证明GmINHl和GmINH2具有蔗糖转化酶抑制酶活 性。
[0084] 5、蔗糖转化酶抑制酶基因表达量分析
[0085] 提取大豆品种黑农46不同组织部位的RNA，提取方法参照Qiagen公司的RNA提 取试剂盒，通过普通琼脂糖凝胶电泳检测完整性，电泳条件：胶浓度2 % ;0. 5 X TBE电泳缓 冲液150V，30min。通过紫外分光光度仪检测RNA的纯度和浓度。将所提取的RNA反转录 成cDNA，方法如下：取总RNAl μ g使用RQlDNase去除基因组DNA(Promega公司）。10 μ L 纯化的RNA的反转录使用AMV反转录酶（Roboklon公司）与oligo(dT)引物，dNTP和RT buffer混合42°C温浴1小时。最后将来源于3次生物学重复的RNA样品反转录成cDNA用 于 Real-time PCR 检测，Real-time PCR 使用 Jumpstart Taq-DNA 聚合酶（Sigma 公司）和 SYBR green(Biorad公司）作为荧光报告。以大豆EF/b、CYP、Actin2/7和ActinII基因为 内参，根据实验的要求，活性分析正确的抑制酶基因及内参各设计了 1对引物，引物设计应 用Primer Primier5.0和Vector NTl软件。实时定量PCR测定蔗糖转化酶抑制酶基因组 织表达差异。实验每次重复4次，实验重复3次。
[0086] 内参基因的引物序列如下：
[0087] Primers Sequences Product ACTII Forward: 5'- ATCTT GACTG AGCGT GGTTA TTCC-3' ACTlI Reverse: 5'-GCTGG TCCTG GCTGT CTCC -3' 126bp ACT2/7 Forward: S5-CTTCC CTCAG CACCT TCCAA -3' ACT2/7 Reverse: 5，-GGTCC AGCTT TTCAC ACTCC AT-3， 119bp
[0088] CYP Forward: 5，-ACGAC GAAGA CGGAG TGG'r CYP Reverse: 5'-CGACG ACGAC AGGCT TGG-3， 13Obp EFZb Forward: 5'-CCACT GCTGA AGAAG ATGAT GATG-3' EF/b Reverse: 5，-AAGGA CAGAA GACTT GCCAC TC -3' 134bp GmINHl Forward: 5，-TTCAATACCATCAAGCCACT -3' GmINHl Reverse: 5，-TCAGCACAAGAACTCAAGG-3， 273bp GmI N H2 Forward: 51 -CTCTGCTGGG A A AT CGCC ACTC AC-35 GmINH2 Reverse: 5ATTAAATTGCATCATCCCCTC CGTTG-3! 128bp
[0089] Real-time PCR扩增的反应体系为15 μ L，成分如下：
[0090] 成分 用量 cDNA sample (^? ? '? J - LSngRNA) 5'uL 1〇μΜ 引物 Pl 0.5 μL 10μΜ 引物 Ρ2 0.5 μL 10 X PCRbuffer 1 5 μL !OmMdNTP 0.3 μL Jumpstart Taq DNA polymerase 0.15 μL (1:400)稀释的 S YBR Green 0.15 μL 无菌水 补足体系
[0091] PCR 扩增条件为：95°C变性 6min，95°C变性 20s，58°C 退火 20s，72°C延伸 20s，共 40 个循环，溶解循环是65°C~95°C。
[0092] 采用比较CT法（ΛΛ CT)，相对表达量=2_AACT = 2 _ (ACT样品_ACT对照）=2 _ [(CT 样品_ CT内参）_ (CT对照_ CT内参）] O
[0093] 采用Q-Gene软件来计算平均靶基因的表达。目的基因的相对表达是由多个内参 考基因（EF/b，CYP，Actin2/7, ActinII)的计算取平均值。
[0094] 结果显示两个基因在大豆的营养组织和生殖组织中都有表达，但是在花中的表达 量最高（图2和3)。
[0095] 6、RNAi沉默载体的构建：
[0096] 选取GmINH2编码区362bp的正向序列及相对应的反向序列，中间插入大豆FAD2 基因的内含子，构成发夹结构的颈环区，然后用BamH I和Sac I双酶切连于pCAMBIA3300 中，构建载体命名为pCAMBIA3300-GmINH2I，其中插入核苷酸片段的序列如SEQ ID No:5,6 和7所示；
[0097] 以大豆FAD2基因的内含子为RNAi内含子颈环结构，分别扩增出约250bp的 GmINHl和GmINH2基因片段，顺次连接组成RNAi结构的正向结构，同时扩增出其反向结构， 分别正反向连于FAD2I的两侧，构建在载体pUC18中，构建成RNAi的典型结构，然后用BamH I和Spe I双酶切连于pCAMBIA3300中，构建载体命名为pCAMBIA3300-GmINHl&2I，其中插 入核苷酸片段的序列如SEQ ID No :8和9所示。
[0098] 7、两个基因的沉默载体对大豆的转化：
