专利名称：提高药物/基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高药物/基因靶向性和转染效率的多肽载体及用途。
背景技术：
近年来，恶性肿瘤已经成为最常见的发病和死亡原因之一，全世界每年新增病例 1000多万，最新的世界卫生组织报告称其中20%发生在中国。传统的抗癌化疗药物缺乏靶向性，在杀死癌细胞的同时也导致正常细胞死亡，毒副作用大，使患者的生存质量严重下降。因此研制高效且具有靶向性的基因/药物载体在恶性肿瘤的治疗中有着至关重要的作用。细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides, CPPs)是一类具有细胞穿透功能的短肽(少于30个氨基酸)，能够有效地将蛋白质、多肽、核酸片段等以多种方式导入多种哺乳动物细胞，其转导效率高且不会造成细胞损伤，是一种良好的基因/药物载体。其中， MPGp (由M. C. Morris, P. vidal, G. Divita最先公开发表，并以三人名字的首字母命名的多肽)就是一种高效安全的细胞穿膜肽，它由人自身免疫缺陷病毒1型(HIV-I)的gp41蛋白的融合蛋白结构域和猿猴空泡病毒(simian vacuolating virus 40，SV40)大T抗原的核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)区域组成。MPGp含有较多的碱性氨基酸， 可与带负电荷的DNA或RNA通过静电作用形成纳米级颗粒，并保护其免受核酸酶的降解。 MPGΔNLSp通过将MPGp的NLS区域中一个氨基酸进行突变(序列为GALFLGFLGAAGSTMGAWSQ PKSKRKV)，从而使其携带的DNA或RNA在细胞质中大量释放，因此适合作为siRNA递送载体。由于MPGAMp为直接穿膜进入细胞而非依赖受体，因此缺乏组织细胞靶向性。提高载体肿瘤靶向性的主要策略是用对肿瘤细胞具有特异性识别的分子对载体进行修饰，使其对肿瘤细胞具有更高的选择性并借此提高肿瘤细胞对基因/药物的摄入。研究发现，促黄体生成素释放激素受体(luteinizing hormone-releasing hormone receptor, LHRHR)在肝癌及多数性激素依赖肿瘤如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等细胞膜上过量表达，明显高于在相应组织正常细胞膜上的表达，且在正常的肝、肾、脾、心、肺、脑、胸腺和骨骼肌组织的细胞膜上未有可检测到的表达。促黄体生成素释放激素(LHRHp)是由10 个氨基酸组成的短肽(序列EHWSYGLRPG)。已有体外细胞实验证明，LHRHp修饰可明显提高所载药物对乳腺癌、卵巢癌细胞的靶向性。鉴于以上讨论的问题，期望提供一种针对肿瘤的具有靶向性且高效的载体。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的基因/药物载体靶向性差及转染效率低的难题，提供一种提高药物/基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体。本发明的第二个目的是提供一种提高药物/基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体的用途。
本发明的技术方案概述如下一种提高药物/基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体，所述多肽载体具有式 ⑴的结构LHRHP-MPG^lsP (I)所述多肽载体的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 3所示。所述LHRHp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 1所示；所述MPG"NLSp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 2所示。上述多肽载体的用途。与现有技术相比，本发明的优点如下本发明涉及的一种提高药物/基因的靶向性和转染效率的多肽载体，其带有大量的正电荷，具有良好的水溶性，具有很强的针对性激素依赖性肿瘤及肝癌的靶向性，可直接携带带负电荷的核酸或药物并介导其进入细胞，也可修饰其它基因或药物载体提高其肿瘤靶向性和转染效率。为基因/药物输送提供了一种新型载体。
图1.多肽载siRNA复合物粒径变化情况。图2.细胞转染siRNA48小时后进行RT-PCR后琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种提高药物/基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体，所述多肽载体具有式 ⑴的结构LHRHp-MPG^LSp (I)所述多肽载体的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 3所示。SEQ ID NO. 3N 端-Gly-Arg-Leu-Trp (D型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly -Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-L ys-Val ；所述LHRHp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 1所示；所述MPG"NLSp的氨基酸序列是序列表SEQ ID N0. 2所示。SEQ ID N0. 2N 端-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-Lys-ValSEQ ID N0. 3N 端-Gly-Arg-Leu-Trp (D型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly -Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-L ys-Val ；
