纯化含Fc区蛋白的方法

纯化含Fc区蛋白的方法
【专利说明】纯化含Fe区蛋白的方法
[0001] 本申请是国际申请日2006年6月16日、国际申请号PCT/US2006/023478于2007 年12月17日进入中国国家阶段、申请号200680021590. X、发明名称"纯化含Fe区蛋白的 方法"的申请的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2005年6月17日提交的申请号为60/691821的临时专利申请"纯化 含 Fe 区蛋白的方法（METHODS OF TORIFYING FcREGION CONTAINING PROTEINS)"的优先权。 该申请的全部内容并入本文。
[0004] 发明背景
[0005] 抗体是许多动物，特别是人类的免疫系统的功能强大的组分。重组技术的最新进 展使得事实上针对任何靶，例如，癌细胞，细菌和病毒的抗体的产生成为可能。通常地，抗体 用已被工程化成表达高水平的所述抗体的细胞系产生。随后，工程化细胞系在包括糖，氨基 酸和生长因子及各种蛋白，包括例如，血清蛋白的复杂混合物的培养物中生长。然而，从细 胞副产物和培养物组分中分离完全抗体至足以用于研宄或用作治疗剂的纯度形成了严峻 挑战。如果准备将抗体用作药物向人类给药，则抗体分子的纯化尤为关键。
[0006] 传统抗体纯化方案（或系列）通常包括色谱步骤，所述色谱步骤利用了与多种杂 质的结合或截留相比，抗体分子优先结合或被色谱柱的固相（或官能化固相）截留的能力。 已建议或执行的纯化抗体的方案为：首先将含有CH2/CH3区的蛋白结合在固相上所固定的 A蛋白上，然后通过用疏水电解质溶剂洗涤固相，除去固相上所结合的杂质，接着从所述固 相上回收含有CH2/CH3区的蛋白。然而，这些方案的限制在于用来优先结合含有CH2/CH3 区的蛋白的条件同样支持杂质（例如，具有不完全CH2/CH3区的抗体）的结合。在人用治 疗剂的开发过程中，这些杂质是非常不希望有的。
[0007] 因此，存在着改进对具有恒定区的蛋白或多肽，尤其是在细胞培养物中产生的具 有Fe区的蛋白（例如，抗体）的纯化的需求。
[0008] 发明概述
[0009] 在多个方面，本发明的特征在于将具有Fe区的蛋白从包括该蛋白和一种或多种 杂质的源液中分离的方法。在本发明的方法中，将具有Fe区的蛋白（靶蛋白）吸附到Fe结 合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤Fe结合剂，以除去一种或多种杂质。接 着在洗脱溶液中从Fe结合剂上回收该蛋白。本发明的方法对除去例如内含子连读变异体 类（IRT)，二硫键缺失类（UDB)和/或低分子量变异体类（LMW)这样的杂质尤其有效。本发 明的方法在除去例如宿主细胞蛋白（HCP)和DNA这样的杂质方面同样有效。
[0010] 本发明的方法包括一个或多个色谱分离步骤，另外，还可以包括一个或多个过滤 步骤。所述色谱分离步骤可以是连续或不连续的（例如，分批方法），或者为两者的组合。 在多种实施方案中，本方法包括一个或多个过滤步骤，例如，以除去病毒，浓缩和缓冲含有 靶蛋白的溶液，以及除去微生物污染物。
[0011] 在多种实施方案中，含Fe区蛋白是抗原结合多肽（例如，抗体或其片段）或免疫 粘附素（例如，TNF受体免疫粘附素）。在多种实施方案中，含Fe区蛋白是抗体融合蛋白， 鼠抗体，嵌合抗体或人源化抗体。在优选实施方案中，含Fe区蛋白是人或人源化抗IL-13 抗体。或者，在其它实施方案中，含Fe区蛋白可以结合例如A β，⑶3,⑶52, VEGF，EGFR，⑶3 3，CD20，HER-2，TNFa，CD25，RSV，IgE，gp IIb/IIIa，CDlla或 α4整联蛋白的抗原。
[0012] 在多种实施方案中，含Fe区蛋白是重组产生的。在多种实施方案中，含Fe区蛋白 是在中国仓鼠卵巢（CHO)细胞中重组产生的。
[0013] 在多种实施方案中，所述一种或多种杂质包括一种或多种宿主细胞蛋白，宿主细 胞DNA，细胞培养物蛋白，具有Fe区的非所需种类的蛋白及其混合物。例如，在多种实施方 案中，具有Fe区的非所需种类的蛋白包括一种或多种具有内含子连读序列的抗体链或其 片段，一种或多种具有不正确二硫键的抗体链或其片段，半抗体或其片段，轻链二聚体或其 片段和重链二聚体或其片段。
