增殖质粒DNA 之后，切取病毒片段（包括T7启动子）并进行凝胶纯化。这些充当用于T7指导的体外转 录（MEGAscript?，Ambion，Austin TX)的模板。将反应产物进行DNA酶消化，之后进行苯 酚提取和乙醇沉淀。将最终制品溶解在无核酸酶的水中。
[0118] 在>7、垄缓裏沪琢廢在每个蜂房上放置5 g花粉补充饼，且每夜用无菌的培 养皿将10 ml 50%蔗糖溶液加入蜂巢中。持续饲喂9天，之后仅将其中蜂王已开始产卵的 蜂巢包含在试验中。
[0119] 建立有效蜂巢（蜂王产卵）之后，给一些小型蜂巢补充瓦螨特异性（凋亡抑制剂 (IAP)基因 （SEQ ID NO: 27)或非特异性对照（例如GFP SEQ ID NO: 91) dsRNA，将其加 入供应给蜂巢的10 ml 50%蔗糖溶液中，调节至每只蜂每份饲料约1微克dsRNA，假设所有 蜂消耗近似相同量的蔗糖溶液。持续dsRNA饲喂六天。
[0120] A垄/遵巢中游瓦麟憂费.·在有效蜂巢中饲喂7天后，使一些蜂群与瓦螨群体接触。 其后，再持续dsRNA处理2天。在引入瓦螨群体之后，每天从每个小型蜂巢中收集活蜂和死 蜂（幼虫和成蜂）的样品，连续32天。将每只收集的蜂冷冻在液氮中并且在分子分析前保 藏在-70°C。通过打开蜂巢（无烟）、拆下小型蜂房并从两边给小型蜂房拍照来监测蜂群的 生活力。每天给蜂巢-蜂房拍照，并监测留下的活蜂的数量。把照片下载到电脑并对每个 小型蜂巢计算蜂的总数。
[0121] 为了测试dsRNA毒性，给另一组蜂巢提供瓦螨特异性dsRNA，但不使其与瓦螨群体 接触。两组蜂巢充当额外的对照：未经dsRNA处理并且未接种瓦螨的蜂巢，以及未经dsRNA 处理但已接种瓦螨的蜂巢。
[0122] RT-PCR分析: 孩廢你蔡砍..使用TRIREAGENT方法（Sigma，St. Louis M0，USA)从保藏的蜂中提取总 RNA。简言之，将RNA通过经由离心沉淀和分离来提取，之后重悬在RNA安全溶液（RNAsecure solution)中。
[0123] 其?使用 SYBR Green PCR master mix 连同 Taqman 反转录酶（Applied Biosystems，Foster City，CA)将测定量的RNA (100 ng用于病毒表达分析，100 pg用于 18S rRNA 内参）进行一步 RT-PCR。实时 RT-PCR 在 GeneAmp PCR System 5700 (Applied Biosystems)中进行。无反转录酶或无模板下进行的反应不应产生任何产物。
[0124] 7?姻/?逐分#.·从处理蜂和对照蜂提取总RNA。向RNA中加入甲醛至1. 8%并加热 至65°C。在70V 4°C搅拌下，使RNA(每泳道15 #g)在1. 2%琼脂糖凝胶上电泳。将先前 所述经扩增的瓦螨RNA产物用洋地黄毒苷标记并充当杂交探针。用DIG发光检测试剂盒 (Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)进行检测。通过与电泳RNA分子量标志物 I (Roche)比较来估计RNA大小。在高严格性（0.1 X SSC ;65°C)下进行杂交。
[0125] 蜜聲中摄乂游瓦遵淨?ΤΡ姻游政运.·为了更好地理解dsRNA-瓦螨保护蜂免受 瓦螨侵染的作用机制及其结果，从dsRNA-瓦螨处理的蜂和未处理的对照蜂提取总RNA，使 之经历一组核酸酶的消化，并在PAGE上分离。
[0126] 结果 通过使用用于GFP的探针的狭线印迹杂交确定了 dsRNA在成年蜂体、蜂幼虫（通过成 年蜂喂养）、蜂蛹中的存在情况。通过检测小RNA的RNA印迹确定了从dsRNA到siRNA的加 工（图 2A-E)。
[0127] 在用dsRNA-GFP饲喂7天的成年蜂和对照（未饲喂）蜂上放置瓦螨个体。在指定 时间（图1)从瓦螨提取RNA并使之经历使用GFP引物的RT-PCR。结果示于图3中。