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实施例2LHRHp-MPGΔNLSp载siRNA纳米粒子的制备及稳定性测定将多肽载体(LHRHp-MPGAmsp)和siRNA分别溶于水中制得水溶液，然后分别将两种水溶液于37°C水浴10分钟；按LHRHp-MPGAMp中的氨基所带正电荷与siRNA中的磷酸根所带的负电荷的摩尔比分别为20 1、15 1和10 1将两种溶液混勻并漩涡震荡50 秒，即得LHRHp-MPGAasp载siRNA纳米粒子。图1为pH = 7. 0时不同N/P的LHRH-MPGΔasP载siRNA形成的纳米复合物的粒径检测，其中代表按LHRHp-MPG"asP中氨基所带的正电荷与siRNA中磷酸根所带的负电荷的摩尔比为20 1混合后形成的纳米复合物；代表按LHRHp-MPGAmp中氨基所带的正电荷与siRNA中磷酸根所带的负电荷的摩尔比为15 1混合后形成的纳米复合物；j代表按LHRHp-MPGgSp中氨基所带的正电荷与siRNA中磷酸根所带的负电荷的摩尔比为10 1混合后形成的纳米复合物。实验表明LHRHp-MPGAMp中的氨基所带正电荷与siRNA中的磷酸根所带的负电荷的摩尔比可以在2 1 20 1中选择；震荡时间可以在40 60秒中选择，得到的LHRHp-MPG"msP载siRNA纳米粒子，其平均粒径约为80 llOnm。实施例3LHRHp-MPG"NLSp载siRNA纳米粒子的细胞转染实验按照实施例2的LHRHp-MPGAasp载siRNA纳米粒子的制备方法，制备 LHRHp-MPG"nlsp载针对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的SiRNA的纳米粒子；以上述siRNA含量为30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L或200nmol/L的纳米粒子分别转染人肝癌细胞HepG2 和人正常肝细胞L02，阴性对照为单纯的200nmol/L的针对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的 siRNA，空白对照中只加入培养基而不加入任何纳米粒子或多肽或siRNA，阳性对照为脂质体(Iipo)载浓度为200nmol/L针对人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因siRNA。转染48小时后提 ^(Mft^fflIfiW^RNAii^fRT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)。结果如图2所示，图2A为LHRHp-MPGAasp载针对人甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因的 siRNA纳米粒子转染人正常肝细胞48小时后，进行RT-PCR的电泳结果图，其中1为阳性对照组；2为含siRNA 200nmol/L的纳米粒子转染组；3为含siRNA IOOnmol/L的纳米粒子转染组；4为含siRNA 50nmol/L的纳米粒子转染组；5为含siRNA 30nmol/L的纳米粒子转染组；6阴性对照组；7为空白对照组。图2B为LHRHp-MPGAWp载针对人甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因的siRNA纳米粒子转染人肝癌细胞48小时后，进行RT-PCR的电泳结果图，其中8为阳性对照组；9为含siRNA 200nmol/L的纳米粒子转染组；10为含siRNA IOOnmol/L的纳米粒子转染组；11为含siRNA 50nmol/L的纳米粒子转染组；12为含siRNA 30nmol/L的纳米粒子转染组；13阴性对照组； 14为空白对照组。用天能图像处理软件测定图2中各个条带的净光值，即亮度，反应该条带经 RT-PCR后的基因表达量的多少。将上述各实验组的净光值与空白对照的净光值分别进行除法计算得到百分数值(表1所示)，即得到该实验组相对于空白组的基因表达的多少，可反映转染进入细胞的siRNA数量进入细胞的siRNA越多，相应基因沉默的数量越多，表达的量越少，该比值越低。表 权利要求
1.一种提高药物/基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体，其特征是所述多肽载体具有式⑴的结构LHRHp-MPG^LSp (I)所述多肽载体的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 3所示。
2.根据权利要求1所述的多肽载体，其特征是所述LHRHp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 1所示；所述MPG"NLSp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.权利要求1或2所述多肽载体的用途。
全文摘要
本发明公开了一种提高药物/基因肿瘤靶向性和转染效率的多肽载体，所述多肽载体具有式(I)的结构LHRHp-MPGΔNLSp(I)所述多肽载体的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO.3所示。本发明的多肽载体，其带有大量的正电荷，具有良好的水溶性，具有很强的针对性激素依赖性肿瘤及肝癌的靶向性，可直接携带带负电荷的核酸或药物并介导其进入细胞，也可修饰其它基因或药物载体提高其肿瘤靶向性和转染效率。为基因/药物输送提供了一种新型载体。
文档编号C12N15/87GK102558363SQ20121004718
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者冷希岗, 刘兰霞, 宋丽萍, 张海玲, 朱敦皖, 朱琳, 董霞 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所