利用农杆菌获得中国主栽转基因小麦的方法及其专用培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种利用农杆菌获得中国主栽转基因小麦的 方法及其专用培养基。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上重要的粮食作物之一，与社会经济发展、粮食安全供给和人类营养 健康密切相关。中国是世界最大的小麦生产国。2010年继玉米和水稻之后，小麦在中国的 产量达到了 224万吨。目前，通过常规育种手段提高小麦产量和品质的努力已是举步维艰， 尤其在挖掘亩产潜力、保证年产稳定性等方面。自1992年Vasil等将gus/bar基因导入 小麦获得首例转基因小麦以来，遗传改良育种在小麦上的研究有了长足的发展。2008年国 家将小麦的遗传改良加入重大转基因专项，正在积极稳妥地推动实施转基因小麦新品种的 培育工作。目前小麦遗传改良育种仍然主要采用基因枪法，但直接导入的方法存在成本高、 拷贝数多、目的基因和筛选标记基因紧密连锁致使后代难以分离以及基因沉默现象严重等 缺点。农杆菌转化法作为基因工程育种的另一个手段，已经在玉米、水稻和大麦等作物中取 得了巨大成功。相比之下，小麦属于异源倍体植物，基因组庞大，重复序列多，基因型效应严 重，农杆菌转化比较困难，这也是小麦基因工程育种速度缓慢的主要原因。
[0003]虽然近年来小麦农杆菌转化进程有了显著的发展，但还主要集中在一些欧美春小 麦品种上，如"Bobwhite"、"Fielder"、"Cadenza"和"Veery5"等，很难在中国主栽小麦品 种上得到应用。并且国内目前还没有文献报导全面系统地将全国各地方主栽品种收集起来 进行组织培养和遗传转化测试，更多的只是局限在某些当地品种上，且转化流程单一、操作 不规范、转化效率低等这便大大限制了小麦转化产业化的发展。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于制备转基因植物的试剂盒。
[0005] 本发明提供的用于制备转基因植物的试剂盒，包括侵染液、共培养培养基、愈伤诱 导培养基、分化培养基和生根培养基；
[0006] 所述侵染液由1/10MS基本培养基、乙磺酸、2,4-二氯苯氧乙酸、麦芽糖和水组成， 所述乙磺酸在所述侵染液中的终浓度为〇.lg/L，所述2,4-二氯苯氧乙酸在所述侵染液中 的终浓度为5.Omg/L、所述麦芽糖在所述侵染液中的终浓度为30g/L;
[0007]所述共培养培养基由1/10MS基本培养基、乙磺酸、脯氨酸、2,4-二氯苯氧乙酸、麦 芽糖、抗坏血酸、乙酰丁香酮、凝固剂和水组成；其中，所述乙磺酸在所述共培养培养基中的 终浓度为〇. lg/L，所述脯氨酸在所述共培养培养基中的终浓度为0. 69g/L，所述2,4-二氯 苯氧乙酸在所述共培养培养基中的终浓度为5. Omg/L，所述麦芽糖在所述共培养培养基中 的终浓度为30g/L，所述凝固剂在所述共培养培养基中的终浓度为10g/L，所述抗坏血酸在 所述共培养培养基中的终浓度为l〇〇mg/L，所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基中的终浓 度为 200liM。
[0008] 所述愈伤诱导培养基由MS基本培养基、硝酸铵、五水硫酸铜、乙磺酸、2,4-二氯苯 氧乙酸、水解酪蛋白、脯氨酸、麦芽糖、凝固剂、抗坏血酸、特美汀和水组成，其中，所述硝酸 铵在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为2. 4g/L，所述五水硫酸铜在所述愈伤诱导培养基中 的终浓度为1. 25mg/L，所述乙磺酸在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为1. 95g/L，所述2， 4-二氯苯氧乙酸在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为2.Omg/L，所述水解酪蛋白在所述愈 伤诱导培养基中的终浓度为1. 〇g/L，所述脯氨酸终浓度在所述愈伤诱导培养基中的终浓度 为0. 69g/L，所述麦芽糖在所述愈伤诱导培养基中的终浓度40g/L，所述凝固剂在所述愈伤 诱导培养基中的终浓度8g/L，所述抗坏血酸在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为100mg/ L，所述特美汀在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为200mg/L;
[0009] 所述分化培养基由MS基本培养基、五水硫酸铜、乙磺酸、谷氨酰胺、蔗糖、凝固剂、 噻苯隆、草铵膦、特美汀和水组成，其中，所述五水硫酸铜在所述分化培养基中的终浓度为 1. 25mg/L，所述乙磺酸在所述分化培养基中的终浓度为1. 95g/L，所述谷氨酰胺在所述分化 培养基中的终浓度为〇. 75g/L，所述蔗糖在所述分化培养基中的终浓度为30g/L的，所述凝 固剂在所述分化培养基中的终浓度为终浓度为3g/L，所述噻苯隆在所述分化培养基中的终 浓度为〇. 5mg/L，所述草铵膦在所述分化培养基中的终浓度为5mg/L，所述特美汀在所述分 化培养基中的终浓度为终浓度为200mg/L;
[0010] 所述生根培养基由1/2的MS基本培养基、乙磺酸、a-萘乙酸、蔗糖、凝固剂、草 铵膦和特美汀组成，其中，所述乙磺酸在所述生根培养基中的终浓度为〇. 5g/L，所述a-萘 乙酸在所述生根培养基中的终浓度为〇. 5mg/L，所述蔗糖在所述生根培养基中的终浓度为 30g/L，所述凝固剂在所述生根培养基中的终浓度为3g/L，所述草铵膦在所述生根培养基中 的终浓度为5mg/L，所述特美汀在所述生根培养基中的终浓度为200mg/L。
