[0197] 7)将终止后的样品颠倒混匀，储存在-80度冰箱或送至康龙化成通过传统的LC/ MS方法检测产物的浓度，结果表示为pmol/min/millioncells。
[0198]结果如图7所示，1为成纤维细胞,2为H印G2, 3为人肝脏实质细胞iHep, 4为人 原代肝实质细胞样品1，5为人原代肝实质细胞样品2;结果显示人肝脏实质细胞表达与 药物代谢相关的酶（CYP3A4 (Testosterone,Midazolam)，CYP1A2 (Phenacetin)，CYP2C9 (Diclofenac)，CYP2B6 (Bupropion)，CYP2C19 ( (S)-Mephenytoin))，具有与人原代肝实质 细胞接近的代谢能力，显著地区别于人成纤维细胞和肝癌细胞系H印G2。
[0199]F)肝毒性检测
[0200] mCadmium,Tamoxifen,Chlorpromazine,Rifampin,Omeprazole,Methapyriliene ，Aspirin及Acetaminophen配制成不同浓度梯度的培养液；将上述一制备的人肝脏实质细 胞iHep、人原代肝实质细胞培养在上述溶液中24h，细胞存活率通过MTT方法检测。
[0201] 结果如图8所示，结果显示体外获得的人肝脏实质细胞在多种具有代表性的肝毒 性药物处理下，呈现出与人原代肝实质细胞相似的半致死浓度；因此，可被用于体外筛选排 除那些有肝毒性的药物前体，为药物筛选提供细胞来源。
[0202] G)体内移植
[0203] BALB/c背景的Tet-uPA/Rag2_/-/ Y c-/_小鼠购买自北京维通达生物科技有限公 司。
[0204] 将上述一制备的2X106人肝实质细胞（iH印）、人原代肝实质细胞（F-HEP)和人成 纤维细胞（ffiF)重悬于lOOulPBS中，从脾脏注射到小鼠体内。不同时间收集的血液样本用 人白蛋白免疫酶联定量试剂盒（BethylLaboratory)来检测白蛋白的分泌水平。
[0205] 受体鼠的肝脏切片用0CT化合物固定(樱花牌)后保存在液氮中。用于染色的冰冻 切片厚度均为l〇um。
[0206] 结果如图9所示，人肝脏实质细胞在移植后，可以分泌人血清白蛋白，且其分泌量 随着移植时间的延长，逐渐提高(左图)。在移植后第七周分析，发现移植人肝脏实质细胞的 小鼠血清中，人白蛋白的分泌量与移植人原代肝实质细胞的小鼠接近(右图）。
[0207] 移植诱导人肝脏实质细胞的小鼠肝脏中，将受体小鼠的肝脏取出来之后，通过灌 流分离出肝细胞，将肝细胞做流式细胞分析，结果显示诱导人肝脏实质细胞的嵌合比例可 以到30% (图10)。将移植体分离出来做冰冻切片并免疫组化染色发现，移植体表达药物代 谢相关的多种酶（图11)。
[0208] 实施例2、重编程获得功能性的人肝脏实质细胞
[0209] -、将肝癌细胞系恢复为功能成熟的肝细胞
[0210] 1、慢病毒混合物的制备：与实施例1的一的1 一致，得到慢病毒混合物。
[0211] 2、转分化：与实施例1的一的2基本一致，不同的是将人成纤维细胞替换为肝癌细 胞系H印G2 (购自ATCC，货号HB8095)，得到功能成熟的肝细胞。
[0212] 二、肝细胞功能检测
[0213] 将上述二得到的肝细胞进行如下检测：
[0214] 定量PCR检测引物：
[0215]ALBGCACAGAATCCTTGGTGAACAGATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA
[0216]CYP2C19 GAAGAGGAGCATTGAGGACCGGCCCAGGATGAAAGTGGGAT
[0217]CYP2C9 GCCACATGCCCTACACAGATGTAATGTCACAGGTCACTGCATGG
[0218]CYP3A4 AGCCTGGTGCTCCTCTATCTCCCTTATGGTAGGACAAAAT
[0219]CYP2B6 CCGGGGATATGGTGTGATCTTCCGAAGTCCCTCATAGTGGTC
[0220] 结果证明，相同基因组合转入肝癌细胞系HepG2中，得到的功能成熟的肝细胞，能 够明显提高H印G2细胞药物代谢相关的关键基因如CYP3A4、CYP2B6等的表达（图12)。
[0221] 因此，转分化来源的肝细胞和H印G2细胞能够为研究药物代谢提供理想的体外细 胞模型，同时也为生物人工肝提供一种理想的新型肝细胞来源。
【主权项】
1. 诱导因子 HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PR0X1、CEBPA、MYC 和 p53 基因抑制剂的至少 一种在用于诱导产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实质细胞中的应 用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述诱导因子为DNA形式，mRNA形式或蛋白质形式； 所述哺乳动物具体为人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；所述哺乳动物尤其具体 为人。
3. -种用重编程体外制备人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳动物肝脏实质细 胞的方法，包括如下步骤： (1) 使离体哺乳动物体细胞中过表达或表达诱导因子^1即认、!1即6、!1即444了?5、？1?0父1、 CEBPA、MYC中的至少一种，且抑制所述离体哺乳动物体细胞中p53基因、p53mRNA或p53蛋 白的表达，得到转基因细胞， (2) 在肝细胞培养基中继续培养所述转基因细胞，即得到人工体外来源的，具有肝脏代 谢功能的肝脏实质细胞。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)的方法如下：将诱导因子导 入离体哺乳动物体细胞中，培养，得到转基因细胞， 所述诱导因子为HNFIA基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROX1基因、CEPBA基 因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子中的至少一种。