[0014] 在一个方面，本发明的方法通过首先将具有Fe区的蛋白吸附到Fe结合剂上，然后 用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fe结合剂，以除去一种或多种杂质，随后从所述 Fe结合剂上回收所述蛋白，从包括所述蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化具有Fe区的 蛋白。在多种实施方案中，将所述蛋白吸附到Fe结合剂上的步骤和用含有二价阳离子盐的 缓冲溶液洗涤所述Fe结合剂的步骤在约2°C至约24°C的温度范围内进行。在多种实施方 案中，从所述Fe结合剂回收所述蛋白的步骤包括用pH范围为约2. 0至约6. 5的洗脱缓冲 液洗脱所述蛋白。
[0015] 在多种实施方案中，Fe区结合剂包括一种或多种A蛋白和G蛋白。在优选实施方 案中，所述Fe结合剂被固定在固相上。该固相可以包括，例如，一种或多种珠，琼脂糖基质， 二氧化硅及其混合物。
[0016] 用来洗涤Fe结合剂的缓冲液中所存在的二价阳离子盐可以包括，例如，离液序列 高的盐。适用于制备所述洗涤缓冲溶液的二价阳离子盐包括但不限于氯化镁，氯化钙，氯化 镍及其混合物。在多种实施方案中，适用于制备所述洗涤缓冲溶液的二价阳离子盐包括但 不限于二价II族（例如，镁，妈，钡等）阳离子，二价过度金属（例如，铜，镍，锰等）阳离子 的硫氰酸盐（SCN0，高氯酸盐（CKV)，硝酸盐（NCV)，氯化盐和溴化盐及这些盐的组合物。
[0017] 在多种实施方案中，含有二价阳离子盐的缓冲溶液的pH值范围为约4至约9,在某 些实施方案中，为约4至约8,约4. 5至约7. 5,或约6至约8。此处所述范围内所包括的值 和范围和/或中间值也希望在本发明的范围内。例如，所述二价阳离子盐的pH值为约7. 1 至约7. 9,约7. 2至约7. 9,约7. 3至约7. 7,约7. 4至约7. 6,约4至约5,约5至约6,约6 至约7或约8至约9。
[0018] 此外，希望以此处所述值作为上限或下限的范围在本发明的范围内。例如，所述二 价阳离子盐的pH为至少约（或约）4. 5, 5, 5. 5, 6,6. 5, 7, 7. 5或8。
[0019] 在多种实施方案中，缓冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度范围为约0.1 M至约 5M，在某些实施方案，为约0. 5M至约3M，约1.0 M至约3M或约0. 6M至约2. 5M。例如，所述二 价阳离子缓冲液可以包括至少约〇. 6M的0&(：12或至少约2M的MgCl 2或至少约2M的CaCl 2。 此处所述范围内所包括的值和范围和/或中间值也希望在本发明的范围内。例如，所述缓 冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度为约〇. 5M至约0. 75M，约0. 5M至约0. 8M，约0. 5M至 约 0. 9M，约 0. 5M 至 I. 0M，约 0. 5M 至 2M，约 I. 5M 至约 2. 0M，约 I. 5M 至约 2. 5M，约 I. 5M 至约 3. OM或约2. 5M至约3M。
[0020] 此外，希望以此处所述值作为上限或下限的范围在本发明的范围内。例如，所述缓 冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度为至少约（或约）0. 6M，1M，I. 5M，2M，2. 5M或3M。在多 种实施方案中，含有二价阳离子盐的缓冲溶液的温度范围为约2°C至约24°C。
[0021] 在多种实施方案中，从Fe结合剂回收蛋白的步骤包括用pH范围为约2.0至约 6. 5,优选约2. 0至约4. 0,更优选约2. 5至约3. 5的洗脱缓冲液洗脱所述蛋白。此处所述范 围内所包括的值和范围和/或中间值也希望在本发明的范围内。例如，所述洗脱缓冲液的 pH为约2至约3或约3至约4。
