一种获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体cpb-lar-gfp的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体CPB-LAR-GFP。
【背景技术】
[0002]红豆草(Onobrychis viciaefolia)为多年生草本植物，其地上部分粗蛋白质及氨基酸含量丰富，含有一定数量的粗脂肪、多种维生素和矿物质及其他化学物质。红豆草的种子产量和产草量高，结实性能较好，营养物质全面而丰富，适口性优良[陈宝书.中国草原，1983, (2):36-45.]。甘肃红豆草(Onobrychis viciifolia cv.Gansu)是由普通红豆草和高加索红豆草自由杂交多次混合授粉的植株中单株选择培育成的[陈宝书.红豆草[M].兰州:甘肃科学技术出版社，1992.]。选育目的是为我国干旱半干旱地区建立人工草地。其产草量接近或超过早熟、速生、抗病虫害、高产、耐旱的紫花苜蓿品种。
[0003]可溶性蛋白含量高是苜蓿引起家畜臌胀病的主要原因[Howarth R E, etal.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1977，25 (I): 175-179.]。缩合单宁能够与可溶性蛋白质作用生成沉淀，避免引起臌胀病，然而紫花苜蓿叶片不含缩合单宁，只在种皮中少量存在。红豆草在各个生长时期叶片都能生产高浓度的缩合单宁[吴自立等.中国草地学报，1993，(5):25-27.] ο家畜饲用有大分子缩合单宁的红豆草后不会患臌胀病，普遍认为红豆草是在遗传资源创新途径和饲草利用方式解决紫花苜蓿引起牲畜臌胀病发生的一种理想牧草[(I)McMahon L R, et al.Canadian Journal of PlantScience, 2000，80:469 - 485 ； (2)王玉萍等.草地学报，2000，8 (2): 126-131.]。在遗传资源创新方向，从红豆草中鉴定和分离缩合单宁合成酶基因，进而利用基因工程技术将此基因导入到苜蓿中去，不失为一条改善苜蓿品质和适口性的有效途径。
[0004]缩合单宁合成途径主要由公共苯丙烷途径、核心类黄酮-花青素途径、缩合单宁特异途径完成，其中缩合单宁特异途径最终决定其积累[Xie DY, et al.Science, 2003, 299(5605):396-399.]。缩合单宁特异生成途径中有两个关键酶分别是无色花青素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase, LAR)和花青素还原酶(Anthocyanidinreductase, ANR)[(I)Xie DY,et al.Science, 2003, 299(5605):396-399 ；(2)Bogs J, etal.Plant Phys1logy, 2005，139(2):652-663.]。LAR 和 ANR 为单宁的生成提供了两条不同的途径和不同的前体物质，然而前者的底物无色花青素又是经花青素合成酶合成的花青素成为后者的底物，LAR在缩合单宁特异合成途径中尤为重要[Yuan L, et al.Journalof Experiment Botany, 2012，63 (7): 2513-2524.]。一些研宄证实 LAR 基因的表达与缩合单宁的累积正相关[Paolocci F，et al.Plant phys1logy, 2007，143 (I): 504-516.]。调控LAR基因的表达水平可以改变CT的积累。最早克隆的LAR基因来自豆科植物--金钱草(Desmodium uncinatum)，该基因编码的蛋白可催化产生儿茶素，证明了 LAR 为单宁合成途径中的限速酶[Tanner GJ, et al.Journal of B1logy Chemistry, 2003, 278:31647-31656.]。在感染叶锈病的杂交杨(P.trichocarpaXP.Deltoides)中，单宁合成途径中关键酶基因LAR的转录水平明显增加，单宁含量显著升高[Miranda M, etal.Molecular Plant-Microbe Interact1ns, 2007，20:816-831]。
[0005]抗广谱除草剂草丁膦的bar (bialaphos resistance gene)基因具有较好的抗除草剂抗性[(I)孟灵真等.新疆农业大学学报.2013，36 (4):265-268 ; (2) De Block M, etal.EMBO J, 1987,6(9):2513-2518 ;杨竹平等，生物技术与可持续农业[Μ].上海:上海科学技术文献出版社，2000.]，既针对植物虫害和大量使用除草剂给植物所带来的负面影响，又可降低在农业生产中的人力和财力投入。bar基因也是常用的选择标记基因之一，将它与其它目的基因构建到同一载体上，选择培养基中加入一定的量就能筛选到含目的基因的转化细胞。它克服了抗生素筛选的局限性，细胞产生的假转化体很少。
[0006]绿色焚光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是一类存在于水母、水媳和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发射绿色荧光[杨明瑜等.食品与生物技术学报，2008，27 (2):98-102.]。作为基因选择，GFP在植物中主要有2个作用:监测基因的表达和蛋白质的定位；并且能作为转基因植物的分子标记，代替 GUS 的作用[Jim H, Brad A.Technical Focus, 1995，8 (11): 10-11.]。GFP作为选择标记基因用来检测转基因效率，将其连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。作为转基因植株的报告分子GFP，最大的优点是，在不破环细胞和化学染色的情况下直接成像，检测极为方便[Chalfie M, etal.Science, 1994, (263):802-805。]。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了获得转基因苜蓿的方法及其专用表达载体CPB-LAR-GFP。
[0008]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:用于获得一种转基因苜蓿的植物表达载体，所述植物表达载体为具有绿色荧光蛋白GFP标记基因和抗除草剂bar基因的缩合单宁合成酶LAR基因植物表达载体CPB-LAR-GFP。
[0009]本发明的第二个目的是提供了上述的用于获得一种转基因苜蓿的植物表达载体的构建方法，包括以下步骤:
[0010]I)红豆草无色花青素还原酶LAR基因的克隆:
[0011 ] 选择甘肃红豆草叶片提取RNA并纯化RNA，反转录合成cDNA第一链，PCR扩增LAR基因；将回收的扩增产物连接到T载体转化大肠杆菌感受态；挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，测序；将测序结果进行比对分析；确定缩合单宁合成酶LAR基因，得到重组子为:pMD-LAR ；
[0012]2)绿色荧光蛋白GFP基因的亚克隆:
[0013]挑取pBI121-Lyz_GFP菌株的单菌落(pBI121_Lyz_GFP菌株的获得，可参见《pBI121-Lyz-GFP表达载体的构建及其在和田苜蓿愈伤组织中的转化》，柴燕文等，《农业技术生物学报》2008年05期)，摇菌、提取质粒，PCR扩增GFP基因，将回收的GFP目的片段与T载体连接后转化大肠杆菌感受态；挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，测序，得到重组子为:pMD-GFP ；
[0014]3) CPB-LAR-GFP植物表达载体的构建及鉴定:
[0015]对pMD-GFP进行BamH I和Sma I双酶切，切下GFP基因；对pMD_LAR进行Sma I和Sac I双酶切，切下LAR基因；对载体CPB进行BamH I和Sac I双酶切，通过T4DNA连接酶将具有粘性末端的载体和基因，16°C过夜连接，连接产物转化感受态E.coli DH5 α，挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，得到CPB-LAR-GFP植物表达载体。
[0016]本发明的第三个目的是提供了获得一种转基因苜蓿的方法，是将上述的CPB-LAR-GFP植物表达载体通过农杆菌介导法导入苜蓿中，得到具有抗除草剂性质和缩合单宁含量高的转基因苜蓿。
[0017]进一步的，上述的获得一种转基因苜蓿的方法，是采用冻融法将植物表达载体CPB-