[0099] 使用的启动子为35S，终止子为Nos，筛选标记基因为bar基因，大?的再生体系以 子叶节为外植体诱导再生植株的再生系统，采用农杆菌介导技术将pCAMBIA3300-GmINH2I 和pCAMBIA3300-GmINHl&2I导入到大豆品种哈交5337中进行组成型表达，获得PCR阳性株 系，即完成提高大豆籽粒重量。
[0100] 7.1 检测
[0101] 由于导入的是RNAi的发夹结构，GmINH2基因的正反向结构不适宜PCR检测，因此 针对目的基因35s-FAD2intr 〇n设计特异性引物，对转基因各株系及对照进行PCR检测，PCR 扩增产物长度为797bp。
[0102] 35s-FAD2intron基因引物在各转基因株系中的扩增结果如图4,图5所示。
[0103] PCR扩增的反应体系为20 μ L，成分如下：
[0104] 成分 用量 DNA模板 UiL IΟμΜ 引物 PI(35s-FAD2 intron S) 0.8'uL 5'-GCCGTAAAGACTGGCGAACA-3' ΙΟμΜ物 P2(35s-FAD2 intron AS) 0 8μL 5'-CAAAATGAATGGAGGGAAGTGAC-3' IOxBuffer 2.5μL lOmmol/LdNTP 2μL Taq 酶（5U/pL) 0.5μL 无菌水 12.4μL
[0105] PCR 扩增条件为：94°C变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 35个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。
[0106] 8、转基因后代百粒重变化：
[0107] 测定转基因后代材料百粒重，如图6和7所示，转化株系与对照哈交5337对比，百 粒重明显增加。
【主权项】
1. 一种提高大豆籽粒重量的方法，其特征在于它按以下步骤实现： 一、 大豆蔗糖转化酶抑制酶基因的cDNA克隆： 通过NCBI网上数据库资源比对筛选大豆cDNA文库及EST文库，筛选出与已报导的INH基因在特有氨基酸序列保守序列上相近的潜在INH基因，并分别命名为GmINHl和GmINH2 ; 其中，步骤一中所述GmINHl的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示，其编码蛋白的氨基酸 序列如SEQIDNO:2所示； 步骤一中所述GmINH2的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4 所示； 二、RNAi沉默载体的构建： 选取GmINH2编码区362bp的正向序列及相对应的反向序列，中间插入大豆FAD2基因 的内含子，构成发夹结构的颈环区，然后用BamHI和SacI双酶切连于pCAMBIA3300中，构 建载体命名为pCAMBIA3300-GmINH2I; 以大豆FAD2基因的内含子为RNAi内含子颈环结构，分别扩增出约250bp的GmINHl和GmINH2基因片段，顺次连接组成RNAi结构的正向结构，同时扩增出其反向结构，分别正反 向连于FAD2I的两侧，构建在载体pUC18中，构建成RNAi的典型结构，然后用BamHI和Spe I双酶切连于PCAMBIA3300中，构建载体命名为pCAMBIA3300-GmINHl&2I; 三、 两个基因的沉默载体对大豆的转化： 使用的启动子为35S，终止子为Nos，筛选标记基因为bar基因，大豆的再生体系以子 叶节为外植体诱导再生植株的再生系统，采用农杆菌介导技术将pCAMBIA3300-GmINH2I和 pCAMBIA3300-GmINHl&2I导入到大豆品种哈交5337中进行组成型表达，获得PCR阳性株系， 即完成提高大豆籽粒重量。2. 根据权利要求1所述的一种提高大豆籽粒重量的方法，其特征在于步骤一中所述已 报导的INH基因，其GenBank登录号分别为BT090960. 1和BT091584. 1。3. 根据权利要求1所述的一种提高大豆籽粒重量的方法，其特征在于步骤一中所述 GmINHl基因的全长711bp，具有549bp完整的开放读码框核苷酸序列，编码182个氨基酸， 其成熟酶蛋白的分子量为19. 7kD。4. 根据权利要求1所述的一种提高大豆籽粒重量的方法，其特征在于步骤一中所述 GmINH2基因的全长729bp，具有555bp完整的开放读码框核苷酸序列，编码184个氨基酸， 其成熟酶蛋白的分子量为19. 8kD。
【专利摘要】一种提高大豆籽粒重量的方法，它涉及提高大豆籽粒重量的方法。它要解决目前大豆籽粒重量低致使产量不高的问题。方法：一、大豆蔗糖转化酶抑制酶基因的cDNA克隆；二、RNAi沉默载体的构建；三、两个基因的沉默载体对大豆的转化。本发明从大豆品种黑农46中克隆出的两种INH基因，通过转化后具有对大豆蔗糖转化酶明显的抑制功能，并使转化植株种子的百粒重明显增加。酶活分析GmINH1基因抑制酶效果显著，说明该基因具备蔗糖转化酶抑制酶功能，组织特异性表达分析GmINH1基因在花中的表达量最高。构建的GmINH1和GmINH2基因RNAi载体对大豆哈交5337进行遗传转化，转基因后代种子的百粒重相比对照显著提高。
【IPC分类】C12N9/00, A01H5/00, C12N15/52, C12N15/84
【公开号】CN104911208
【申请号】CN201510354449
【发明人】刘丽君, 唐晓飞, 魏崃, 王伟威, 于志远
【申请人】黑龙江省农业科学院大豆研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月24日