用于使用散在遗传元件进行遗传检测的方法:多路复合的dna分析系统的制作方法
【专利说明】用于使用散在遗传元件进行遗传检测的方法：多路复合的 DNA分析系统
[0001] 对优先权的要求
[0002] 本申请根据35 U.S.C. § 119,引用、并入且要求较早前于2012年10月15日提 交到美国专利和商标局并在当时分配了序列号61/714, 088的申请METHOD FOR GENETIC DETECTION USING INTERSPERSED GENETIC ELEMENTS:A MULTIPLEXED DNA ANALYSIS SYSTEM(用于使用散在遗传元件进行遗传检测的方法：多路复合的DNA分析系统）的所有 权益。
技术领域
[0003] 本发明总体涉及人鉴定和生物祖系测试，并且更具体地，涉及在分析用于人身份 测试或用于生物祖系研宄的人DNA样品期间提高检测灵敏度的改进。
[0004] 发明背景
[0005] 短串联重复（STR)位点是用于人身份测试的主要遗传标志物。这些标志 物是高多态性的，并且提供了高检测灵敏度，使得可分析相对较低的模板DNA量 (Ing 至 250pg) (Andersen, J. F.等，Further validation of a multiplex STR system for use in routine forensic identity testing, Forensic Science International，78(I):47-64(1996) ；Brinkmann, B.等，Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat, The American Journal of Human Genetics，62 (6) :1408-1415 (1998) ;Collins，P.J.等， Developmental validation of a single-tube Amplification of the 13C0DIS STR Loci，D2S1338，D19S433, and amelogenin:The Identifller? ?CR Amplification Kit, Journal of Forensic Sciences，49 (6) :1265-1277 (2004)； LaFountain，M.J.等，TWGDAM Validation of the AmpFeSTR Profiler Plus and AmpFeSTR COfiler STR Multiplex Systems Using Capillary Electrophoresis, Journal of Forensic Sciences, 46 (5) : 1191-1198 (2001) ；Micka, K. A.等，Validation of multiplex polymorphic STR amplification sets developed for personal identification applications, Journal of Forensic Sciences，41:582-590 (1996) ；Moretti,T.等， Validation of short tandem repeats (STRs) for forensic usage:performance testing of fluorescent multiplex STR systems and analysis of authentic and simulated forensic samples, Journal of Forensic Sciences，46 (3):647 (2001))〇
[0006] 包括长散在核元件（LINE)、短散在核元件（SINE)和SVA元件的可反转录 转座元件（RE)是可用于人身份测试的另一组标志物。SINE是通常小于500核苷 酸长的一类RE ;而LINE是通常大于500核苷酸长的LINE (A. F. A. Smit，The origin of interspersed repeats in the human genome, Current Opinion in Genetics Development, 6 (6) : 743-748 (1996) ；Batzer, M. A.等，Alu repeats and human genomic diversity，Nature Reviews Genetics，3 (5) :370-379 (2002) ;Batzer，M. A.等， African origin of human-specific polymorphic Alu insertions, Proceedings of the National Academy of Sciences, 91 (25) :12288 (1994) ;Feng，Q.等， Human Llretrotransposon encodes a conserved endonuclease required for re trotransposition，Cell, 87 (5) :905-916 (1996) ;Houck，C.M.等，A ubiquitous family of repeated DNA sequences in the human genome,Journal of Molecular Biology, 132 (3) :289-306 (1979) ;Kazazian，H.H.