[0128] 给蜂饲喂凋亡抑制剂（IAP)基因 （SEQ ID NO: 27)的dsRNA区段。通过RT-PCR 对从该蜂巢收集的瓦螨分析IAP基因的表达（图4)。
[0129] 实施例2 材料和方法 用对应于瓦螨基因区段的dsRNA的两种不同的混合物饲喂蜂巢。所有dsRNA对应于不 与蜂或人序列同源（不携带长于19个碱基的同源序列段）的基因区段。混合物I (最小 处理）包含SEQ ID NO: 1、13、27、30和39。混合物II (最大处理）包含SEQ ID NO: 1、 4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39。在每个蜂巢中放置三十只瓦螨个体并在两个 月后对每个蜂巢中的瓦螨和蜂计数。每组处理重复3次。
[0130] 结果 在各个蜂巢中未观察到对蜂巢蜂数的可见损害。图5显示了在用瓦螨基因序列的 dsRNA处理之后瓦螨群体的减少。
[0131] 实施例3 用于预防瓦螨相关的蜜蜂疾病的瓦螨特异性dsRNA的大规模现场试验 为了确定在实际现场条件下摄入的瓦螨dsRNA对瓦螨侵染的有效性，以及评价对蜂群 健康的重要参数的影响，在用瓦螨侵染前5天和在侵染后4天，在饲料中给全尺寸蜂巢样品 中的蜂提供瓦螨特异性dsRNA。
[0132] 材料和方法 昆虫材料: 来自以下处理的五个蜂群：远程对照、仅瓦螨dsRNA、仅瓦螨以及在每个时间点：第0天 (病毒施用日）、第7天和终点（第42天）的瓦螨特异性dsRNA +瓦螨。重复测试数次。
[0133] RNA 提取: 使用Tri-Reagent (Sigma，USA)根据制造商提供的方案提取RNA。在上样至凝胶之前， 用DNA酶I处理所有样品并用上样缓冲液（90%甲酰胺、0. 05溴酚蓝、0. 05%二甲苯蓝）重 悬。
[0134] 凝胶电泳和印迹: 使用nanodrop分光光度计测定10 ug新鲜制备的RNA并在变性环境（凝胶含有7M尿 素）中上样至12%丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：双丙烯酰胺比率为1:19)。电泳之后使用电 印迹法将样品转移至带正电荷的尼龙膜（Roch，USA)。
[0135] 杂交和信号检测: 将膜与新鲜制备的瓦螨区段的DNA探针杂交，所述区段取自不对应于瓦螨特异性 dsRNA本身的dsRNA的区。这使用DIG PCR探针制备试剂盒（Roch，USA)根据制造商方案于 42°C在DIG easyhyb溶液（Roch，USA)中进行。用2 X SSC/0. 1 % SDS将膜洗涤两次，然 后针对严格性在65 °C用0.1 X SSC/0. 1 % SDS洗涤。使用DIG洗涤和封闭试剂盒（Roch， USA)根据制造商方案进一步洗涤膜。使用CSPD-star底物（Roch，USA)进行检测。阳性对 照为对应于已杂交序列的21 nt DNA引物。
[0136] 利用在Kodak制造的化学发光器（chemiluminator)中暴露膜2-12个小时来检测 信号。
[0137] 在不存在瓦螨侵染时，在饲喂瓦螨-dsRNA的蜂巢和对照蜂巢中评价蜂群体健康 的基本参数（封盖幼蜂的数量、蜂巢中蜂的数量、返回的采集蜂以及蜂蜜产量）。
[0138] 实施例4 蜂摄取的dsRNA从蜂转移给瓦蹒以及经由瓦蹒侵染回传给蜂的双向转移 在实施例1和2中，已显示dsRNA可从蜂转移给瓦螨：直接转移给侵染摄取所述dsRNA 的蜂的螨，或者间接转移给侵染由摄取所述dsRNA的蜂喂养的幼虫的螨。为了揭示螨是否 能进一步充当另外的载体，经由寄生将dsRNA或siRNA从螨回传给"幼稚"蜂，在侵染饲喂 dsRNA的蜂之后使瓦螨侵染"幼稚"蜂。
[0139] 材料和方法 办7?姻#备.·从克隆到质粒中相对的T7启动子之间的序列制备瓦螨特异性和GFP dsRNA，如在实施例1中所述。长度为200-450 bp的所选瓦螨基因的区段，在序列上不对应 于任何蜂或人基因（少于21个连续碱基的同一性），经选择用于瓦螨dsRNA产生。下表1 详述了用于制备dsRNA的引物的序列，以及扩增子的长度（不包括T7启动子序列）。