[0022] 此外，希望以此处所述值作为上限或下限的范围在本发明的范围内。例如，所述洗 脱缓冲液的pH为至少约（或约）2, 2. 5, 3, 3. 5或4。
[0023] 在多种实施方案中，所回收的蛋白可以在所述Fe结合剂色谱步骤之前或之后进 行另外的纯化步骤。例如，例示性的进一步的纯化步骤包括但不限于：阴离子交换色谱，阳 离子交换色谱，固定化金属亲和色谱，疏水相互作用色谱（HIC)，羟基磷灰石色谱，透析，亲 和色谱，硫酸铵沉淀，乙醇沉淀，反相HPLC (RP-HPLC)，色谱聚焦，超滤，渗滤，微滤和凝胶过 滤。在多种实施方案中，所述Fe结合剂色谱步骤后跟随的是阴离子交换色谱和HIC步骤。 在多种实施方案中，所述色谱步骤后还跟随着病毒过滤步骤，超滤/渗滤步骤和/或微生物 污染物过滤步骤。
[0024] 在一个方面，本发明提供了含有杂质的溶液中纯化抗体的方法。在多种实施方案 中，所述方法包括，首先将所述蛋白吸附到Fe结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲 溶液洗涤所述Fe结合剂，以除去一种或多种杂质，随后从所述Fe结合剂回收所述蛋白，以 产生第一洗脱池 （eluent pool)。
[0025] 在多种实施方案中，所述纯化过程这样继续进行，即，通过使离子交换树脂与所述 第一洗脱池使靶蛋白不吸附到树脂上的方式接触，然后回收流过的靶蛋白，以产生第二洗 脱池，而对所述第一洗脱池进行离子交换色谱。在多种实施方案中，所述离子交换色谱步 骤进一步包括用缓冲洗涤液洗涤所述离子交换树脂，以回收至少一部分任何被吸附的靶蛋 白。
[0026] 在多种实施方案中，所述纯化过程这样继续进行，即，通过将所述靶蛋白吸附到疏 水相互作用树脂（例如，经疏水配体官能化的固相）上，用离子强度几乎不洗脱所述靶蛋白 的缓冲洗涤液洗涤所述疏水相互作用树脂，然后回收纯化的靶蛋白（通常用离子强度低至 足以使所述靶蛋白从所述疏水相互作用树脂上解吸附的洗脱缓冲液），而对所述第二洗脱 池进行疏水相互作用色谱。
[0027] 在本发明的多个方面的优选实施方案中，Fe结合剂被固定在固相上，其优选在与 源液接触之前先用适宜的缓冲液平衡。所述固相优选为包括固定所述Fe结合剂的琼脂糖 的柱。在多种实施方案中，所述柱涂覆有试剂，例如甘油，以减少或防止柱的非特异性附着。
[0028] 在多种实施方案中，经本发明的方法纯化的蛋白可以配制在药学上可接受的载体 中，并用于各种诊断，治疗或其它已知的这类分子的用途。
[0029] 在多个方面，本发明提供了从包括含Fe区蛋白及其内含子连读变异体（IRT)的溶 液中将含Fe区蛋白纯化的方法。在特征方面，本发明的方法被用来降低蛋白制品，例如，抗 体制品中的一种或多种内含子连读变异体种类的水平。在多种实施方案中，从Fe结合剂回 收的蛋白的内含子连读变异体水平比源液中的内含子连读变异体水平小至少5倍，在某些 实施方案中，比源液中的内含子连读变异体水平小至少10倍。在多种实施方案中，在含有 所述回收自Fc结合剂的蛋白的溶液中，所述内含子连读变异体包括小于约1.0%，0.8%， 0. 5%，0. 2%或0. 1 %的所述蛋白的种类。
[0030] 在多个方面，本发明提供了从包括含Fc区蛋白及其低分子量变异体（LMW)的溶液 中纯化Fc区蛋白的方法。在特征方面，本发明的方法被用来降低蛋白制品，例如，抗体制品 中的一种或多种低分子量变异体类的水平。在多种实施方案中，从Fc结合剂回收的蛋白的 低分子量变异体水平比源液中的低分子量变异体水平小至少5倍，在某些实施方案中，比 源液中的低分子量变异体水平小至少10倍。在多种实施方案中，在含有所述回收自Fc结合 剂的蛋白的溶液中，所述低分子量变异体包括小于约1. 0 %，0. 8%，0. 5%，0. 2 %或0. 1 % 的所述蛋白的种类。
