一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方 法。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体新陈代谢的重要器官，也是最重要的解毒器官。肝脏中执行肝脏功能 的最主要细胞类型是肝脏实质细胞。肝脏实质细胞的主要关键功能包括：药物代谢、清洁和 解毒血液中的毒素和废物、合成和存储机体所需的糖类、蛋白、脂肪和其他物质等。由于肝 脏实质细胞执行了大多数肝脏的关键功能，因此获得具有功能的人肝脏实质细胞具有非常 重要的应用价值，尤其是在药物研发和再生医学领域。
[0003] 肝脏实质细胞可以在药物研发中发挥关键的作用。目前导致候选药物失败的主要 原因是其ADME(吸收、分布、代谢、排泄）方面不理想。由于肝脏在药物的代谢活动中发挥 核心作用，因此在所有新药研发过程中，一个必须的研究环节是检测药物在肝细胞的代谢 情况和毒理效应，人肝脏实质细胞具有完整的参与药物代谢的三相代谢酶，以及完备的调 控药物代谢的辅因子，因此使用人肝脏实质细胞在体外进行药物代谢的研究结果可以很好 地反应药物在体内的代谢情况。目前在体外药物研发上主要使用的是人成体原代肝细胞， 由于来源及其有限，并且原代肝细胞的功能很难在体外维持，因此其在药物研发上的应用 相当受限。
[0004] 在治疗肝功能衰竭和丧失的疾病上，肝脏实质细胞也有重要的应用前景，特别是 在生物人工肝支持系统方面。肝功能的衰竭和丧失是最为严重的肝脏疾病之一，以急性肝 功能衰竭为例，其起病急、病程发展快，原位肝移植是目前治疗此类疾病的主要手段，但是 由于供体的严重缺乏，许多病人在等待肝移植的过程中死亡。基于肝脏实质细胞构建的生 物人工肝支持系统可暂时替代衰竭肝脏的主要功能，清除有害物质，补充肝脏合成的生物 活性物质，稳定和改善病人的内环境，直到有合适的供体来源用于移植。此外，由于肝脏具 有强大的再生能力，在生物人工肝支持系统的帮助下有可能使肝细胞再生，直至自身的肝 脏功能恢复。目前研发中的生物人工肝支持系统多采用猪肝脏实质细胞以及人肝脏实质细 胞系，这些细胞来源存在一些关键问题制约了其应用，如物种差异可能导致的免疫排斥反 应、肝脏实质细胞体外功能水平低下、肝脏实质细胞缺乏增殖能力等。
[0005] 此外，人肝脏实质细胞还可用于构建人源化肝脏小鼠模型，该模型可以解决乙型 肝炎病毒（HBV)，丙型肝炎病毒（HCV)和疟疾（Malaria)等人类传染病缺乏动物感染模型的 难题，为这些疾病的病理研究、疫苗和新药研发以及人肝细胞代谢功能的体内研究提供可 靠的研究平台。
[0006] 人肝脏实质细胞虽然具有广阔的应用前景，但是如何在体外获得大量的功能性人 肝脏实质细胞是制约其应用的瓶颈因素。如前所述，现有的人肝脏实质细胞来源，如人成体 原代肝脏实质细胞、人肝脏实质细胞系等，来源困难，数量及其有限，因此很难同时解决维 持肝脏实质细胞的功能水平和获得较强的体外扩增能力两大问题。通过干细胞分化等方法 获得的肝脏细胞，其代谢功能不完善。因此，需要开发新的策略和方法来解决这一难题。
[0007] 细胞重编程技术能够通过特定方法在体细胞内过表达转录因子蛋白来调控细胞 命运，使其转变为特定类型的功能细胞。目前已经有报道在鼠成纤维细胞中过表达肝脏特 定的转录因子能够使成纤维细胞转分化为鼠肝细胞。但是，这些重编程来源的鼠肝细胞功 能并不成熟，例如表达AFP，并且其药物代谢最关键的P450酶活性较低。
【发明内容】
[0008]本发明的一个目的是提供诱导因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PR0X1、CEBPA、MYC 和p53基因抑制剂的至少一种的应用。
[0009]本发明提供的诱导因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PR0X1、CEBPA、MYC和p53 基因 抑制剂的至少一种在用于诱导产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实 质细胞中的应用。
[0010] 上述应用中，所述诱导因子为DNA形式，mRNA形式或蛋白质形式；
[0011] 所述哺乳动物具体为人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；所述哺乳动物尤其 具体为人。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种用重编程体外制备人工体外来源的，具有肝脏代 谢功能的哺乳动物肝实质细胞的方法。
[0013] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0014] (1)使离体哺乳动物体细胞中过表达或表达诱导因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、 PR0X1、CEBPA、MYC中的至少一种，且抑制所述离体哺乳动物体细胞中p53基因、p53mRNA或 P53蛋白的表达，得到转基因细胞，
[0015] (2)在肝细胞培养基中继续培养所述转基因细胞，即得到人工体外来源的，具有肝 脏代谢功能的肝脏实质细胞。
[0016] 上述方法中，
[0017]所述步骤（1)的方法如下：将诱导因子导入离体哺乳动物体细胞中，培养，得到转 基因细胞，
[0018] 所述诱导因子为HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PR0X1基因、CEPBA 基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子中的至少一种。
[0019] 上述方法中，所述诱导因子为如下1)或2):
[0020] 1)所述诱导因子为HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PR0X1基因、 CEPBA基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子；
