μ L，1XBuffer 2.5 μ L，1mmoI/L dNTP 2 μ L，引物卩5和 P 6 (lOpmol/μ L)各 I μ L，5U/μ L Taq 酶 0.5 μ L。扩增参数为:94°C预变性 4min ;94°C变性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，38 个循环；72°C延伸lOmin，最后于4°C保存。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0109]经检测，筛选培养后获得的愈伤组织中大部分为转基因愈伤。如图10所示，选取的10株抗性愈伤中有7株获得了 100bp左右的LAR基因片段。说明转化的目的基因已整合到苜蓿基因组中。
[0110]8、转基因愈伤组织的GFP荧光检测:
[0111]取转基因愈伤组织进行压片。将愈伤置于载玻片中央，滴一滴清水，盖上盖玻片，用铅笔头轻轻敲打。做好压片后，在0LYPUSBX 51/BX 52型荧光显微镜下，用蓝光激发转基因愈伤组织，观察并照相。
[0112]经检测含重组质粒的苜蓿愈伤组织在荧光显微镜下呈现绿色荧光，如图11所示，说明GFP基因在苜蓿愈伤组织中得到了高效表达。
[0113]9、转基因愈伤组织抗除草剂抗性鉴定:
[0114]将转基因愈伤组织接种到含不同浓度(l-5mg/L)PPT的MS培养基上，以组织培养获得的再生植株叶片作抗性筛选对照。观察抗性克隆再生植株对不同浓度PPT的抗性。
[0115]Bar基因既可以作为抗除草剂基因又可以作为标记基因，便于筛选出转化体和非转化体。在转化筛选培养基中加入适量的PPT利于筛选出转基因植株。本研宄发现，转基因愈伤接种到含低浓度PPT (lmg/L、2mg/L)的MS培养基上，对愈伤组织影响比较弱。当PPT浓度为3mg/L时，部分苜蓿愈伤受到抑制，发生褐化。当PPT浓度达到4、5mg/L时，培养20d以后的苜蓿愈伤组织生长受到明显抑制，随着培养时间的延长，褐化严重，愈伤组织生长受到严重抑制，甚至死亡。因此，PPT浓度选择3mg/L。
[0116]10、转基因愈伤组织缩合单宁含量检测:
[0117]采用香草醛-盐酸法测定转基因愈伤组织缩合单宁含量，以未转化的愈伤组织作为对照。
[0118]A)缩合单宁提取:取样品0.5g，液氮研磨成粉末状，加入3mL原花青素提取液(含
0.5%乙酸的70%丙酮(v/v))研磨至勾楽，摇床浸提20min，于5000r/min下离心lOmin，取上清液，沉淀用3mL提取液清洗2次，合并上清液，并定容至1mL ;吸取2mL上清液加入2mL水和2mL三氯甲烷且充分摇匀后于5000r/min下离心1min去除叶绿素(重复三次)；上清液即为可溶性缩合单宁提取液，沉淀物为不溶性缩合单宁。
[0119]B)可溶性缩合单宁的检测:取可溶性缩合单宁提取液0.5mL，加入3mL95%正丁醇-盐酸(95: 5，v/v)，95°C热解Ih，热解溶液室温冷却后检测550nm和600nm吸收值。
[0120]C)不溶性缩合单宁的检测:取沉淀物，加入3mL95%正丁醇-盐酸，95°C热解lh，室温冷却后，5000r/min离心lOmin，检测上清液550nm和600nm吸收值。
[0121]以可溶性缩合单宁与不溶性缩合单宁含量之和计为总缩合单宁。
[0122]含量=(标线值*提取液总体积*稀释倍数)/(鲜重*测定时加样体积*1000)
[0123]结果显示，整合有LAR基因的紫花苜蓿愈伤组织中缩合单宁的含量高于对照22.2%，证明LAR基因的异源表达促进了紫花苜蓿原花青素的积累。进一步证明本试验构建的LAR基因植物表达载体可以用于提高苜蓿CT含量的种质创新研宄。
