台同型号的空气采样仪同时同地采集，所用空气采样仪为青岛崂山应用技术研宄所生产的2050型中流量空气采样仪，该型号空气采样仪配备三种不同颗粒物粒径的切割器，可同时分别采集TSP、PM10、PM2.5空气颗粒物样本，采样之前将切割器和采样滤膜进行高温灭菌，设置采样口距离地面的高度为12米，采样流量为100 L/min，滤膜为圆形普通玻璃纤维滤膜，有效直径为80 mm，采样时间设为连续的24h ;周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本按照采样点分布图采集，以空气采样仪所在位置为中心，如附图2:从内向外半径500m，2km，5km和1km的同心圆上尽量均匀地设置典型区域采样点，各同心圆上设置的采样点个数分别为4、8、16和32个，用灭菌处理的小刷子、无菌刮刀和自封袋采集表层土壤样本、地面灰尘样本和植物叶片表层灰尘样本。
[0014]所述步骤4)为:用Mothur程序分析混合测序文库在1n Torrent、454、Illumina测序平台测序完成的下机数据，利用Silva数据库将空气颗粒物样本微生物DNA序列与区域表层尘土样本微生物DNA序列进行比对注释，并放于同一个文件夹中进行聚类分析，用主坐标分析法PCoA (principal co-ordinate analysis)通过一系列的特征值和特征向量排序后，选择主要特征值，找到距离矩阵中最主要的坐标，绘制出主坐标分析图，观察个体或群体间的差异(如附图3:图中每个点表示一个样本，点之间的距离越近，样本间组成越相似。图3注释:水边植物表层灰尘:E1、E2 ;土壤表层尘土:E3、E4 ;马路边灰尘E5、E6 ；空气颗粒物样本:A17、A18、A19、A2、A3、A4、A5、B1、B12Z、B2、B4、C2、C3、C4。)；根据各样本OTU组成和丰度的差异，利用R软件包计算样品间的相似度，绘制样本相似度树图(如附图4:图中每个分支表示一个样本，分支距离越近，样本间组成越相似。图4中A、B、C类样本为空气颗粒物样本，E类样本为周边表层尘土样本，注释与图3相同。)。
[0015]所述步骤5)为:根据主坐标分析图和样本相似度树图的显示，若周边环境样本与空气颗粒物样本微生物群落的相似度高，即周边环境样本为当地空气颗粒物的潜在主要来源，若周边环境样本与空气颗粒物样本微生物群落差异性高，则认为周边环境样本不是空气颗粒物的主要来源，排查每一个周边环境表层样本，探明区域内潜在的空气颗粒携带微生物的来源，进而判断雾霾的区域性潜在来源。
所述步骤6)为:首先，查询与人体呼吸道疾病与过敏反应有关的常见病原菌和致敏菌，建立空气病原菌和致敏菌的名单；然后，下载Silva数据库，根据病原菌和致敏菌名单简化Silva数据库，建立Silva简化数据库；再利用Silva简化数据库，在步骤2)获得的混合测序文库中挑出病原菌和致敏菌的DNA序列，建立新的混合测序文库；最后，针对新的混合测序文库，重复步骤4)和步骤5)，探明区域内潜在的空气颗粒物携带病原菌和致敏菌的潜在来源。
[0016]以上所述仅为本发明的较佳实施方案，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种空气颗粒物携带微生物的区域源解析方法，其特征在于，它的步骤如下: 1)空气颗粒物样本和区域典型表层尘土样本的采集，于同一采样日分别采集空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本； 2)微生物DNA的提取与高通量测序，提取空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本的微生物DNA，进行DNA质量的检验，测定及检验合格的样本进行相等DNA浓度混合，建立混合测序文库，利用高通量测序技术获得混合测序文库中DNA目的片段序列； 3)样本群落结构分析，将所得DNA目的片段序列与Silva数据库中的已知序列进行比对，鉴定所得样本中微生物的系统分类； 4)主坐标分析与群落相似度分析，利用Mothur程序和R软件包对所得高通量序列进行单个和多个样本间群落相似度的比较分析； 5)空气颗粒物携带微生物潜在区域来源解析，根据空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本的群落相似度分析结果解析区域内潜在的空气微生物来源； 6)致病菌和致敏菌来源解析，将已知的人体呼吸道和人体皮肤接触易感染的病原菌和致敏菌在序列分析中单独列出，重复步骤4)和步骤5)，找出病原菌和致敏菌在区域内的主要潜在来源。