用于植物害虫控制的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于植物害虫控制的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年10月18日提交的美国临时专利申请号61/715, 549的权益， 该美国临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
[0003] 序列表的并入
[0004] 随本文提供了含有被命名为"MTC58633_PCT_SeqListing.txt"的文件的序列表并 且该序列表以引用的方式整体并入本文，该文件是366, 930个字节（在MS-Windows?中 所测量），含有213个序列，并且创建于2013年10月14日。
[0005] 发明背景
[0006]白粉病是影响广泛植物的真菌疾病，所述植物包括谷物、禾本科植物、蔬菜、观赏 植物、野草、灌木、果树、阔叶树荫以及林木，所述真菌疾病是由白粉菌目（Erysiphales)中 的不同的真菌菌种所引起。所述疾病的特征在于白色至浅灰色、滑石粉样生长的斑点或斑 块，所述斑点或斑块产生很小的针头大小的球形结果结构（真菌的闭囊壳或越冬体），这些 结构最初是白色的，随后是黄棕色的并且最终是黑色的。引起白粉病的真菌具有寄主特异 性并且不能在没有适当的寄主植物的情况下存活。它们产生菌丝体（真菌丝状体），所述菌 丝体仅生长在植物的表面上并且通过将吸器或根样结构伸到植物的表皮细胞中来汲养。所 述真菌在植物残体上以闭囊壳或菌丝体的形式越冬。在春天，闭囊壳产生孢子，所述孢子通 过雨水、风或昆虫被移到易感的寄主上。
[0007] 白粉病在温和并且潮湿的气候中特别普遍，其中它们常常在包括温室和田地养殖 在内的各种农业环境中造成显著的产量损失和质量下降。这影响关键的谷物（例如大麦和 小麦）、园艺作物（例如葡萄藤、豌豆以及番茄）以及经济上重要的观赏植物（例如玫瑰）。 获得对白粉病具有抗性的天然来源的途径有限、病原体毒力的快速变化以及合适的抗性基 因向优良品种中的耗时的基因渗入已造成广泛使用杀真菌剂来控制所述疾病。这并不惊人 地已导致杀真菌剂抗性的进化和传播，这在最具经济重要性的白粉病当中尤其显著。
[0008] 霜霉病是由来自霜霉科（Peronosporaceae)的卵菌纲（oomycete)微生物所引起， 所述微生物是植物的寄生物。霜霉科是专性活体营养性植物病原体并且以胞间菌丝体的形 式使用吸器穿透寄主细胞来寄生于它们的寄主植物。霜霉菌通过在独特的白色孢囊柄上形 成孢子囊而以无性方式繁殖，所述孢囊柄通常形成于受感染叶片的下表面上。这些构成了 "霜霉病"并且最初症状在叶片上表现为淡绿色至黄色斑点。孢子囊被风分散到其他叶片的 表面。根据菌属，孢子囊可以通过形成游动孢子或通过芽管而萌发。在后一种情况中，孢子 囊表现得像真菌的分生孢子并且常常被这样称呼。有性繁殖是经由卵孢子。
[0009] 大部分霜霉是草本双子叶植物的病原体。一些霜霉菌菌属具有相对有限 的寄主范围，例如菊科植物（Asteraceae)上的圆梗霉属（Basidiophora)、类霜霉属 (Paraperonospora)、原盘梗霉属（Protobremia)以及盘梗霉属（Bremia);几乎仅仅 处于十字花科植物（Brassicaceae)上的普罗氏霜霉属（Perofascia)和透明霜霉属 (Hyaloperonospora);禾本科植物（Poaceae)上的维氏霜霉属（Viennotia)、食禾霜霉属 (Graminivora)、普卡氏霜霉属（Poakatesthia)、指梗霉属（Sclerospora)以及霜指霉属 (Peronosclerospora);毛茛科植物上的普拉氏霜霉属（Plasmoverna)。然而，最大的菌属， 即霜霉属（Peronospora)和单轴霉属（Plasmopara)具有非常广泛的寄主范围。
[0010] 在商业性农业中，霜霉病对于十字花科植物、葡萄以及在藤本植物上生长的蔬菜 的种植者来说是一个特别的问题。具有经济重要性的霜霉包括感染葡萄藤的葡萄生单轴 霉（Plasmoparaviticola)、引起烟草上的青霉病的烟草霜霉（Peronosporatabacina)、 莴苣盘梗霉（BremialactucaeM莴苣上的一种寄生物）、以及向日葵上的霍尔斯单轴霉 (Plasmoparahalstedii)〇
[0011] 锈菌（柄锈菌目（Pucciniales)，原先的锈菌目（Uredinales))是维管束植物的专 性活体营养性寄生物。锈菌影响多种植物；叶片、茎、果实以及种子，并且最常被看到的是有 色粉末，所述粉末由微小的锈孢子构成，所述锈孢子落在植被上，产生在下表面上形成的孢 子堆或夏孢子堆。在晚春或初夏期间，被称作冬孢子堆的黄橙色或棕色的毛发状或舌状结 构在叶片上生长或从木本寄主的树皮中显露。这些冬孢子堆产生冬孢子，所述冬孢子将萌 发成气生担孢子，从而传播并且引起进一步的感染。
