LAR-GFP转化至根癌农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂布于含卡那霉素、利福平和链霉素的YEB固体培养基上，28°C恒温培养2d，挑取阳性单菌落，进行PCR鉴定。
[0018]进一步的，上述的获得一种转基因苜蓿的方法，将重组农杆菌转化紫花苜蓿的具体操作包括以下步骤:
[0019]a)取含供试质粒CPB-LAR-GFP的农杆菌LBA4404，在含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的YEB平板培养基上划线，28°C培养2d后，挑取单菌落接入含相应抗生素的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜，得到活化农杆菌，所述活化农杆菌的0D600值为0.3?
0.5 ；
[0020]b)剪取紫花苜蓿无菌苗的下胚轴，用步骤a)得到的活化农杆菌侵染lOmin，侵染完用无菌水将组织材料清洗干净，用无菌滤纸将水吸干，共培养3d后转入诱导培养基，暗培养25d后，转入分化培养基，进行分化再生培养。。
[0021 ] 本发明的技术关键点和欲保护点是构建具有GFP及抗除草剂bar基因的缩合单宁合成酶LAR基因植物表达载体CPB-LAR-GFP，将构建好的表达载体通过农杆菌介导法导入苜蓿中，在检测转基因植株时方便、快捷，无需染色，不破坏细胞结构，只需在紫外或蓝光激发下，通过测定GFP的荧光强度来监测基因的表达和蛋白质的定位。在选择培养基中加入一定的量除草剂就能筛选到含目的基因的转化细胞。它克服了抗生素筛选的局限性，细胞产生的假转化体很少。此表达载体含有抗除草剂bar基因和缩合单宁合成酶LAR基因，同时导入苜蓿品种，旨在培育具有抗除草剂和高缩合单宁含量的优良转基因苜蓿新品种，这样既可减少大量使用农药对环境造成的污染，又可提高牧草中缩合单宁的含量，进一步预防动物臌胀病的发生。
[0022]本发明的有益效果为:本发明旨在从缩合单宁含量高的植物-红豆草中分离克隆缩合单宁合成酶LAR基因，构建携带绿色荧光蛋白GFP和抗除草剂bar基因的双标记选择植物表达载体CPB-LAR-GFP。通过遗传转化法，将抗除草剂基因和缩合单宁基因同时导入苜蓿，这样既可减少除草剂的使用，减轻大量使用农药对环境造成的污染，又可提高牧草中缩合单宁的含量，最终培育出具有抗除草剂和抗臌胀病优势的牧草新品种。
[0023]本发明载体中的LAR基因来源于红豆草，从红豆草中分离克隆缩合单宁合成酶LAR基因，而且构建的载体增加了 bar基因，既具有抗除草剂性质，又具有标记基因的功能。因此本发明构建的载体具备双标记基因，可大大提高筛选转基因植株的效率。通过本发明载体转化的转基因植株将获得抗除草剂特征，这样即可避免使用大量除草剂而造成的生产成本提高，又可降低环境污染的压力。
【附图说明】
[0024]图1为甘肃红豆草不同器官的总RNA。
[0025]其中，泳道I为蕾总RNA，泳道2为莖总RNA，泳道3为叶总RNA，泳道4为花总RNA，泳道5为荚果总RNA。
[0026]图2为LAR阳性克隆的PCR鉴定结果图(?Ikb)。
[0027]其中，泳道M为DLlOOOMarkerJIdt 1、2为阳性克隆PCR产物。
[0028]图3为LAR阳性克隆双酶切(Smal I +Sac I )鉴定结果图(?Ikb)。
[0029]其中，泳道M为DLlOOOMarker，泳道1、2为阳性克隆Smal I和Sac I双酶切产物。
[0030]图4为甘肃红豆草LAR基因序列图，如序列表中序列I所示。
[0031]图5为GFP滞后质粒PCR鉴定结果图。
[0032]其中，泳道4 为 DLlOOOMarker，泳道 1、2、3 为 GFP 基因(~ 750bp)。
[0033]图6为GFP滞后质粒双酶切(BamH I +Smal I )鉴定结果图。
[0034]其中，泳道I为DLlOOOMarker，泳道2、3为GFP滞后质粒双酶切鉴定(BamH I +Smal I , ^ 750bp)。
[0035]图7为GFP基因测序结果图，如序列表中序列2所示。
[0036]图8为重组质粒PCR及双酶切鉴定结果图。
