一种钩状结构寡肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于工业生物催化和酶工程领域，具体设及一种钩状结构寡肤及其在目标 酶的活性、稳定性改造中的应用。
【背景技术】
[0002] 盐桥，即两种带相反电荷的氨基酸之间的库仑相互作用。结构研究表明，嗜热 蛋白比嗜温同源蛋白含有更多的极性氨基酸残基和形成更多的盐桥，例如超嗜热古菌 P.化riosus的P化-GHD酶分子中，每10个残基就有1. 1个盐桥，而中温菌Clostridium symbisun的Csy-GHD酶分子中，每10个残基只有0. 6个盐桥。无论是古细菌还是细菌类 蛋白质，总盐桥含量和盐桥网络的比例都随着耐热性的增加而增加。另一方面，在整个蛋 白质构象中，肤链的自由末端的构象通常最不稳定。W两种嗜热膳水合酶为例，酶的热失 活导致的构象伸展解离首先发生在肤链末端残基，而且其不稳定程度远远高于其它区域的 氨基酸残基（LiuJ.等，JournalofMole州larGraphicsandModelling, 2008,27(4); 529 - 535)。对嗜温膳水合酶的蛋白质序列进行定点突变，在其亚基内部和亚基末端分别插 入来自嗜热膳水合酶的盐桥结构，结果发现，对膳水合酶盐桥末端进行改造的突变酶具有 显著提高的稳定性（QienJ.等，JournalofBiotechnology2012,164:354 - 362)。
[0003] 常规的基因工程和蛋白质工程研究中，对酶活性和稳定性进行改造的方法一般是 进行异源基因重组表达和基因定点/随机突变。该些方法都依赖于具体的基因和蛋白质序 列。例如，日本S菱丽阳株式会社公开了专利《改良型膳水合酶》（公开号；CN 1961072A)， 对膳水合酶0亚基第93位、第167位和219位氨基酸残基进行定点突变，提高了膳水合 酶的热稳定性。清华大学构建了a亚基起始密码子突变的膳水合酶，并在大肠杆菌中实 现了高活性表达（专利号；ZL200410042576.0，"一种膳水合酶及其编码基因与应用"）；清 华大学还在中国发明专利"一种膳水合酶基因簇及其应用"中公开了赤（红色）红球菌 化odococcus ruber TH中与膳水合酶高表达相关的结构基因和调控基因序列（专利号；ZL 200910076710. 1);在中国发明专利"一种突变膳水合酶"中，公开了一种定点突变酶的亚 基末端改造膳水合酶耐热性、产物耐受性和超声稳定性的方法（专利号；ZL201110415465. 幻。日本=菱化成株式会社对来自根瘤菌属的膳水合酶基因和蛋白申请了专利《具有膳水 合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》（申请号；93106122.9) 井化学株式会社对 来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的膳水合酶的蛋白化及编码它的基因申请了专利《参与活化 膳水合酶的蛋白化及编码它的基因》（专利号；CN1250568C);《新型膳水合酶》研究了该基 因在重组大肠杆菌中的表达（专利号；CN1243825C);德国底古萨股份公司申请了《红球菌 属的膳水合酶》（专利号；CN1930299B)。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种钩状结构寡肤（或者称之为寡肤标签）。
[0005] 所述的钩状结构寡肤，由3-12个氨基酸残基组成，其中至少含有一个正电氨基酸 残基和一个负电氨基酸残基，且所述正电氨基酸和负电氨基酸之间至少间隔1个氨基酸残 基并且正电氨基酸和负电氨基酸之间形成正负电离子对。
[0006] 优选的，上述的钩状结构寡肤，由5-12个氨基酸残基组成，其中至少含有一个正 电氨基酸残基和一个负电氨基酸残基，且所述正电氨基酸和负电氨基酸之间至少间隔1个 氨基酸残基并且正电氨基酸和负电氨基酸之间形成正负电离子对。
[0007] 优选的，上述的钩状结构寡肤，其具有5个氨基酸残基GXPYG，其中G为甘氨酸，P 为脯氨酸，X和Y分别为带相反电荷的正电氨基酸和负电氨基酸。
[000引所述正电氨基酸为精氨酸Arg(R)或赖氨酸Lys(K);所述带负电氨基酸为天冬氨 酸Asp值）或谷氨酸Glu似。
[0009] 上述钩状结构寡肤，所述氨基酸残基GXPYG为GRPEG、GRPDG、GKPEG或GKPDG。
[0010] 具有上述GX…P'''YG的氨基酸序列，其氨基酸残基为5-12个，例如氨基酸残基为 6个或7个或9个或11个，经氨基酸增减，也能够形成"钩子"结构的寡肤结构序列。
[0011] 通过设计、构建具有独特的自回转"钩子"结构的寡肤结构序列，可W不依赖于目 标酶的基因序列和蛋白质序列，将钩状寡肤模块像标签一样"贴"在不同蛋白酶的N-末端、 C-末端或N/C-末端，通过刚性盐桥结构的馴定来减少肤链末端的结构自由度及其在受热 /有机溶剂等恶劣环境下的伸展失活，从而快速、高效、普适性地提升各种酶的稳定性或活 性。
[0012] 本发明的目的之一还在于提供一种提高酶抗逆性的方法和一种提高酶活性的方 法。
[0013] 所述的提高酶抗逆性的方法，将上述任一所述的钩状寡肤序列插入目标酶的亚基 末端。
[0014] 所述的提高酶活性的方法，将上述任一所述的钩状寡肤序列插入目标酶的亚基末 玉山 乂而。
[0015] 所述目标酶为膳水合酶或其突变体或膳水解酶或其突变体。
[0016] 可通过在聚合酶链式反应（PCR)引物中引入钩状结构寡肤序列，经过一步PCR扩 增即可在目标酶的N-末端或C-末端插入钩状寡肤标签基因，获得稳定的酶。
[0017] 本发明的目的之一还在于提供一种酶。
[001引一种酶，将上述任一所述的钩状寡肤序列插入目标酶的亚基末端形成，所述目标 酶为膳水合酶或其突变体或膳水解酶或其突变体。
[0019] 特别的，本发明的目的之一还在于提供一种膳水合酶。
[0020] 一种膳水合酶，将上述一所述的钩状寡肤序列插入目标酶的亚基末端形成，所述 目标酶为膳水合酶或其突变体；所述亚基末端为W下一种W上；a亚基的N末端、a亚基 的C末端、0亚基的N末端或0亚基的C末端。钩状结构寡肤序列插入总数量为1-3个。
[0021] 本发明的目的也在于提供编码上述膳水合酶的基因、含有所述基因的表达载体、 含有所述基因的转化体。
[0022] 所述转化体为大肠杆菌或红球菌。
[0023] 上述转化体的构建方法，可采用氯化巧法或电穿孔转化法（SambrookJ 等.MolecularCloning:ALaboratorymanual.ColdSpringHarbor,NY:CoIdSpring HarborL油oratoryPress. 1989)将载体导入受体菌。也可W将改良膳水合酶基因直接插 入转化体的