[0012]在单子叶植物大麦（Hordeumvulgare，Piffanelli等人，Nature. 2〇04 430(7002) : 887-91)以及双子叶植物拟南芥（Arabidopsisthaliana)(Consonni等 人，NatGenet. 2006 38 (6): 716-20)、番前（Solanumlycopersicum，Bai等人，MolPlant MicrobeInteract. 2008 21(1) :30_9)以及碗豆（Pisumsativum，Humphry等人，MolPlant Pathol. 2011年4月21日.EPUB)中，ML0(霉病抗性基因座0)基因的功能丧失型突变赋 予高度有效的广谱白粉病抗性。ML0抗性似乎在早期起作用并且通常在第一个寄主细胞受 到侵袭之前终止真菌发病。ML0抗性的杰出功效和持久性已产生携带基因渗入的ML0等位 基因的优良大麦品系，所述优良大麦品系在欧洲农业中被成功地使用了约三十年。然而， ML0突变体具有多种不希望有的农学品质，包括环境依赖性坏死性叶斑病以及降低的产量 (Molina-Cano等人，TheorApplGenet. 2003 107 (7): 1278-87)。此外，大麦ML0 突变体还 显示出增强的对半活体营养性稻瘟病菌（Magnaporthegrisea)和死体营养性小麦根腐病 菌（Bipolarissorokinianaare)的易感性。使用拟南芥属（Arabidopsis)白粉病抗性ML0 突变体进行的实验室研宄表明这些农学缺陷，包括诸如自发的细胞壁敷着（apposition)、 细胞死亡、老化样萎黄病以及对互隔链格孢菌（Alternariaalternata)、甘蓝链格孢菌 (A.brassicicola)以及马铃薯晚疫病菌（Phytophthorainfestans)(死体营养性链格孢 菌属菌种（Alternariaspp.)和半活体营养性马铃薯晚疫病菌）增强的易感性之类的其 他缺陷在内，分别是多效性效应而并非简单地连锁累赘（Consonni等人，NatGenet. 2006 38(6) : 716-20)。
[0013] 最近，已经公开了一种经由对ML0基因进行转基因敲低来提高对大豆锈病的抗性 的方法（Markus等人的美国专利申请20100192254)。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明提供了包含多核苷酸分子的组合物和例如通过提供抑制表达的RNA或DNA 对植物进行处理以改变或调节所述植物中的基因或基因转录物表达的方法。本发明的各个 方面提供了包含多核苷酸分子的组合物和用于对植物局部施用这些组合物以调节植物细 胞中的内源性霉病抗性基因座0(ML0)基因的相关方法。本文公开的多核苷酸、组合物以及 方法可用于降低ML0转录物的水平以及提高植物的真菌病和/或线虫抗性。
[0016]在本发明的一个方面，在组合物中提供了多核苷酸分子，所述多核苷酸分子能够 渗透或被吸收到活植物组织中以引发局部的、部分全身性的或全身性的基因抑制作用或调 节作用。在本发明的某些实施方案中，所述多核苷酸分子最终向植物提供或允许在植物中 产生如下的RNA，所述RNA能够在生理条件下在植物细胞中与植物细胞中从靶标内源性基 因或靶标转基因所转录的RNA杂交，从而实现对内源性ML0靶基因的调节。在某些实施方 案中，如通过使靶基因沉默或抑制所述靶基因对ML0靶基因进行调节会引起另一种基因的 上调，所述另一种基因本身是通过减少ML0靶基因的表达而被影响或调节。
[0017]在本发明的某些方面或实施方案中，根据本文所述的方法向植物或植物部分局部 施用包含外源性多核苷酸和转移剂的组合物并不一定引起也不需要所述外源性多核苷酸 被整合到植物的染色体中。在本发明的某些方面或实施方案中，根据本文所述的方法向植 物或植物部分局部施用包含外源性多核苷酸和转移剂的组合物并不一定引起也不需要所 述外源性多核苷酸由被整合到植物的染色体中的DNA进行的转录。在某些实施方案中，根 据本文所述的方法向植物局部施用包含外源性多核苷酸和转移剂的组合物还并不一定需 要所述外源性多核苷酸与粒子以物理方式结合，如在生物射弹介导的向植物、植物部分或 植物细胞的内部引入与金粒子或钨粒子缔合的多核苷酸中。在本文所提供的方法的某些实 施方案中，本文所提供的某些方法和组合物中所用的外源性多核苷酸可以任选地与可操作 地连接的启动子序列缔合。然而，在其他实施方案中，本文所提供的某些方法和组合物中所 用的外源性多核苷酸并非与可操作地连接的启动子序列缔合。此外，在某些实施方案中，本 文所提供的某些方法和组合物中所用的外源性多核苷酸没有可操作连接至病毒载体。
