凋亡素组合肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的凋亡素组合肽及其应用，属于多肽药物领域。
【背景技术】
[0002] 凋亡素是鸡贫血病毒的致病蛋白，由121个氨基酸组成，分子量14KD。凋亡素通过 诱导宿主细胞凋亡而致病。凋亡素诱导细胞凋亡对细胞具有选择性，即只诱导肿瘤细胞凋 亡，而不会引起正常细胞凋亡。凋亡素这种选择性诱导肿瘤细胞凋亡的特性使其有可能成 为一种安全的革G向性抗肿瘤药物。
[0003] 凋亡素只诱导肿瘤细胞凋亡不引起正常细胞凋亡，与其自身结构和细胞定位有 关。已知凋亡素82-88位、111-121位氨基酸组成两段核定位信号，能引导凋亡素由细胞质 进入细胞核。97-105位氨基酸组成出核信号，能使入核的凋亡素返回到细胞质，并定位于细 胞质。108位的苏氨酸，在肿瘤细胞中由CDK2周期依赖性激酶磷酸化，使出核信号失活，凋 亡素留在细胞核；在正常细胞中CDK2活性低，108位苏氨酸不被磷酸化，出核信号能引导凋 亡素出核，定位于细胞质。33-46位富含疏水性氨基酸，通过疏水作用力有助于凋亡素形成 聚合体或与其他蛋白质结合。
[0004] 凋亡素定位于细胞核是凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的前提条件，但不是唯一条件。 人工将凋亡素导入正常细胞的细胞核并不能引起正常细胞凋亡。热休克蛋白70是一种热 应激蛋白，能在所有的凋亡途径中多环节地抵抗细胞凋亡。本发明发明人的研宄结果证实， 凋亡素通过与热休克蛋白70基因上的热休克元件结合，阻止热休克蛋白基因的转录，抑制 热休克蛋白70的应激性表达。这一发现圆满地揭示了了凋亡素只引起肿瘤细胞凋亡，不诱 导正常细胞凋亡的机制：凋亡素通过抑制热休克蛋白70的应激性表达诱导细胞凋亡。热休 克蛋白70的应急性表达只在应激状态下启动。肿瘤细胞有热休克蛋白70的应激表达，正 常细胞中不存在热休克蛋白70的应激性表达，故凋亡素只诱导肿瘤细胞凋亡而不引起正 常细胞凋亡；转录是在细胞核内完成的，凋亡素与热休克元件结合阻止热休克蛋白70基因 的转录必须先定位于细胞核。
[0005] 121个氨基酸组成的蛋白质，分子量不算太大，但作为一种异源蛋白长期应用还是 具有一定的安全隐患。根据本发明发明人前期的研宄结果，凋亡素与热休克蛋白70基因的 热休克元件结合是凋亡素抑制热休克蛋白70应激表达的关键环节，如能筛选、确定凋亡素 与热休克蛋白70基因上热休克元件结合的序列，将其与核定位信号等功能片段组合成为 组合肽，将有可能保持甚至提高凋亡素的促肿瘤细胞凋亡的活性，提高其用药的安全性，并 且降低合成生产的成本。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种凋亡素组合肽，该组合肽能够提高促肿瘤细胞凋 亡的活性，并且具有安全，使用成本低等特点。
[0007] 本发明的目的之二是提供所述凋亡素组合肽在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术手段实现的：
[0009] 1、确定凋亡素82-88和111-121位的核定位信号，也是凋亡素与热休克元件结合 的序列。
[0010] 本发明发明人用凝胶阻滞实验证明凋亡素82-88U11-121两个片段是凋亡素与 热休克蛋白70基因上的热休克元件结合的序列，结果见图1。这两个片段先前已经被证明 是凋亡素的核定位信号，所以凋亡素82-88U11-121两个片段既是核定位信号也是凋亡素 与热休克元件结合片段，具有双重功能。
[0011] 2、凋亡素33-46位的疏水氨基酸富含区（LRS)能促进核定位信号寡聚体的聚合， 提高核定位信号与热休克元件结合的能力。
[0012] 将33-46疏水区序列接于两个核定位信号之间，能促进核定位信号寡聚体的聚 合。这种聚合提高了核定位信号与热休克元件结合的能力，实验结果见图2。