等，The impact of Llretrotransposons on the human genome, Nature Genetics, 19(1):19-24(1998)； Ostertag,E. M.等，Biology of mammalian Llretrotransposons, Annual Review of Genetics, 35 (I) : 501-538 (2001))。LINE全长元件长度为~6kb，包含聚合酶II的内部启 动子以及两个开放阅读框（ORF)，并且以多聚A尾终止。SINE包括Alu元件一一灵长类的 特异性SINE，其在人基因组中已经达到了超过一百万的拷贝数。一开始，由其散在性质和 长度（75bp至500bp)来定义SINE，但是还通过RNA聚合酶III转录来表征SINE。第三种 RE是被称为SVA(SINE/VNTR/Alu)元件的复合反转录转座子（Wang，H.等，SVA Elements:A Hominid-specific Retroposon Family, J. Mol. Biol. 354:994 - 1007(2005))。SVA 是复合 元件，根据其主要组分SINE、可变数目的串联重复（VNTR)和Alu来命名。作为VNTR区的结 果，全长SVA元件的大小可广泛变化。这些标志物具有用于身份测试、亲缘关系分析和进化 研宄的潜在应用性（参见上文引用的文献Smit ;Batzer等（2002) ;Batzer等（1994) ;Feng 等；Houck等；Kazazian等；以及Ostertag等）。插入和无效等位基因（INNUL)标志物可包 括 SINE、LINE 和 SVA。
[0007] 图1中描述了 RE的结构。散在重复的Alu家族是灵长类基因组中最成功的移 动遗传元件，其已经扩增至每单倍基因组大于500, 000的拷贝数。Alu元件通过在定义为 反转录转座的过程中的RNA聚合酶III-衍生的中间体来移动。Alu重复长度约300bp， 并且原始衍生自7SL RNA基因。各Alu元件在结构上是二聚化的，并且侧翼有短的完全 正向重复。这些正向重复序列是在Alu元件插入至基因组中交错的切口内时形成的。此 外，各Alu元件在中间和3'端具有富寡聚dA区（图1)。Alu重复扩增至如此大的拷 贝数已经过了 6500万年，并且该过程在现今的基因组中仍然在进行（A.F.A.Smit，The origin of interspersed repeats in the human genome, Current Opinion in Genetics Development, 6 (6) : 743-748 (1996);上文引用的 Zangenberg 等；Budowle, B.，SNP typing strategies, Forensic Science International, 146:S139(2004))〇
[0008] 人基因组内的Alu序列可基于由亚家族成员共享的诊断性突变的存在而分成 相关成员的亚家族。这些亚家族有着不同的进化龄，年轻的亚家族（Ya5、Ya8和Yb8)主 要限于人基因组（Houck, C.M 等，A ubiquitous family of repeated DNA sequences in the human genome, Journal of Molecular Biology,132 (3):289-306 (1979)； Kazazian, Η. H.等，The impact of LI retrotransposons on the human genome, Nature Genetics, 19 (I) : 19-24 (1998))。这些亚家族随着进化时间以分级的方式出现，较年轻的亚 家族保留了其之前较老的亚家族的诊断性突变。
[0009] Ya5/8亚家族和Yb8亚家族是Alu重复的Y亚家族的独立衍生物。与主要属 于PS亚家族和AS亚家族的Alu重复的主体相比，年轻的亚家族以相对较小的拷贝数存 在于基因组内。例如，Y亚家族由约100, 〇〇〇个成员组成；Ya5亚家族由1000个成员组 成；Ya8亚家族由50个成员组成，以及Yb8亚家族由约1000个成员组成（Moretti，T.等， Validation of short tandem repeats (STRs) for forensic usage:performance testing of fluorescent multiplex STR systems and analysis of authentic and simulated forensic samples, Journal of Forensic Sciences，46 (3):647 (2001))〇
[0010] 最年轻的Alu元件亚家族Ya5、Ya8和Yb8在500万年前首次出现于灵长类 基因组中(Batzer, Μ. A.等，African origin of human-specific polymorphic Alu insertions, Proceedings of the National Academy of Sciences, 91 (25):12288(1994)； Feng, Q.等，Human Llretrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition，Cell，87(5) :905-916(1996))。人体内 Alu 元件的扩增仍 然是持续进行的过程。随着人类群体组的迀移并定居至全球的不同部分，在原始群体 中不存在属于较新群体的个体中的所有新Alu插入物，并且反之亦然。换言之，对于 其在不同人类群体组中的存在/不存在