一种具有fshr靶向性的肿瘤治疗多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及一种具有FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽及其应用。 技术背景
[0002] 卵泡刺激素受体（FSHR)是潜在的前列腺癌靶向标志物。FSHR是一种由寡聚糖 蛋白构成的膜受体，属G蛋白偶联受体家族。FSHR主要存在于人和动物睾丸的支持细胞、 卵巢颗粒细胞，通过介导卵泡刺激素（FSH)的信号影响雄性青春期生精的启动、成年期生 精过程的维持及雌性卵细胞各阶段的发育。2010年《新英格兰医学杂志》（Radu A，Pichon C, CamparoP, et al. Expression of follicle-stimulating hormone receptor in tumor blood vessels. N Engl J Med. 20100ct 21 ;363 (17) :1621-30.)报道对 1336 例不同的 肿瘤标本进行免疫组化、原位杂交等研宄，发现FSHR在前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺 癌、睾丸癌等多种癌组织的血管内皮细胞中高表达，因此肿瘤血管内皮FSHR的表达可能 有助于肿瘤新生血管的形成D 2013年《BMC Cancer》（Siraj A，Desestret V，Antoine M, Fromont G, Huerre M, Sanson Μ, Camparo Ρ, Pichon C, Planeix F, Gonin J, Radu A, Ghinea Ν. Expression of follicle-stimulating hormone receptor by the vascular endothelium in tumor metastases, BMC Cancer. 2013 ;13:246.)报道对包括前列腺癌在 内的6类肿瘤在主要器官如骨、肝、淋巴结、脑和肺等的转移灶进行免疫组化分析，发现上 述肿瘤转移灶中FSHR高度表达，而毗邻的正常器官无显著表达。提示，FSHR是前列腺癌转 移灶界定的靶向标志物之一。除此之外，FSHR也在人卵巢癌Caov-3、0VCAR-3，人前列腺PC3 等癌细胞中组成性表达。进一步研宄发现将卵巢表面上皮细胞（OSE)转染FSHR质粒并过 表达后，细胞的EGFR、HER-2/neu和c-Myc等蛋白表达上升，ERK1/2则持续磷酸化，细胞增 殖速度加快，这些现象与卵巢癌细胞0VCAR-3细胞内情况相一致。推测过表达FSHR可能与 肿瘤发生前卵巢上皮细胞的增殖和致癌途径水平的提高相关。研宄还发现FSH/FSHR可通 过调节经典的PI3K/Akt信号通路中的NF- κ B的活性来增强卵巢癌细胞系3A0的增殖和侵 袭能力。因此，FSHR与肿瘤的生长、转移、侵袭等息息相关，是一重要的研宄、治疗靶点。
[0003] 卵泡刺激素（FSH)是FSHR内源性配体，由α和β两条亚基组成。研宄表明人 FSH0链上33-53片段，81-95片段等均可与FSHR相结合，而其中FSH33_53(Tyr-Thr-Arg-As p-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pr〇-Ala-Arg-Pr〇-Lys-Ile-Gln-Lys-Thr-Cys-Thr-Phe)与 FSHR 的亲和力最强，可作为拮抗剂竞争FSH与FSHR的结合。徐宇平等对FSH33_53进行 18F标记，制 成18F-A1-N0TA-MAL-FSH33_5^功用于FSHR高表达的人前列腺癌荷瘤裸鼠显像，为临床前列 腺癌的特异性诊断提供了基础。也有研宄通过纳米颗粒连接？5成3_53与紫杉醇（PTX)，构建 了 FSH33_53-NP-PTX复合物，提高了 PTX对肿瘤细胞CA0V-3的靶向、治疗能力。可见，FSH33_53可作为FSHR的靶向载体，有益于FSHR高表达肿瘤的诊断及治疗。