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤I)为:选择同一采样日采集空气颗粒物样本和周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本，空气颗粒物样本由三台同型号的空气采样仪同时同地采集，所用空气采样仪为青岛崂山应用技术研宄所生产的2050型中流量空气采样仪，该型号空气采样仪配备三种不同颗粒物粒径的切割器，可同时分别采集TSP、PM10、PM2.5空气颗粒物样本，采样之前将切割器和采样滤膜进行高温灭菌，设置采样口距离地面的高度为12米，采样流量为100 L/min，滤膜为圆形普通玻璃纤维滤膜，有效直径为80 mm，采样时间设为连续的24h ;周边不同区域环境中的表层土壤样本、地面灰尘样本、植物叶片表层灰尘样本按照采样点分布图采集，以空气米样仪所在位置为中心，从内向外半径500m，2km，5km和1km的同心圆上尽量均勾地设置典型区域采样点，各同心圆上设置的采样点个数分别为4、8、16和32个，用灭菌处理的小刷子、无菌刮刀和自封袋采集表层土壤样本、地面灰尘样本和植物叶片表层灰尘样本。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)为:用Mothur程序分析混合测序文库在1n Torrent、454、Illumina测序平台测序完成的下机数据，利用Silva数据库将空气颗粒物样本微生物DNA序列与区域表层尘土样本微生物DNA序列进行比对注释，并放于同一个文件夹中进行聚类分析，用主坐标分析法PCoA通过一系列的特征值和特征向量排序后，选择主要特征值，找到距离矩阵中最主要的坐标，绘制出主坐标分析图，观察个体或群体间的差异，根据各样本OTU组成和丰度的差异，利用R软件包计算样品间的相似度，绘制样本相似度树图。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)为:根据主坐标分析图和样本相似度树图的显示，若周边环境样本与空气颗粒物样本微生物群落的相似度高，即周边环境样本为当地空气颗粒物的潜在主要来源，若周边环境样本与空气颗粒物样本微生物群落差异性高，则认为周边环境样本不是空气颗粒物的主要来源，排查每一个周边环境表层样本，探明区域内潜在的空气颗粒携带微生物的来源，进而判断雾霾的区域性潜在来源。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6)为:首先，查询与人体呼吸道疾病与过敏反应有关的常见病原菌和致敏菌，建立空气病原菌和致敏菌的名单；然后，下载Silva数据库，根据病原菌和致敏菌名单简化Silva数据库，建立Silva简化数据库；再利用Silva简化数据库，在步骤2)获得的混合测序文库中挑出病原菌和致敏菌的DNA序列，建立新的混合测序文库；最后，针对新的混合测序文库，重复步骤4)和步骤5)，探明区域内潜在的空气颗粒物携带病原菌和致敏菌的潜在来源。
【专利摘要】本发明公开了一种空气颗粒物携带微生物的区域源解析方法。它包括以下步骤：1）空气颗粒物样本和区域典型表层尘土样本的采集、2）微生物DNA的提取与高通量测序、3）样本群落结构分析、4）主坐标分析与群落相似度分析、5）空气颗粒物携带微生物整体潜在区域来源解析、6）致病菌和致敏菌来源解析。本发明用于空气颗粒物表面所携带微生物的区域潜在来源的调查，可分析TSP、PM10与PM2.5等多种粒径悬浮颗粒物表面携带微生物的群落与区域周边表层样本微生物群落之间的关系，从微生物群落的角度解析雾霾的来源，为雾霾的防治提供理论指导。空气颗粒物中病原微生物和致敏菌的区域源解析，对人类的健康和卫生防疫工作具有重要的意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104911264
【申请号】CN201510298242
【发明人】胡宝兰, 张旭, 何崭飞, 王家骐, 张昊, 叶天强, 胡勤海, 徐新华, 郑平
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月3日