[0018] 在某些实施方案中，提供了用于提高植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的方法， 所述方法包括局部施用包含抑制靶向的ML0基因的多核苷酸和转移剂的组合物。在某些实 施方案中，提供了用于选择性抑制所靶向的ML0基因的方法，所述方法是通过在植物生长 的一个或多个所选择的种子期、营养生长期或繁殖期向植物表面局部施用多核苷酸组合物 来实现的。这些方法可以根据需要或依照要求在植物或植物部分中提供基因抑制作用。在 某些实施方案中，提供了用于选择性抑制靶标ML0基因的方法，所述方法是通过在植物生 长的一个或多个预定的种子期、营养生长期或繁殖期向植物表面局部施用多核苷酸组合物 来实现的。这些方法可以在植物或植物部分中提供ML0基因抑制作用，所述ML0基因抑制 作用避免了在植物发育的特定的种子期、营养生长期或繁殖期抑制基因表达的任何不希望 有的或不必要的影响。
[0019] 在某些实施方案中，提供了用于选择性提高植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的 方法，所述方法是通过在一个或多个所选择的种子期、营养生长期或繁殖期向植物表面局 部施用多核苷酸组合物来实现的。这些方法可以根据需要或依照要求在植物或植物部分中 提供提高的真菌病抗性和/或线虫病抗性。在某些实施方案中，提供了用于选择性提高植 物的真菌病抗性和/或线虫抗性的方法，所述方法是通过在一个或多个预定的种子期、营 养生长期或繁殖期向植物表面局部施用多核苷酸组合物来实现的。这些方法可以在植物或 植物部分中提供真菌病和/或线虫抗性的提高，所述提高避免了在植物发育的特定的种子 期、营养生长期或繁殖期抑制ML0基因表达的任何不希望有的或不必要的影响。
[0020] 可以用于抑制ML0的多核苷酸包括但不限于以下各项中的任一种：i)包含至少18 个连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与编码表2或表3中的蛋白质（SEQ IDN0:l-27、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、 72、74、76或78)的一种或多种基因的转录物基本上同一或基本上互补；ii)包含至少18个 连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与表3中的MLO基因或MLO样基因基本 上同一或基本上互补，所述MLO或MLO样基因包括SEQIDN0:29、31、33、35、37、39、41、42、 43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77 或 79 的多核苷酸；或包含至 少18个连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQIDN0:80-195的多核苷 酸基本上同一或基本上互补。在一些实施方案中，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含 与SEQIDNO: 197-213的至少18个连续核苷酸基本上同一或基本上互补的核苷酸序列。在 一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQIDNO: 197-213基本上同一或基本上互补的核 苷酸序列。提供了某些多核苷酸在转移剂存在下的局部施用的方法和组合物可以用于以最 佳的方式抑制霉病抗性基因座O(MLO)基因表达。在某些实施方案中，可以"根据需要"在 发现真菌病或线虫出现后施用本文提供的组合物。在某些实施方案中，本文提供的组合物 可以作为预防措施被施用以防止真菌病或线虫的出现。在某些实施方案中，可以避免对产 量或其他特征有任何有害影响的方式施用所述组合物，所述其他特征可能与抑制作物植物 的ML0基因表达有关。所施用的多核苷酸与植物中的ML0靶标寄主基因互补并且它们的局 部施用引起了对ML0基因活性的抑制。
[0021] 本文提供了用于控制植物真菌病的组合物和方法。可以使用本文提供的方法和组 合物加以控制的植物真菌病包括但不限于专性活体营养性白粉病、霜霉病以及锈病真菌侵 扰。某些实施方案涉及方法和组合物，所述方法和组合物用于减少寄主植物的一种或多种 细胞或组织中一种或多种寄主植物ML0多核苷酸和/或蛋白质分子的表达以使得寄主植物 不太易感白粉菌目、霜霉科或柄锈菌目的真菌感染。在某些实施方案中，公开了可以通过本 文提供的方法和组合物下调以提高植物对白粉病、霜霉病或锈病感染的抗性的植物霉病抗 性基因座0(ML0)基因和基因产物的核苷酸和氨基酸序列。