[0013] 3、确定了凋亡素组合肽的氨基酸序列。该序列由以下元件组成：（1)凋亡素 82-88、111-121位的两个核定位信号。核定位信号保证组合肽进细胞核，入核后与热休克元 件结合阻止热休克蛋白70的应激性转录。（2)凋亡素33-46位的疏水氨基酸富含区，将该 序列置于两个核定位信号之间，促进核定位信号寡聚体的形成，增强核定位信号与热休克 元件结合的能力。（3)转导肽，在凋亡素核定位信号和疏水区序列组成的多肽氨基端连接转 导肽，保证静脉用药时能诱导组合肽进入细胞质。
[0014] 在本发明中，优选的，所述的凋亡素组合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0015] 4、组合肽对多种肿瘤细胞的促凋亡活性强于凋亡素，可作为抗肿瘤药物用于肿瘤 的治疗。
[0016] MTT实验和流式细胞术检测细胞凋亡实验的结果都证实，组合肽对多种肿瘤细 胞的增殖都有抑制作用，而对胶质瘤的作用要强于其他的肿瘤。用流式细胞术检测凋亡 素和组合肽对U87人胶质瘤细胞促凋亡的作用，24小时组合肽诱导的U87细胞凋亡率为 35.83%，TAT-凋亡素诱导的凋亡率为9. 35% (见图3) ;48小时组合肽诱导的凋亡率为 69. 10%，TAT-凋亡素诱导的凋亡率为29. 90%，见图4。对大鼠 C6胶质瘤细胞，组合肽48 小时诱导的凋亡率为90. 8%，TAT-凋亡素诱导的凋亡率为22. 8%，见图5。而对H印G2人 肝癌细胞，组合肽48小时诱导的凋亡率只有40. 16%，TAT-凋亡素诱导的凋亡率23. 48%， 见图6。用组合肽治疗大鼠皮下胶质瘤，治疗组肿瘤重量都小于对照组，治疗组出现坏死灶， 见图7、图8。
[0017] 因此，进一步的，本发明还提出了所述的凋亡素组合肽在制备抗肿瘤药物中的应 用。
【附图说明】
[0018] 图1为凝胶阻滞实验检测凋亡素核定位信号与热休克元件结合结果；
[0019] 由左至右依次为核定位信号1、核定位信号2、阴性对照
[0020]图2为凝胶阻滞实验检测疏水序列使核定位信号聚合后与热休克元件结合的结 果；
[0021] 由左至右依次为阴性对照、疏水序列聚合的核定位信号寡聚体、凋亡素；
[0022] 图3为凋亡素、组合肽24小时诱导人U87胶质瘤细胞凋亡实验结果；
[0023] 图4为凋亡素、组合肽48小时诱导人U87胶质瘤细胞凋亡结果；
[0024] 图5为凋亡素、组合肽48小时诱导大鼠 C6胶质瘤细胞凋亡结果；
[0025] 图6为凋亡素、组合肽24小时诱导人H印G2肝癌细胞凋亡结果；
[0026] 图7为组合肽治疗大鼠皮下胶质瘤实验结果（天平显示肿瘤重量）；
[0027] 图8为组合肽治疗裸鼠皮下胶质瘤的病理改变；
[0028] 上图示组合肽抑制肿瘤细胞的侵袭，下图示组合肽引起肿瘤组织坏死；
[0029] 图9为TAT-凋亡素的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施 例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细 节形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。
[0031] 实施例1凋亡素与热休克元件结合序列的筛选和确定
[0032] 根据热休克蛋白70基因的热休克元件序列合成DNA探针，具体序列如下，其中包 含三个热休克因子结合序列NGAAN，5'端用生物素标记，由上海生工合成并标记。
[0033] 5, CAGTGAATCCCAGAAGACTCTGGAGAGTTCTG 3，
[0034] 3, GTCACTTAGGGTCTTCTGAGACCTCTCAAGAC 5'
[0035] 试剂盒 LightShift? Chemiluminescent EMSA Kit (化学发光检测 EMSA 试剂盒） 购自Thermo,化学发光法EMSA试剂盒一一购自碧云天。凝胶阻滞实验按两种试剂盒提供 的方法操作。结果只有两个核定位信号能和热休克元件探针结合，但结合能力较弱，见图 1。将凋亡素的LRS序列插入到两个核定位信号中间，能促进核定位信号形成寡聚体，增强 核定