[0004] 多肽 G (IIKK) ηΙ-ΝΗ2 (η = 1-4)，Gly-(Ile-Ile-Lys-Lys) n-Ile-NH2 (η = 1-4)，是 一类具有简单重复序列并包含α-螺旋结构的阳离子抗菌肽。随着IIKK序列重复次数的 增加，能够通过与两性分子膜的连接，增强多肽IIKK的α-螺旋，使多肽结构趋于稳定。此 外，在多肽羟基端增加异亮氨酸（lie)能够进一步促进维持二级结构的能力，稳固多肽分 子结构，引发并协调功能的发挥。经对比研宄，发现G(IIKK)3I-NH2(IIKK)具有最佳的链长、 抗肿瘤效果，结构简单，毒副作用小，抗肿瘤活性强，亦是理想的靶向肿瘤抑制药物。IIKK通 过静电与疏水作用与肿瘤细胞膜结合，以膜透化方式进入并积累于肿瘤细胞，最终通过调 控凋亡通路或细胞坏死来抑制肿瘤细胞生长。IIKK体内外良好的抗肿瘤性能显示了其在临 床开发应用中的巨大潜力。现有技术中缺少兼具FSHR靶向和更强抗肿瘤功能的融合多肽 蛋白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于为了解决现有技术中缺少兼具FSHR靶向和更强抗肿瘤功能的 融合多肽蛋白。基于功能多肽联合应用的思路，设计了 fsh33_53-iikk及iikk-fsh33_53靶向 融合多肽，具有FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽，所述多肽具有增强IIKK多肽的抗肿瘤活性， 其氨基酸序列选自下述（a)_ (c):
[0006] (a)、其序列为α亚单位和β亚单位构成，其中α亚单位为能与FSHR相结合的 亲合片段，β亚单位为具有简单重复序列并包含α-螺旋结构的阳离子抗菌肽，
[0007] 所述的亲合片段包括FSH β链上33-53片段或81-95片段，
[0008] 所述的阳离子抗菌肽包括 G (IIKK) 111-順2或 Gly-(Ile-Ile-Lys-Lys) n-Ile-NH 2， 其中η = 1-4 ;
[0009] (b)、所述FSHR靶向性的肿瘤治疗多肽为FSH33_53-IIKK靶向融合多肽
[0010] Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-Ala-Arg-Pro-Lys-Ile-Gln-Lys -Thr-Cys-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-L ys_Ile_NH2，以及 Gly-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Gly-Gl y-Gly-Tyr-Thr-Arg-Asp-Leu-Val-Tyr-Lys-Asp-Pr〇-Ala-Arg-Pr〇-Lys-IIe-Gln-Lys-Thr -Cys-Thr-Phe ；
[0011] (C)、所述序列为在（a)、（b)所示的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1-10个氨基 酸而得到的，且具有增强IIKK多肽的抗肿瘤活性的氨基酸序列。
[0012] 所述重组融合多肽还包括，含有fsh33_53-iikk靶向融合多肽、或其不丧失生物活性 的片段、变体或衍生物。
[0013] 本发明还在于：提供了一种编码权所述fsh33_53-iikk靶向融合多肽的多核苷酸。
[0014] 所述的多核苷酸还包括其不丧失生物活性的片段、变体或衍生物。
[0015] 本发明还在于：提供了一种药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤，包含所述 FSH33_53_IIKK靶向融合多肽。所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体或所述组合物 是冻干形式、单位剂型、固体剂型、液体形式。
