -步发酵生产2-KLG(Vc 前体），最终提高了 2-KLG的产量。本发明通过表达外源蛋白化tA实现细胞内酶的交联， 有利于多种酶连续催化反应，并且外源蛋白耐热性使工程菌的耐热性有所提高，对维生素C 一步发酵生产具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种提高氧化葡萄糖酸杆菌生产2-酬 基-k古龙酸（2-KLG)的方法，是W氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)为宿主， 基于接头蛋白甜3及其配体蛋白甜3iig，将化tA基因与糖酸转化中的山梨糖脱氨酶基因、山 梨酬脱氨酶基因进行融合表达。
[0006] 本发明的一种实施方式，是将编码耐热交联蛋白的基因cutA通过编码接头蛋白 S册及其配体蛋白甜的基因克隆于质粒pGUC-化巧-S化-GGGGS-sn化上，构建表达质粒 pGUC-UifB-S册-S化-GGGGS-sn化-UifB-S册lig-(GGGG巧2-cutA，再转化氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter oxydans)生产 2-KLG。所述质粒 pGUC-1:ufB-s化-GGGGS-sn化的构建方法， 参见文献Stepwise metabolic engineering of Gluconobacter oxydans WSH-003 for the direct production of 2-keto-L-gulonic acid from D-sorbitol(Gao L, et al. Metab. Eng. 2014Tul ;24:3〇-7)中质粒 pGUC-k0203-GS-k0095 的构建方法。
[0007] 本发明的一种实施方式，是将编码接头蛋白甜3、山梨糖脱氨酶和山梨酬脱氨酶的 基因进行融合，连接启动子化巧，将编码配体蛋白甜的基因与cutA基因进行融合，也连 接一个启动子化巧，将上述两融合基因片段W质粒pGUC为出发载体构建表达载体pGUC-化 fB-S册-S化-GGGGS-sn化-化fB-S册lig-(GGGG巧2-cutA ;将得到的表达载体转化G. oxydans 得到重组菌。GGGGS、（GGGG巧2为连接肤，分别连接山梨糖脱氨酶、山梨酬脱氨酶，和甜3 lig、 QitA。
[000引在本发明的一种实施方式中，所述cutA基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，编码所述接头蛋白甜3及其配体蛋白甜的核巧 酸序列分别如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌是G. oxydans WSH-003。
[0011] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌一 步工程菌的构建方法，是将编码接头蛋白SH3、山梨糖脱氨酶和山梨酬脱氨酶的基因进行融 合，连接启动子化巧，将编码配体蛋白甜的基因与cutA基因进行融合，也连接启动子 化巧，将上述两基因片段W质粒pGUC为出发载体构建表达载体pGUC-化巧-S册-S化-GGGGS -sn化-tu巧-S册lig-(GGGG巧2-cutA ;将得到的表达载体转化G. oxydans得到重组菌株。
[0012] 具体地，所述构建方法包括：
[0013] (1) W编码连接肤GGGGS的基因连接编码山梨糖脱氨酶的基因S化和编码山梨 酬脱氨酶的基因sn化，得到序列如SEQ ID NO. 5所示的S化-GGGGS-sn化的序列；融合 编码接头蛋白甜3的序列SEQ ID NO. 2和S化-GGGGS-sn化，得到甜3-S化-GGGGS-sn化； W质粒PGUC为载体，酶切连接tWB启动子，得到带接头蛋白的脱氨酶融合表达载体 pGUC-化 fB-S 册-S 化-GGGGS-sn 化；
[0014] (2) W编码连接肤（GGGG巧2的基因连接编码配体蛋白甜3 lie的基因与cutA基因， W质粒pGUC为载体，酶切连接UifB启动子，得到pGUC-UifB-S册lig-佑GGG巧2-cutA ;
[0015] (3)将两个表达质粒pGUC-UifB-S册-S化-GGGGS-sn化和
[0016] pGUC-化巧-S册lig-佑GGG巧2-cutA，通过酶切连接，得到重组表达载体
[0017] pGUC-tufB-細 3-S 化-GGGGS-sn 化-tufB-細 31ig-(GGGGS)2_cutA，电转至 G. oxydans得到一步工程菌。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述cutA基因的核巧酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，编码所述接头蛋白甜3及其配体蛋白甜的核巧 酸序列分别如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，化巧启动子核巧酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0021] 本发明要解决的第=个技术问题是提供一种应用所述氧化葡萄糖酸杆菌一步工 程菌发酵生产2-KLG的方法，是将活化后的工程菌，按15% (v/v)接种量转接至发酵培养 基，30°C，200r/min，发酵 16她。
[002引活化用种子培养基（g/L);山梨醇15,酵母粉1. 0, pH4. 8~5. 1，琼脂20 (固体培 养基），12rC灭菌15min，氨节青霉素终浓度lOOyg/mL。
[0023] 所述发酵培养基（g/L);山梨醇15,酵母粉1. 2,氯化巧0. 2,初始抑5. 1~5. 4， 121°C灭菌15min，氨节青霉素终浓度lOOyg/血。
[0024] 本发明通过基因工程改造，基于接头蛋白甜3及其配体蛋白甜3iig，将化tA基因与 糖酸转化中的关键酶基因融合表达，改造G. oxydans -步发酵生产2-KLG (Vc前体），最终提 高了 2-KLG的产量，2-KLG的产量可达40. 3g/l，较未表达化tA的一步工程菌提高了 24. 4%; 并且外源蛋白耐热性使工程菌的耐热性有所提高。本发明通过表达外源蛋白化tA实现细 胞内酶的交联，有利于多种酶连续催化反应，对维生素C 一步发酵生产具有重要意义。本发 明提供的构建方法简单，适于标准化。
【附图说明】
[0025] 图1基于化tA表达的蛋白结构示意图。
[0026] 图2 -步菌株发酵曲线图，▲和A分别表示G. oxydans/
[0027] pGUC-化fB-S册-S化-GGGGS-sn化-化fB-S册lig- (GGGG巧 2-州tA 和 G. oxydans/
[002引 pGUC-化fB-s化-GGGGS-sn化生产2-KLG的产量；?和0分别表示G. oxydans/
[0029] pGUC-化fB-S册-S化-GGGGS-sn化-化