[0022] 本文还提供了如下的方法和组合物，所述方法和组合物使得植物根部的至少 细胞中所靶向的ML0多核苷酸和蛋白质分子的表达减少以提高对线虫的抗性。可以通 过本文提供的方法和组合物加以控制的线虫包括但不限于根癌线虫（如根结线虫属种 (Meloidogynesp.))、孢囊线虫（如黄金线虫属种（Globoderasp.)和异皮线虫属种 (Heteroderasp.))、根腐线虫（如短体线虫属种（Pratylenchussp.))等。在某些实施方 案中，通过向植物叶片、苗、根部和/或种子局部提供组合物来减少滋养线虫的植物根部细 胞中的ML0表达，所述组合物包含多核苷酸，所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述 至少18个连续核苷酸与霉病抗性基因座0(ML0)基因或ML0基因的转录物基本上同一或基 本上互补；以及转移剂。
[0023] 还提供了如下的方法和组合物，其中利用局部诱导的ML0转录物或蛋白质水平的 降低来实现白粉病、霜霉病或锈病控制，同时使在寄主植物中有害的多效性效应减到最低 程度。这些方法和组合物提供了经过优化的ML0基因抑制水平和/或经过优化的ML0基因 抑制时机。
[0024] 本发明的某些实施方案涉及用于产生植物的方法，所述植物表现出真菌病抗性和 /或线虫抗性的提高，所述方法包括向植物表面局部施用包含以下各项的组合物：
[0025]a.至少一种包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与 霉病抗性基因座〇(MLO)基因或所述基因的转录物基本上同一或基本上互补；以及
[0026] b.转移剂，其中所述植物表现出由于抑制霉病抗性基因座0(ML0)基因所引起 的真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。在某些实施方案中，所述多核苷酸分子包含正义 ssDNA、正义ssRNA、dsRNA、dsDNA、双链DNA/RNA杂交体、反义ssDNA或反义ssRNA。在某些 实施方案中，所述多核苷酸选自由SEQIDN0:80-195组成的组，或其中所述多核苷酸包含 至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQIDN0:29、31、33、35、37、39、41、 43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77 或 79 基本上同一或基本上 互补。在一些实施方案中，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQIDN0:197-213 的至少18个连续核苷酸基本上同一或基本上互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述 多核苷酸包含与SEQIDN0:197-213基本上同一或基本上互补的核苷酸序列。在某些实施 方案中：(a)所述植物是玉米植物，所述基因或所述转录物是玉米霉病抗性基因座0(ML0) 基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQIDNO: 160-162以及SEQIDNO: 163 组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ IDN0:68-69基本上同一或基本上互补；(b)所述植物是大豆植物，所述基因或所述转录 物是大豆霉病抗性基因座0(ML0)基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQID NO: 112-118以及SEQIDNO: 119组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所 述至少18个连续核苷酸与SEQIDN0:45或47基本上同一或基本上互补；（c)所述植物 是棉花植物，所述基因或所述转录物是棉花霉病抗性基因座0(ML0)基因或转录物，和/或 所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与编码SEQIDN0:4 的棉花基因或转录物基本上同一或基本上互补；（d)所述植物是大麦植物，所述基因或所 述转录物是大麦霉病抗性基因座0(ML0)基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ IDN0:80-83、184、192、194以及SEQIDN0:197-213组成的组，或所述多核苷酸包含至少 