[0016] 本发明还在于：提供了通过调控凋亡通路或细胞坏死抑制肿瘤细胞生长的表达的 方法，所述方法包括下述步骤：
[0017] a)提供上述定义的核酸序列、多肽或组合物，
[0018] b)将所述核酸序列、多肽或组合物应用于或施用至野生肿瘤细胞的表达系统、细 胞、组织或生物体。
[0019] 本发明还在于：提供了将所述的fsh33_53-iikk靶向融合多肽、多核苷酸在制备治 疗或预防肿瘤药物中的应用。
[0020] 将所述的fsh33_53-iikk靶向融合多肽、所述的多核苷酸在制备治疗或预防生殖系 统肿瘤、头颈部癌及肺癌、恶性淋巴瘤药物中的应用。
[0021] 将所述的fsh33_53-iikk靶向融合多肽、所述的多核苷酸在制备治疗或预防前列腺 癌药物中的应用。
[0022] 通过构建多肽FSH33_53介导的FSHR靶向诊断和治疗的系统并融合抗肿瘤多肽 IIKK，期望能够将FSH33_53-IIKK应用于FSHR高表达肿瘤的治疗，改善治疗现状。
[0023] 通过Western Blot检验FSHR在几种细胞中的表达，其中，L929细胞FSHR阴性表 达。MTT法可检测药物对细胞抑制增殖的作用。采用该方法检测FSH33_53-IIKK在不同浓度 下对？03、他1&、51(0￥3、1〇^7、1^929、293细胞的抑制作用，并与111?、顺铂的肿瘤细胞抑制率 进行比较。结果显示，FSH33_53-IIKK与IIKK对肿瘤细胞有较强的抑制作用，两者对肿瘤细 胞的IC5tl接近，且呈明显量效关系。而两种多肽对正常组织细胞的抑制作用明显减弱。相 比之下，顺铂对肿瘤细胞的抑制作用相对降低，特别是在PC3细胞的抑制率，在50 μ M浓度 下仅达到（48. 13±3. 89) %，与FSH33_53-IIKK的细胞抑制率（96. 94±3. 45) %相比差异显著 (P > 0. 05)。而相同浓度的多肽与顺铂作用于正常组织细胞，顺铂对细胞的毒性作用明显 增强。
[0024] 肿瘤发生的主要特征为细胞生长和增殖失控。细胞在增殖、分化、凋亡等方面的异 常都参与了肿瘤的发生和发展。常见的抗肿瘤作用机理的研宄有：药物对细胞周期的影响； 药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用；药物诱导细胞自噬的作用；药物对细胞DNA的影响（包 括与DNA结合能力的检测、药物造成DNA损伤、药物对细胞核酸代谢的影响）等。文献报道 IIKK能够通过改变细胞骨架结构、降低线粒体膜电位、促进细胞色素 C的释放以及激活Fas 通路诱导细胞凋亡。本发明从多肽对细胞周期分布的影响、细胞凋亡信号的转导及自噬体 标记蛋白LC3的变化三个方面对融合肽FSH33_53-IIKK的抗肿瘤机制进行初步探讨。
[0025] 通过流式细胞仪检测分析多肽对细胞周期调节及凋亡的影响。结果显示，不同浓 度多肽作用于PC3细胞24h后，细胞的G0/G1、S、G2/M周期分布差异不显著（P > 0. 05)，即 FSH33_53-IIKK对PC3细胞的周期无明显影响。利用Hoechst 33258染色法考察FSH33_53-IIKK 对PC3细胞凋亡的影响，从形态学上验证了多肽能够诱导PC3细胞凋亡。FSH33_53-IIKK通 过诱导细胞凋亡发挥肿瘤抑制功能。细胞凋亡是由基因调控的细胞自主死亡的过程，是自 体损伤的一种现象。癌症的发生及耐药性的产生与细胞出现凋亡抑制密切相关。Hoechst 33258染色法中7. 5 μ M、15 μ Μ、30 μ M的FSH33_53-IIKK能够诱导PC3细胞出现典型的凋亡特 征，如细胞体积缩小，核质浓缩，呈现不规则的核裂解等，并且呈明显的浓度依赖性。相同浓 度梯度下用流式细胞仪检测融合肽和多肽IIKK诱导细胞凋亡的凋亡率。FSH33_53-IIKK作用 于PC3细胞的凋亡率高于IIKK相应浓度下的细胞凋亡率，并且30 μ M浓度的FSH33_53-IIKK 对PC3细胞的凋亡率显著高于IIKK(