P < 0. 05)。以上证明，FSH33_53-IIKK能够诱导PC3细 胞凋亡，并且其诱导细胞凋亡的趋势优于IIKK。
[0026] 细胞凋亡的发生和发展涉及一系列基因的激活、表达和调控。其主要途径可分为： 死亡受体介导途径、内质网介导途径、线粒体介导途径。内源性的线粒体凋亡途径是细胞受 到内部或者外部的刺激，线粒体的外膜通透性改变，向胞质基质释放相关的凋亡因子，引发 凋亡的发生。
[0027] Bcl-2家族蛋白在线粒体参与的细胞凋亡途径中起重要的调控作用，能促进或干 扰细胞色素 C的释放来调控细胞的凋亡。目前已知的Bcl-2同源蛋白大概有20余种，根 据其结构和功能的不同可分为两大类：促凋亡蛋白Bax、Bad和Bak等；抗凋亡蛋白Bcl-2、 Mcl-I和Bcl-xl等。Bcl-2干扰细胞色素 C的释放，阻断上游Caspase蛋白的激活，保护细 胞不发生凋亡；而Bax/Bad促进细胞色素 C释放，诱导细胞凋亡。
[0028] 半脫氨酸天冬氨酸酶（cysteine aspartic specific protease, Caspase)家族 是一组存在于胞浆中的天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，能够选择性切割某些蛋白 质，激活靶蛋白或使之失活，是哺乳动物细胞凋亡的启动者和执行者。在细胞凋亡过程中， 有多种Caspase共同参与。在正常情况下，Caspase以无活性的前体形式合成与IC存，而凋 亡信号可激活Caspase级联反应。其中，Caspase-8, Caspase-9位于联级反应上游，是主 要的凋亡启动者；Caspase-3等位于联级反应的下游，是凋亡的执行者。在Fas或TNF诱导 的凋亡中，Caspase-8是凋亡的"发起者"。Caspase-8收到凋亡信号后，通过自剪切的形式 激活，直接或间接激活下游的效应分子Caspase-3等，而激活的Caspase-3等分解Lamins、 PARP(poly ADP-ribose polymeras)等，激活核酸内切酶，导致 DNA 片段化。Caspase-3 的 激活是凋亡下游信号传导的关键。
[0029] 利用Western Blot法检测了 FSH33_53-IIKK作用PC3细胞24h后，凋亡相关蛋白 Procaspase-8、Procaspase-3、Bcl_2、Bad、Bax 的表达水平。结果表明，Procaspase-8、 Procaspase-3、Bcl_2蛋白表达降低，Bad蛋白表达不变，Bax/Bcl-2增加。说明FSH33_ 53_IIKK 作用于细胞后，通过线粒体凋亡通路降低Bcl-2的表达，抑制细胞色素 C的释放，进而激活 PC3细胞中的Caspase级联反应，活化了 Caspase-8和Caspase-3,引起细胞凋亡，与IIKK 诱导细胞凋亡机理一致。
[0030] 细胞自噬（Autophagy)是细胞应对外界环境变化的一种反应，对细胞自身维持代 谢平衡及细胞内环境稳定起到重要作用。细胞自噬一方面可以为肿瘤提供丰富的营养，促 进肿瘤生长；另一方面，细胞自噬可以对抗细胞的癌变。因此，在肿瘤发生发展的过程中，细 胞自噬的作用具有两面性。大多数研宄者认为，细胞自噬在对抗肿瘤生成的过程中同样扮 演重要角色。
[0031] 采用AO染色法从细胞形态学检测细胞自噬。PC3细胞经0、7. 5、15、30 μΜ浓度的 FSH33_53-IIKK处理后，荧光显微镜下可观察到，随着药物浓度的增加，出现自噬体结构的细 胞增多，且荧光增强。表明多肽FSH33_53-IIKK亦可诱导细胞发生自噬。
[0032] 细胞发生自噬的过程由一系列自噬相关蛋白（Atg蛋白）介导完成。微管相关蛋 白质 1 轻链 3(Microtubule_associated protein I light chain 3，LC3)的转变是自发 生的标志。LC3蛋白可被Atg4蛋白酶切割变成LC3- I，当自噬体形成后，LC3- I和磷脂酰 乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE)偶联形成LC3- II。LC3- II可稳定地保留在自· 体膜上直到与溶酶体融合，因此可被用来作为自噬体的标记。
[0033] 利用 Western Blot 检测在 FSH33_53-IIKK 作用下 PC3 细胞中 LC3- I 和 LC3- II 蛋 白表达水平的变化，以此来反应自噬体的数量。实验结果表明，PC3细胞经药物处理后，随 着药物浓度的增加，LC3- I的表达减少，而LC3- II蛋白表达水平在低浓度药物下呈现增加 趋势，在高浓度药物作用下又降低。说明FSH33_53-IIKK在适当浓度范围内能一定程度的诱 导细胞发生自噬，而在高浓度多肽作用下通过其他途径抑制肿瘤细胞增殖。
[0034] 考虑到体外难以模拟体内复杂的生化环境，多肽对实体瘤的作用受到多重因素的 影响，如在体内易被多种酶降解，肿瘤内部供血不足造成的酸性环境影响多肽的性能等，所 以需要建立体内抗肿瘤模型考察多肽在实体瘤的靶向及治疗作用的发挥。采用皮下细胞移 植法建立PC3肿瘤模型，成瘤率达到95%，在裸鼠体内生长状况良好。