[0037]其中，泳道1、5为DL2000Marker，泳道2为重组质粒双酶切结果(BamH I +Sac I，714bp)，泳道3为重组质粒双酶切(Smal I +Smal I，1089bp)，泳道4为重组质粒双酶切结果(BamH I +Sac I，1803bp)，泳道6为重组质粒PCR结果(1089bp)，泳道7为重组质粒PCR 结果(714bp)，泳道 8 为 DLlOOOMarker。
[0038]图9为表达载体导入农杆菌的PCR鉴定结果图。
[0039]其中，泳道I为DL2000Marker ;泳道2，5为重组农杆菌PCR结果(1089bp);泳道3，6为重组农杆菌的PCR结果(714bp);泳道4，7为DLlOOOMarker。
[0040]图10为转LAR基因苜蓿愈伤的PCR检测。
[0041]其中泳道1，15为DLlOOOMarker，泳道2为阴性对照，泳道3为水，泳道4为阳性对照，泳道5，6，8，9，11?13为转基因苜蓿愈伤的PCR结果。
[0042]图11为转基因愈伤GFP基因荧光表达。
[0043]图12为载体构建示意图。
【具体实施方式】
[0044]实施例1:
[0045]1、红豆草总RNA的提取:
[0046]针对红豆草富含多酚、多糖及次生代谢物的特点，取甘肃红豆草植株的新鲜幼嫩组织，采用CTAB法制备RNA粗提物，并进一步纯化已提取的RNA，摸索出一种适合红豆草总RNA的提取方法。本方法主要通过在提取缓冲液中加入4% PVP以防止次生代谢物与RNA结合；加入2% β -巯基乙醇以减少多酚物质的干扰；利用水饱和酚:氯仿:异戊醇抽提去除DNA、蛋白及叶绿素、花青素等色素类物质对RNA的干扰，既节约实验成本，又降低RNA降解的几率，提高了 RNA的质量。通过使用LiCl选择性沉淀RNA，使RNA与多糖有效分离。对得到的总RNA粗提物进行纯化，减少了多酚、次生代谢物及色素的干扰，提高了 RNA的浓度和纯度；否则后续反转录扩增严重受到抑制，不能得到目的基因。
[0047]1.1 CTAB 法粗提总 RNA:
[0048](I)取0.1g甘肃红豆草材料在预冷的研钵中，加液氮冷冻研磨成粉末，并转移到
1.5ml的离心管中；
[0049](2)将65 °C预热的提取缓冲液600 μ L [RNA提取缓冲液为2 % CTAB (W/V)、4 %PVP (ff/V) U00mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)、25mmol/LEDTA (pH 8.0)、1.4mol/LNaCl、使用前加Λ2% β-巯基乙醇(W/V)]加入到1.5ml含植物材料的离心管中，剧烈震荡lmin，确保植物材料充分裂解，65°C温浴lOmin，期间震荡2?3次；
[0050](3)于4°C下12000r/min离心1min ;取上清液，加入600 μ L水饱和酸:氯仿:异戊醇(25:24:1)，震荡混匀，-20°C放置 1min ;于 4°C下 12000r/min 离心 1min ；
[0051](4)将上清液转移至另一新的1.5ml离心管中，重复步骤(3) —次；
[0052](5)取上清液，加入1/3体积的10mol/L LiCl混匀后，_20°C放置3h，于4°C下12000r/min 离心 20min ；
[0053](6)弃上清液，沉淀溶解于500 μ L DEPC dH20水中，加入I /10体积的3mo I/LNaAC(pH 5.2)，充分溶解后加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，_70°C处理30min，于4°C下12000r/min离心lOmin，弃上清液；
[0054](7)用 70%的乙醇洗涤一次，4°C下 12000r/min 离心 5min ；
[0055](8)重复步骤(7) —次，尽量吸去残余乙醇；
[0056](9)弃上清液，沉淀于室温下风干后得到RNA的粗提物，加入50 μ L DEPC dH20溶解RNA，于-80°C保存备用。
[0057]1.2 总 RNA 的纯化:
[0058](I)将上述步骤制备的总RNA粗提物2管合并为I管，然后加入900 yL 0.1 % DEPCdH20溶解，加入等体积的水饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24: