pore) ;Superdex 纯化柱 (GE health)〇
[0068] I. 2ADAMTS13-MDTCS融合表达质粒的构建
[0069] 构建融合表达质粒引物序列如下：
[0070]
[0071] 备注：
[0072] AH-F CC为引入的保护碱基，划线部分或者aagctt为引入的Hind III酶切位点， 灰色部分为Kozak序列，ATG为起始密码子；
[0073] AH-R CCG为引入的保护碱基,划线部分或者ctcgag为引入的Xho I酶切位点，TCA 为终止密码子；
[0074] LK-F灰色部分为引入的linker序列，划线部分或者
为互补配对区域，为融合PCR做准备；
[0075] LK-R灰色部分为引入的linker序列，划线部分或者
为互补配对区域，为融合PCR做准备；
[0076] AH-F引物序列如序列表SEQ ID NO:3所示；
[0077] AH-R引物序列如序列表SEQ ID NO:4所示；
[0078] LK-F引物序列如序列表SEQ ID NO:5所示；
[0079] LK-R引物序列如序列表SEQ ID NO:6所示；
[0080] 图1表示本发明所需ADAMTS13及其突变体的重组蛋白对应的示意图。
[0081] 1.3PCR扩增融合片段
[0082] 将HSA与基因的PCR产物，按照回收试剂盒推荐方法进行纯化，去除未掺入的 dNTP、引物、模板DNA。取HSA纯化产物1 μ 1 (约IOOng)与ADAMTS13-MDTCS纯化产物 0. 4 μ 1 (约30ng)混合作为模板，50 μ 1反应体系进行PCR，反应条件为：94°C预变性5min ; 94°C变性Imin ;50°C退火Imin ;72°C延伸4min ;-个循环后加入引物LK-F与LK-R各 I ymol/L，继续PCR，反应条件为：94°C预变性5min ;94°C变性Imin ;50°C退火Imin ;72°C延 伸4min ;进行30个循环（见图2)。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
[0083] 1. 4PCR融合片段与pCEP4载体进行连接
[0084] 分别用Hindlll/Xhol进行酶切PCR融合片段与pCEP4载体，切胶纯化后，进行T4 连接酶连接，T0P10转化，挑取单克隆，酶切鉴定，将酶切鉴定正确的克隆质粒，送测序进行 进一步鉴定，将测序结果与SEQ ID: 2序列进行Blast比对，确认克隆质粒中目的序列正确 性，保存含正确质粒的菌株。
[0085] 经过融合片段PCR扩增，载体连接，酶切鉴定与测序分析，获得正确的含目的序列 的克隆质粒，目的序列的鉴定结果如SEQ ID:2序列所示。
[0086] 实施例2ADAMTS13-MDTCS融合蛋白的瞬时表达及蛋白鉴定
[0087] a)接种细胞。转染前一天将细胞接种至IOcm平皿内（尽量不要使用隔两天才长 到90%的细胞，如果生长较慢，请多铺一些细胞）。转染时要求细胞汇合度为90~95% ;
[0088] b)每平皿，700 μ I Opti-MEM Medium 稀释 LIP 2000 50 μ I (LIP 体积不高于总体 积1/10)，室温孵育5min ;
[0089] c)每平皿，680 μ I Opti-MEM Medium稀释DNA 70 μ 1(DNA体积不高于总体积 1/10)；
[0090] d)将稀释好的DNA加入到稀释好的LIP2000中（I: 1混合），室温孵育20min ;
[0091] e)将准备好的IOcm平皿细胞，用3-5ml无菌PBS小心洗涤1次，巴斯吸管轻轻沿 壁加入，以免冲起293F细胞，勿剧烈晃动（使用六孔板和PEI时要加上此步骤）；
[0092] f)将孵育好的DNA+LIP2000混合液，I. 5ml/皿，直接加入有培养液的培养皿（吸 出剩余培养液5ml)中（lip2000组），轻轻混匀；作用4-5h后，吸出混有转染液的培养基， 换IOml无血清293Expression Medium继续培养；培养2-3天后，收集培养基，12000rpm， 30min离心去杂，30KD浓缩管浓缩10倍，PAGE分析表达蛋白，蛋白大小在200KD左右；
[0093] g) PAGE 转膜条件：220mA，3h ;
[0094] h) Western 条件：5 % 脱脂奶粉封闭 Ih ;anti_HSA 单抗或 anti_ADAMTS13 多 抗孵育l_2h ;PBST洗3次，5min/次；二抗孵育1-2h ;PBST洗3次，5min/次；显色 ECL-HRP(Thermo, SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate)。
[0095] 在图3中，构建好的ADAMTS13-MDTCS HSA融合蛋白质粒转入293-F细胞后进行 瞬时表达，收集浓缩后的细胞培养上清，采用SDS-PAGE (图3A)，Western blot (图3B)和 FRETS-VWF73荧光法（图3C)检测融合蛋白表达情况和活性，构建的融合蛋白能在细胞中正 常表达并具有生物学活性。