[0035] 在验证FSH33_53_IIKK体内抑制肿瘤作用实验中，设计了生理盐水阴性对照组、 IIKK(5mg/Kg)实验组、FSH33_53-IIKK(5mg/Kg、10mg/Kg)实验组、顺铂（3mg/Kg)阳性对照 组，通过比较FSH33_53-IIKK、顺铂等治疗药物对PC3肿瘤的抑制率及对裸鼠体重变化的影响 来考察多肽在体内的抑制肿瘤增殖的性能。顺铂（DDP)是重金属络合物，属于广谱的细胞 周期非特异性抗肿瘤药物。DDP可抑制肿瘤细胞DNA复制过程，破坏细胞膜结构，阻止肿瘤 细胞增殖，是目前临床治疗恶性肿瘤常用的化学药物，多用于生殖系统肿瘤、头颈部癌及肺 癌、恶性淋巴瘤等多种恶性肿瘤的治疗。但DDP在杀伤肿瘤细胞的同时，也能产生较大的毒 副作用，并产生耐药性。而前列腺癌细胞对顺铂敏感性差，限制了其在前列腺癌治疗中的应 用。查阅文献得知，顺钼的最大耐受剂量为9mg/kg，每6天一次给药。以顺钼3mg/kg，每周 3次给药作为阳性对照组与FSH33_53-IIKK的抑瘤作用进行比较。实验结果显示，相同浓度的 FSH33_53-IIKK表现出比IIKK更高的平均肿瘤抑制率，FSH33_ 53-IIKK 10mg/kg实验组与顺铂 组的平均肿瘤抑制率相近，而FSH33_53-IIKK对肿瘤鼠体重的影响显著低于顺铂组，说明多肽 的毒副作用小。
[0036] 发明的有益效果：
[0037] FSH33_53-IIKK与IIKK对肿瘤细胞有较强的抑制作用，两者对肿瘤细胞的1。 50接 近，且呈明显量效关系；fsh33_53-iikk作用于PC3细胞的凋亡率高于IIKK相应浓度下的细 胞凋亡率，fsh33_53-iikk能够诱导PC3细胞凋亡，并且其诱导细胞凋亡的趋势优于IIKK ; FSH33_53-IIKK作用于细胞后，通过线粒体凋亡通路降低Bcl-2的表达，抑制细胞色素 C的释 放，进而激活PC3细胞中的Caspase级联反应，活化了 Caspase-8和Caspase-3,引起细胞凋 亡；FSH33_53-IIKK表现出比IIKK更高的平均肿瘤抑制率，10mg/kgFSH 33_53-IIKK与顺铂表现 出相近的肿瘤抑制作用，但FSH33_53-IIKK对肿瘤鼠体重的影响明显低于顺铂组，说明多肽的 毒副作用小。
【附图说明】：
[0038] 以下将结合附图和具体实例对本发明进行进一步的阐述。
[0039] 图 1、Western blot 检测 FSHR 在 MCF7、Hela、PC3、293、SK0V3、L929 细胞中的表 达。
[0040] 图2、FSH33-53-IIKK、IIKK和顺铂对细胞的增殖抑制作用。
[0041] 图3、不同浓度FSH33-53-IIKK作用下PC3细胞周期拟合图及统计结果。
[0042] Α:0μΜ;Β:7·5μΜ;(：:15μΜ;0:30μΜ;Ε:细胞周期统计结果（P >0.05)
[0043] 图4、FSH33-53-IIKK作用于PC3细胞24h，Hoechst 33258染色观察诱导细胞凋亡 作用。
[0044] Α:0μΜ;Β:7·5μΜ FSH33_53-IIKK;C:15yM FSH33_53-IIKK;D:30yM FSH33_53-IIKK
[0045] 图 5、Annexin V-FITC/PI 双染法检测 FSH33-53-IIKK 与 IIKK 对 PC3 细胞的诱导 凋亡作用。
[0046] Α:0μΜ;Β:7·5μΜ FSH33_53-IIKK;C:15yM FSH33_53-IIKK;D:30yM FSH33_53-IIKK
[0047] Ε:7.5μΜ IIKK；F:15yM IIKK；G:30yM IIKK
[0048] 图6、FSH33-53-IIKK对PC3细胞凋亡相关蛋白表达的影响。
[0049] 图7、FSH33-53-IIKK作用于PC3细胞24h，AO染色观察诱导细胞自噬作用。
[0050] Α:0μΜ;Β:7·5μΜ FSH33_53-IIKK;C:15yM FSH33_53-IIKK;D:30yM FSH33_53-IIKK
[0051] 图 8、FSH33-53-IIKK 对 PC3 细胞 LC3- I、ΙΧ3-Π 蛋白表达的影响。
[0052] 图9、FSH33-53-IIKK对PC3裸鼠移植瘤模型肿瘤生长曲线的影响。
[0053] 图10、给药21天后，各实验组荷瘤鼠体重变化及肿瘤体积对比图。
【具体实施方式】：
[0054] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0055] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0056] 实施例1
[0057] Western Blot检测FSHR在几种细胞中的表达
[0058] 人前列腺癌细胞株PC3、人宫颈癌细胞株Hela、人卵巢癌细胞株SK0V3、人乳腺癌 细胞株MCF7、人胚肾细胞293、小鼠成纤维细胞L929,购自中科院上海细胞库。
[0059] 雄性BALB/c-nu裸鼠，体重18~19g，江苏常州卡文斯实验动物有限公司，SPF级， 鼠龄5周。合格证号：N0.00 26328,许可证号：SCXK(苏）2011-0003。
[0060] 实验所用 PC3、MCF7、Hela、PC3、293、SK0V3、L929 等细胞培养方法一致，在 37°C、 5%0)2的恒温培养箱中培养传代，用含10%胎牛血清及10(^/1111青霉素、10(^/1111链霉素 的DMEM培养基培养。
[0061] 收集细胞，用含蛋白酶抑制剂的RIPA试剂，按照常规方法提取细胞蛋白并用BCA 蛋白