[0140] 表1-用于dsRNA制备的引物
【主权项】
1. 一种分离的核酸剂，所述核酸剂包含选自SEQIDNO. 93-105和106的核酸序列。
2. -种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码权利要求1的分离的核酸剂的核酸序 列。
3. -种蜂可摄取的组合物，所述组合物包含权利要求1的至少一种核酸剂。
4. 权利要求3的蜂可摄取的组合物，其包含至少五种核酸剂，所述核酸剂各自具有选 自SEQIDNo: 93-105和106的不同的核酸序列。
5. 权利要求3的蜂可摄取的组合物，其包含至少一种具有如在SEQIDNo: 93、96、 100、104和106中所述的核酸序列的核酸剂。
6. 权利要求3的蜂可摄取的组合物，其包含具有如在SEQIDNo: 93、96、100、104和 106中所述的核酸序列的核酸剂的每一种。
7. 权利要求3的蜂可摄取的组合物，其呈选自固体形式和液体形式的形式。
8. 权利要求3的蜂可摄取的组合物，其进一步包含蛋白质。
9. 权利要求8的蜂可摄取的组合物，其中所述蛋白质呈花粉和/或大豆饼的形式。
10. 权利要求7的蜂可摄取的组合物，其中所述液体形式选自蔗糖溶液和玉米糖浆溶 液。
11. 一种预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法，所述方法包括向所述蜂巢的蜂给予 有效量的至少一种具有选自SEQIDNO. 93-105和106的序列的核酸剂，从而预防或治疗 所述蜂巢的狄斯瓦螨侵染。
12. 权利要求11的方法，其中所述蜜蜂为蜂群的蜂，且其中所述给予降低所述蜂群对 蜂群崩溃失调病的易感性。
13. 权利要求11的方法，其中所述给予通过饲喂来实现。
14. 权利要求13的方法，其中所述核酸剂以蜂可摄取的组合物提供，所述蜂可摄取的 组合物选自液体的蜂可摄取的组合物和固体的蜂可摄取的组合物。
15. 权利要求14的方法，其中所述蜂可摄取的组合物包含至少一种具有在SEQIDNo: 93、96、100、104和106中所述的核酸序列的核酸剂。
16. 权利要求14的方法，其中所述蜂可摄取的组合物包含至少五种核酸剂，每一种核 酸剂具有选自SEQIDNo: 93-106的不同的核酸序列。
17. 权利要求11的方法，其中所述核酸剂作为核酸构建体给予。
18. -种降低蜜蜂对蜂群崩溃失调病（CCD)的易感性的方法，所述方法包括向蜜蜂给 予有效量的至少一种选自如在SEQIDNo: 93-95和106中所述的核酸序列的核酸剂，从而 降低蜜蜂对蜂群崩溃失调病（CCD)的易感性。
19. 权利要求18的方法，其中所述核酸剂如在SEQIDNo: 93、96、100、104和106中 所述。
【专利摘要】本文公开了一种分离的核酸剂，所述核酸剂包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列。所述核酸剂可具有如在SEQ ID NO. 93-106中所述的序列。亦公开了包含所述核酸剂的组合物及其用途。
【IPC分类】A61K31-713, C12N15-113
【公开号】CN104718294
【申请号】CN201380031114
【发明人】E.本-查诺奇, Y.加比安, H.卡莱, E.毛里, I.塞拉, S.沙菲尔, G.亚登
【申请人】耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司, 比奥罗吉克斯公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年4月11日
【公告号】CA2869831A1, EP2836596A2, US8962584, US20120258646, US20150133532, WO2013153553A2, WO2013153553A3