18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQIDN0:29基本上同一或基本上互补； (e)所述植物是黄瓜植物，所述基因或所述转录物是黄瓜霉病抗性基因座0(ML0)基因或转 录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQIDN0:84-98以及SEQIDN0:99组成的组，或所 述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQIDN0:31、33、35 或37基本上同一或基本上互补；（f)所述植物是莴苣植物，所述基因或所述转录物是莴苣 霉病抗性基因座〇(MLO)基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQIDN0:100-102 以及SEQIDNO: 103组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个 连续核苷酸与SEQIDN0:39基本上同一或基本上互补；（g)所述植物是豌豆植物，所述基 因或所述转录物是豌豆霉病抗性基因座0(ML0)基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选 自由SEQIDN0:104-106以及SEQIDN0:107组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连 续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQIDN0:41基本上同一或基本上互补；(h)所述 植物是苜蓿属（Medicago)植物，所述基因或所述转录物是苜蓿属霉病抗性基因座0(ML0) 基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQIDNO: 108-110以及SEQIDNO: 111组 成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQID N0:43基本上同一或基本上互补；（i)所述植物是胡椒植物，所述基因或所述转录物是胡椒 霉病抗性基因座0(ML0)基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQIDN0:120-122 以及SEQIDNO: 123组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个 连续核苷酸与SEQIDN0:49基本上同一或基本上互补；（j)所述植物是番茄植物，所述基 因或所述转录物是番茄霉病抗性基因座〇(MLO)基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选 自由SEQIDNO: 124-130以及SEQIDNO: 131组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个 连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQIDNO:51或53基本上同一或基本上互补； (k)所述植物是小麦植物，所述基因或所述转录物是小麦霉病抗性基因座O(MLO)基因或转 录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQIDNO: 132-142以及SEQIDNO: 143组成的组，或 所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQIDNO:55、57 或59基本上同一或基本上互补；（1)所述植物是葡萄植物，所述基因或所述转录物是葡萄 霉病抗性基因座〇(MLO)基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQIDNO: 144-158 以及SEQIDNO: 159组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个 连续核苷酸与SEQIDN0:61、63、65或67基本上同一或基本上互补；(m)所述植物是高粱植 物，所述基因或所述转录物是高粱霉病抗性基因座〇(MLO)基因或转录物，并且所述多核苷 酸分子选自由SEQIDNO: 164-166以及SEQIDNO: 167组成的组，或所述多核苷酸包含至少 18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQIDN0:71基本上同一或基本上互补；或 (n)所述植物是水稻植物，所述