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于： 所述诱导因子为如下1)或2): 1) 所述诱导因子为HNFIA基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROX1基因 、CEPBA 基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子； 2) 所述诱导因子为HNFlA基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROXl基因、CEPBA 基因、MYC基因和抑制p53基因表达的DNA分子中任意三个； 所述体细胞为成纤维细胞、肝癌细胞、胃细胞、角质细胞或血液细胞； 所述哺乳动物具体为人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；所述哺乳动物尤其具体 为人。
6. 根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于： 各种所述诱导因子均通过表达其的慢病毒共同导入所述哺乳动物体细胞中； 各种所述诱导因子及其对应的慢病毒如下： 所述HNFlA基因，其对应的慢病毒为表达HNFlA的慢病毒； 所述HNF6基因，其对应的慢病毒为表达HNF6的慢病毒； 所述HNF4A基因，其对应的慢病毒为表达HNF4A的慢病毒； 所述ATF5基因，其对应的慢病毒为表达ATF5的慢病毒； 所述PROXl基因，其对应的慢病毒为表达PROXl的慢病毒； 所述CEBPA基因，其对应的慢病毒为表达CEBPA的慢病毒； 所述MYC基因，其对应的慢病毒为表达MYC的慢病毒； 所述抑制P53基因表达的DNA分子，其对应的慢病毒为抑制p53基因表达的慢病毒。
7. 根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述HNFlA基因的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 所述HNF6基因的核苷酸序列为序列表中的序列2 ; 所述HNF4A基因的核苷酸序列为序列表中的序列3 ; 所述ATF5基因的核苷酸序列为序列表中的序列4 ; 所述PROXl基因的核苷酸序列为序列表中的序列5 ; 所述CEBPA基因的核苷酸序列为序列表中的序列6 ; 所述MYC基因的核苷酸序列为序列表中的序列7 ; 所述抑制P53基因表达的DNA分子由序列表中序列8所示的单链DNA分子和序列表中 序列9所示的单链DNA分子退火得到； 步骤1)中，所述培养采用的培养基为哺乳动物体细胞培养基； 所述培养的时间为以慢病毒感染哺乳动物体细胞起5-14天； 步骤2)中，所述继续培养的时间为以慢病毒感染哺乳动物体细胞起15-35天。
8. 由权利要求3-7中任一所述方法得到的哺乳动物肝实质细胞； 或通过转基因或添加诱导因子的方法诱导离体哺乳动物细胞肝脏特异基因的表达而 产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的肝实质细胞； 所述哺乳动物具体为人、大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、兔、马或猪；所述哺乳动物尤其具体 为人。
9. 一种用于诱导产生具有肝脏代谢功能哺乳动物肝脏实质细胞的试剂盒，为如下 1) -3)中任一种： 1) 诱导因子 HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PR0X1、CEPBA、MYC 和 p53 基因抑制剂的至少一 种； 2. HNFlA基因、HNF6基因、HNF4A基因、ATF5基因、PROXl基因、CEBPA基因、MYC基因和 抑制P53基因表达的DNA分子中的至少一种； 3 )表达HNFlA基因的慢病毒、表达HNF6基因的慢病毒、表达HNF4A的慢病毒、表达ATF5 的慢病毒、表达PROXl的慢病毒、表达CEBPA的慢病毒、表达MYC的慢病毒、抑制p53基因表 达的慢病毒中的至少一种； 所述至少一种具体为全部。
10. 权利要求9所述的试剂盒在诱导产生人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺乳 动物肝脏实质细胞中的应用； 或权利要求9所述的试剂盒在用重编程制备人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的哺 乳动物肝实质细胞中的应用。 或权利要求8所述哺乳动物肝实质细胞在体外筛药、人工肝、体内移植、肝病如HBV/ HCV、疟原虫感染相关研究或人源化肝脏动物模型中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种重编程获得人工体外来源的，具有肝脏代谢功能的人肝脏实质细胞的方法，本发明提供了一种将哺乳动物成纤维细胞转分化为肝细胞的方法，包括如下步骤：1）将转录调控因子HNF1A、HNF6、HNF4A、ATF5、PROX1、CEBPA、MYC和p53基因共同导入哺乳动物成纤维细胞中，在体细胞培养基中培养，得到转基因细胞系；2）将所述转基因细胞系在肝细胞培养基中增殖培养，得到哺乳动物肝细胞；本发明的实验证明，本发明将提供了一种重编程方法，能够通过在人成体细胞中过表达肝脏特定蛋白使其转分化为能够人工体外来源的，具有肝脏代谢功能并能体外扩增的人肝细胞。这将极大地推动人肝脏实质细胞在再生医学和药物研发中的应用。
【IPC分类】C12N5-071, C12N15-867, C12N5-10, A01K67-027
【公开号】CN104830906
【申请号】CN201410048337
【发明人】邓宏魁, 杜媛媛, 时艳, 贾均, 王金琳, 向晨罡, 宋南, 徐君, 尹明
【申请人】北京维通达生物技术有限公司, 北京大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2014年2月12日
【公告号】WO2015120776A1