[0124]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.用于获得一种转基因苜蓿的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为具有绿色荧光蛋白GFP标记基因和抗除草剂bar基因的缩合单宁合成酶LAR基因植物表达载体CPB-LAR-GFPo2.根据权利要求1所述的用于获得一种转基因苜蓿的植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: .1)红豆草无色花青素还原酶LAR基因的克隆: 选择甘肃红豆草叶片提取RNA并纯化RNA，反转录合成cDNA第一链，PCR扩增LAR基因；将回收的扩增产物连接到T载体转化大肠杆菌感受态；挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，测序；将测序结果进行比对分析；确定缩合单宁合成酶LAR基因，得到重组子为:pMD-LAR ； . 2)绿色荧光蛋白GFP基因的亚克隆: 挑取pBI121-Lyz-GFP菌株的单菌落，摇菌、提取质粒，PCR扩增GFP基因，将回收的GFP目的片段与T载体连接后转化大肠杆菌感受态；挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，测序，得到重组子为:pMD-GFP ； . 3)CPB-LAR-GFP植物表达载体的构建及鉴定: 对pMD-GFP进行BamH I和Sma I双酶切，切下GFP基因；对pMD_LAR进行Sma I和Sac I双酶切，切下LAR基因；对载体CPB进行BamH I和Sac I双酶切，通过T4 DNA连接酶将具有粘性末端的载体和基因，16°C过夜连接，连接产物转化感受态E.coli DH5 α，挑选阳性克隆子摇菌，采用插入失活、滞后质粒筛选、质粒PCR扩增，限制酶切图谱鉴定，得到CPB-LAR-GFP植物表达载体。3.获得一种转基因苜蓿的方法，是将权利要求1所述的CPB-LAR-GFP植物表达载体通过农杆菌介导法导入苜蓿中，得到具有抗除草剂性质和缩合单宁含量高的转基因苜蓿。4.根据权利要求3所述的获得一种转基因苜蓿的方法，其特征在于，是采用冻融法将植物表达载体CPB-LAR-GFP转化至根癌农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂布于含卡那霉素、利福平和链霉素的YEB固体培养基上，28°C恒温培养2d，挑取阳性单菌落，进行PCR鉴定。5.根据权利要求4所述的获得一种转基因苜蓿的方法，其特征在于，将重组农杆菌转化紫花苜蓿的具体操作包括以下步骤: a)取含供试质粒CPB-LAR-GFP的农杆菌LBA4404，划线28°C培养2d后，挑取单菌落.28 ℃振荡培养过夜，次日取500 μ L菌液至20 mL的YEB液体培养基中，28 °C，摇菌至OD6cJ直为0.3?0.5的生长对数期，收集菌液，10000 r/min离心2min，弃上清，用MS液体培养基洗涤，10000r/min离心2min，再用MS液体培养基重悬菌体，即为侵染所用菌液，所述YEB液体培养基中含有50 μ g/mL卡那霉素Kan、25 μ g/mL链霉素Str和25 μ g/mL利福平Rif ； b)剪取紫花苜蓿无菌苗的下胚轴，用步骤a)得到的活化农杆菌侵染lOmin，侵染完用无菌水将组织材料清洗干净，用无菌滤纸将水吸干，共培养3d后转入诱导培养基，暗培养.25d后，转入分化培养基，待分化出苗后，再诱导生根、炼苗，进行后续分子检测和生理指标测定。
【专利摘要】本发明公开了获得一种转基因苜蓿的方法及其专用表达载体，植物表达载体为具有绿色荧光蛋白GFP标记基因和抗除草剂bar基因的缩合单宁合成酶LAR基因植物表达载体CPB-LAR-GFP，并提供了其构建方法。本发明的有益效果为：本发明旨在从缩合单宁含量高的植物-红豆草中分离克隆缩合单宁合成酶LAR基因，构建携带绿色荧光蛋白GFP和抗除草剂bar基因的双标记选择植物表达载体CPB-LAR-GFP。通过遗传转化法，将抗除草剂基因和缩合单宁基因同时导入苜蓿，这样既可减少除草剂的使用，减轻大量使用农药对环境造成的污染，又可提高牧草中缩合单宁的含量，最终培育出具有抗除草剂和抗臌胀病优势的牧草新品种。
【IPC分类】C12N15/65, C12N15/82, C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN104911205
【申请号】CN201510284921
【发明人】马晖玲, 陈春艳, 董文科, 牛奎举, 杨江伟
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月28日