[0021] 2)所述诱导因子为HNF1A基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PR0X1基因、 CEPBA基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子中任意三个。
[0022] 上述方法中，所述体细胞为成纤维细胞、肝癌细胞、胃细胞、角质细胞或血液细 胞；
[0023] 所述哺乳动物具体为人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；所述哺乳动物尤其 具体为人。
[0024] 上述方法中，各种所述诱导因子均通过表达其的慢病毒共同导入所述哺乳动物体 细胞中；
[0025] 各种所述诱导因子及其对应的慢病毒如下：
[0026] 所述HNF1A基因，其对应的慢病毒为表达HNF1A的慢病毒；
[0027] 所述HNF6基因，其对应的慢病毒为表达HNF6的慢病毒；
[0028] 所述HNF4A基因，其对应的慢病毒为表达HNF4A的慢病毒；
[0029] 所述ATF5基因，其对应的慢病毒为表达ATF5的慢病毒；
[0030] 所述PR0X1基因，其对应的慢病毒为表达PR0X1的慢病毒；
[0031] 所述CEBPA基因，其对应的慢病毒为表达CEBPA的慢病毒；
[0032] 所述MYC基因，其对应的慢病毒为表达MYC的慢病毒；
[0033] 所述抑制p53基因表达的DNA分子，其对应的慢病毒为抑制p53基因表达的慢病 毒。
[0034] 上述方法中，所述HNF1A基因的核苷酸序列为序列表中的序列1;
[0035] 所述HNF6基因的核苷酸序列为序列表中的序列2;
[0036] 所述HNF4A基因的核苷酸序列为序列表中的序列3;
[0037]所述ATF5基因的核苷酸序列为序列表中的序列4;
[0038] 所述PR0X1基因的核苷酸序列为序列表中的序列5 ;
[0039] 所述CEBPA基因的核苷酸序列为序列表中的序列6;
[0040]所述MYC基因的核苷酸序列为序列表中的序列7 ;
[0041] 所述抑制p53基因表达的DNA分子由序列表中序列8所不的单链DNA分子和序列 表中序列9所示的单链DNA分子退火得到；
[0042]步骤1)中，所述培养采用的培养基为哺乳动物体细胞培养基；
[0043] 所述培养的时间为以慢病毒感染哺乳动物体细胞起5-14天；
[0044] 步骤2)中，所述继续培养的时间为以慢病毒感染哺乳动物体细胞起15-35天。
[0045] 所述表达各种诱导因子的慢病毒等量共同导入所述哺乳动物体细胞中；
[0046] 所述表达HNF1A基因的慢病毒为由表达HNF1A基因的重组载体导入靶细胞中，包 装得到；
[0047] 所述表达HNF6基因的慢病毒为由表达HNF6基因的重组载体导入靶细胞中，包装 得到；
[0048] 所述表达HNF4A的慢病毒为由表达HNF4A基因的重组载体导入靶细胞中，包装得 到；
[0049] 所述表达ATF5的慢病毒为由表达ATF5基因的重组载体导入靶细胞中，包装得 到；
[0050] 所述表达PR0X1的慢病毒为由表达PR0X1基因的重组载体导入靶细胞中，包装得 到；
[0051] 所述表达CEBPA的慢病毒为由表达CEBPA基因的重组载体导入靶细胞中，包装得 到；
[0052] 所述表达MYC的慢病毒为由表达MYC基因的重组载体导入靶细胞中，包装得到；
[0053] 所述抑制p53基因表达的慢病毒为由抑制p53基因表达的重组载体导入靶细胞 中，包装得到。
[0054] 所述表达HNF1A基因的重组载体A为将HNF1A基因插入p⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro 表达载体得到的重组载体；
[0055] 所述表达HNF6基基因的重组载体B为将HNF6基因插入pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro 表达载体得到的重组载体；
[0056] 所述表达HNF4A基因的重组载体C为将HNF4A基因插入p⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro 表达载体得到的重组载体；
[0057] 所述表达ATF5基因的重组载体D为将ATF5基因插入p⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro表 达载体得到的重组载体；
[0058] 所述表达PR0X1基因的重组载体E为将PR0X1基因插入pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro 表达载体得到的重组载体；
[0059] 所述表达CEBPA基因的重组载体F为将CEPBA基因插入pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro 表达载体得到的重组载体；
[0060] 所述表达MYC基因的重组载体G为将MYC基因插入pll3. 7表达载体得到的重组 载体；
[0061] 所述抑制p53基因表达的重组载体H为将抑制p53基因的DNA分子插入pll3. 7 表达载体得到的重组载体。
[0062] 由上述方法得到的哺乳动物肝实质细胞也是本发明保护的范围；
[0063] 或通过转基因或添加诱导因子的方法诱导哺乳动物细胞肝脏特异基因的表达而 产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的肝实质细胞也是本发明保护的范围；
[0064] 所述哺乳动物具体为人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；所述哺乳动物尤其 具体为人。
[0065] 本发明的第三个目的是提供一种用于诱导产生具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝 脏实质细胞的试剂盒。
[0066] 本发明提供的试剂盒，为如下1) _3)中任一种：