[0096] 实施例3ADAMTS13-MDTCS HSA融合蛋白稳定表达细胞株的筛选
[0097] a)接种细胞。转染前一天将细胞接种至IOcm平皿内。转染时要求细胞汇合度为 90 ~95% ;
[0098] b)每平皿，700 μ I Opti-MEM Medium 稀释 LIP2000 50 μ I (LIP 体积不高于总体积 1/10)，室温孵育5min ;
[0099] c)每平皿，680 μ I Opti-MEM Medium稀释DNA 70 μ 1(DNA体积不高于总体积 1/10)；
[0100] d)将稀释好的DNA加入到稀释好的LIP2000中（I: 1混合），室温孵育20min ;
[0101] e)将准备好的IOcm平皿细胞，用3-5ml无菌PBS小心洗涤1次，巴斯吸管轻轻沿 壁加入，以免冲起293F细胞，勿剧烈晃动；
[0102] f)将孵育好的DNA+LIP2000混合液，I. 5ml/皿，直接加入有培养液的培养皿（吸 出剩余培养液5ml)中（LIP 2000组），轻轻混匀；
[0103] g)作用4-5h后，吸出混有转染液的培养基，换IOml无血清293Expression Medium 继续培养；
[0104] h)细胞转染24h后按1:10传代，并更换Hygromycin筛选培养基。针对HEK293细 胞，选用浓度为200 μ g/mL的Hygromycin培养基来筛选细胞。筛选过程需持续1至2周， 其中每天更新筛选培养基，将伴有大片的死亡细胞脱落；
[0105] i)挑取单克隆细胞：在用Hygromycin培养基筛选细胞的24孔板中，吸去培养基， 用PBS缓冲液冲洗，之后用0. 25%的胰酶消化。可以在倒置显微镜下直接挑取细胞单克隆。 将单克隆转移至新24孔板中；
[0106] j)挑取后的细胞单克隆可以用低浓度的Hygromycin培养基（100 μ g/ml)维持生 长。
[0107] 实施例4ADAMTS13-MDTCS融合蛋白的表达
[0108] &)复苏40八10^13-]\?1^-批4稳定表达细胞系，10〇11平皿/管，？85洗1次，8%卩83 1640完全培养基IOml培养细胞；
[0109] b)第二天观察细胞，根据细胞生长情况，换液或传代；
[0110] c) 5平皿（IOcm)细胞收集，PBS洗1次，293无血清表达培养基100mL重悬，转移 至250ml培养瓶中，120rpm，37度培养过夜；
[0111] d)约24h后，lOOOrpm，5min，收集上清，细胞100mL 293无血清表达培养基重悬， 继续培养，根据细胞生长状况，可以连续收集5天；
[0112] e)将收集的血清转移至50mlEP管中，llOOOrpm，25min，离心去除细胞残片；
[0113] f)将上清转移至30KD的超滤管中，3000rpm，20min离心浓缩，并置为 Tris-buffer(20mM)；
[0114] g)迅速转移至-80度保存，待稳定表达收集完毕后，进行第一步Q-HP纯化；
[0115] h)PAGE鉴定纯化峰，并超滤管浓缩置换Tris-buffer (20mM)进行下一步分子筛纯 化；
[0116] i)分子筛纯化PAGE鉴定纯化峰；
[0117] j)超滤管浓缩并置换为PBS-buffer，-80度保存或冻干保存。
[0118] ADAMTS13-MDTCS HSA各取10 μ L上清应用Western blot检测蛋白表达情况。结 果表明突变体的蛋白稳定表达，但每一次收集后需要马上-80度存放，否者蛋白在培养基 中容易降解。
[0119] 实施例5ADAMTS13-MDTCS融合蛋白的纯化
[0120] a)将收集到的无血清细胞表达培养上清，20000-30000g离心30-60min去除细胞 碎片等颗粒杂质；
[0121] b)将细胞培养上清转移至15ml超滤管中（30kD)，4000g，20min/次，进行离心浓 缩，并用20mM Tris-buffer进行置换；
[0122] c)打开AKTA-purifier-900系统，装好阴离子交换柱Q-HP ;
[0123] d)将浓缩置换后的样品先稀释至50ml，通过Load模式上样，进行第一步的纯化；
[0124] e)采用 80 % A 溶液（20mM Tris-bis, PH8. 0)+20 % B 溶液（20mM Tris-bis, IM NaCl, PH8. 0)洗涤杂蛋白，采用 50 % A 溶液（20mM Tris-bis, PH8. 0)+50 % B 溶液（20mM Tris-bis，IM NaCl，PH8.0)洗脱目的蛋白，收集并浓缩目的蛋白；
[0125] f)打开AKTA-purifier-900系统，装好凝胶过滤层析柱Surperdex 200 10/300GL ；
[0126] g)将浓缩后的样品500ul注入上样环中（500ul或者Iml)，通过inject模式进行 上样，进行第二步的纯化；
[0127] h)用20mM Tris-buffer进行