[0011] 上述试剂盒中，所述凝固剂为琼脂、琼脂糖或植物凝胶。
[0012] 上述试剂盒中，所述共培养培养基中的凝固剂均为琼脂糖，所述愈伤诱导培养基 中的凝固剂为琼脂；所述分化培养基和所述生根培养基中的凝固剂均为植物凝胶。
[0013] 上述试剂盒中，所述试剂盒中所述侵染液和各培养基的pH值均为5. 8。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种制备转基因植物的方法。
[0015] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0016] 1)制备预处理后外植体和侵染用菌液：
[0017] 所述制备预处理后外植体的方法包括如下步骤：将植物的外植体置于上述的试剂 盒中的所述侵染液中，离心，弃去上清液，得到预处理后外植体；
[0018] 所述制备侵染用菌液的方法包括如下步骤：先将含有外源基因的重组农杆菌悬浮 在所述侵染液中得到重悬菌液，再将所述重悬菌液中添加终浓度为200i!M的乙酰丁香酮 和终浓度为〇. 1% (质量百分含量，即为质量与体积的百分比）的泊洛沙姆（PluronicF68， 普流尼克F68)，得到侵染用菌液；
[0019] 2)将所述预处理后外植体和所述侵染用菌液混匀、静置，得到侵染后外植体；
[0020] 3)将所述侵染后外植体在所述共培养培养基中进行共培养，得到共培养胚；
[0021] 4)将所述共培养胚在所述愈伤诱导培养基中进行诱导培养，得到诱导后愈伤组 织；
[0022] 5)将所述诱导后愈伤组织在所述分化培养基进行分化培养，得到长出绿苗的愈伤 组织；
[0023] 6)将所述长出绿苗的愈伤组织在所述生根培养基上进行生根培养，即得到转基因 植物。
[0024] 上述方法中，所述外植体按照如下方法制备：将所述植物的种子的胚切除胚芽，保 留胚其余部分，得到外植体。
[0025] 上述方法中，步骤1)中，所述离心为18000-22000G离心25-35min;所述离心具体 为 20, 000G离心 30min;
[0026] 所述重悬菌液中菌的浓度为0D600=1. 0±0. 5;
[0027] 步骤2)中，所述静置为23-28°C静置0. 8-1. 5h，所述静置具体为25°C静置lh;
[0028] 步骤3)中，所述共培养的条件为22_25°C暗培养2. 5-3. 5天，所述共培养的条件具 体为23 °C暗培养3天；
[0029] 步骤4)中，所述诱导培养的条件为22_25°C暗培养2. 5-3. 5周，所述诱导培养的条 件为24°C暗培养3周；
[0030] 步骤5)中，所述分化培养的条件为22-25°C、光照强度145-155iimol/m2/S、光周期 16/8h培养3. 5-4. 5周，所述分化培养的条件具体为24°C、光照强度150ym〇l/m2/S、光周期 16/8h培养4周；
[0031] 步骤6)中，所述生根培养的条件为22-25°C、光照强度145-155iimol/m2/s、光周期 16/8h培养3. 5-4. 5周，所述生根培养的条件具体为24°C、光照强度150ym〇l/m2/S、光周期 16/8h培养4周。
[0032] 上述方法中，步骤3)中，所述侵染后外植体和所述共培养培养基间设有滤纸间 隔；
[0033] 步骤4)中，所述共培养胚以盾片朝上的方式放置在所述愈伤诱导培养基上进行诱 导培养；
[0034] 步骤5)中，所述分化培养按照每两周继代一次进行，所述继代采用的培养基和培 养条件与所述分化培养相同。
[0035] 上述方法中，所述重组农杆菌为将质粒共转入根瘤农杆菌AGL1中得到的重组农 杆菌。其中质粒为PAL154/156,其中质粒pAL154为转染辅助质粒，质粒pAL156的物理图谱 如图1所示。
[0036] 上述方法中，所述小麦种子为小麦扬花14天的种子；
[0037] 所述小麦具体为中国主栽品种，所述中国主栽品种尤其具体为豫麦949、陇春23、 鲁麦5号、淮麦19或科农199。
[0038] 上述MS基本培养基为现有常规的培养基，其组分为NH4N03、KN03、KH2P04、 MgS04 ? 7H20、CaCl2、FeS04 ? 7H20、Na2EDTA、MnS04 ? 4H20、ZnS04 ? 4H20、H3B03、KI、Na2Mo04. 2H20、 CuS04. 5H20、C〇C12 ? 6H20、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸和肌醇，上述各组分的浓度 也为现有常规的浓度。
[0039]上述1/10MS基本培养基为MS基本培养基中各组分均为1/10。
[0040] 本发明的实验证明，本发明针对中国主栽的小麦品种，优化了植物组培的培养基， 本发明利用侵染液和一组培养基，且选择未成熟的胚部分作为外植体，利用这些进行了转 基因小麦的制备，与小麦品种Bobwhite相比，提商了中国主栽的小麦品种的基因转化效率 和频率，转化流程丰富、操作规范，大大提高了小麦转化产业化的发展，尤其是促进了我国 主栽品种小麦的转化产业的发展。
【附图说明】
[0041] 图1为pAL156的物理图谱
[0042] 图2为转化小麦幼胚过程中的材料生长情况
[0043] 图3为小麦转基因植株的Southern杂交检测结果
【具体实施方式】
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均