[0031] 在多个方面，本发明提供了从包括含Fc区蛋白及其二硫键缺失变异体（UDB)的溶 液中纯化含Fc区蛋白的方法。在特征方面，本发明的方法被用来降低蛋白制品，例如，抗体 制品中的一种或多种二硫键缺失变异体类的水平。在多种实施方案中，从Fc结合剂回收 的蛋白的二硫键缺失变异体水平比源液中的二硫键缺失变异体水平小至少5倍，在某些实 施方案中，比源液中的二硫键缺失变异体水平小至少10倍。在多种实施方案中，在含有所 述回收自Fc结合剂的蛋白的溶液中，所述二硫键缺失变异体包括小于约20%，15%，10%， 5%，2%或1 %的所述蛋白的种类。
[0032] 在另一个方面，本发明涉及根据本发明的方法纯化的含Fc区的蛋白。
[0033] 在另一个方面，本发明提供了适用于实施任何方法的系统，所述方法至少包括首 先将蛋白吸附到Fc结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以 除去一种或多种杂质，随后从所述Fc结合剂回收所述蛋白的步骤。
[0034] 在其它方面，本发明提供了用于实施任何方法的纯化系列，所述方法至少包括首 先将蛋白吸附到Fc结合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以 除去一种或多种杂质，随后从所述Fc结合剂回收所述蛋白的步骤。
[0035] 在多个方面，本发明的特征还在于用于实施本发明的一种或多种方法的试剂盒。 在多种实施方案中，所述试剂盒包括至少一种试剂和所述试剂盒的使用说明书。例如，试剂 盒可以包括一种或多种试剂，例如，Fc结合剂，二价阳离子盐和用于制备含有二价阳离子盐 的缓冲洗涤液的试剂，以及所述试剂盒的使用说明书。
[0036] 发明详述
[0037] 在进一步描述本发明之前，对本文将要使用的特定术语的定义进行阐述有助于对 本发明的理解。将本文所述定义分组只是为了方便参考而不是为了限制。
[0038] 蛋白相关定义
[0039] 在多个方面，本发明提供了从包含含Fc区蛋白及其一种或多种连读变异体，例 如，内含子连读变异体的溶液中纯化含Fc区蛋白的方法。在特征方面，本发明的方法被用 来降低蛋白制品，例如，抗体制品中一种或多种内含子连读（IRT)变异体类的水平。本文 中，术语"内含子连读变异体"和"内含子连读变异体类"可以互换使用，指在感兴趣的含Fc 区蛋白（例如，靶蛋白）的合成中，多肽链延伸在编码区转录之前被编码区前的内含子中的 终止密码子终止的过程的产物。结果是感兴趣的蛋白的具有一个或多个不完全或缺失结构 域的变异体（即，内含子连读变异体）。这种内含子可以包含一个以上的终止密码子，从而 导致了产生数个不同内含子连读变异体的可能性。
[0040] 术语"二硫键缺失变异体"或"m)B"是指任何缺失至少一个二硫键的种类。缺失 的二硫键可以是链间二硫键或链内二硫键或这两者的组合。
[0041] 术语"低分子量种类"或"LMW"类是指含Fc区蛋白的变异体，其包括由游离重链， 游离轻链，IRT类，半分子和四分之三分子或其混合物组成的蛋白种类。
[0042] A蛋白是在大多数金黄色葡萄球菌菌株中发现的约42kD的细胞壁蛋白，其以高亲 和力（与人IgG的亲和力约为I(T8M)与抗体的Fc区结合。本文所用术语"A蛋白"包括从 其天然来源获得的A蛋白，合成产生的A蛋白（例如，通过肽合成，通过重组技术等）及其 保留了结合具有CH2/CH3区的蛋白的能力的变异体。
[0043] G蛋白是G组链球菌的细胞壁蛋白。G蛋白是以高亲和力与抗体，尤其IgG抗体的 Fc区结合的III型Fc受体。本文所用术语"G蛋白"包括从其天然来源获得的G蛋白，合 成产生的G蛋白（例如，通过肽合成，通过重组技术等）及其保留了结合具有Fc区的蛋白 的能力的变异体。
[0044] 术语"抗体"或"免疫球蛋白"（本文中可以互换使用）是指具有由两条重链和两条 轻链组成的四肽多链基本结构的抗原结合蛋白，所述链通过例如，链间二硫键而被稳定化， 所述抗原结合蛋白具有特异性结合抗原的能力。重链和轻链都折叠成结构域。
[0045] 术语"结构域"是指包括肽环（例如，包括3-4个肽环）的重链或轻链多肽的球形 区，所述肽环通过例如，折叠片和/或链内二硫键而被稳定化。本文中，根据在"恒定" 结构域的情况下，多类成员的结构域内序列变异的相对缺乏，或在"可变"结构域的情况下， 多类成员的结构域内的显著变异，结构域进一步被称为"恒定"结构域或"可变"结构域。轻 链上的"恒定"结构域可以互换地称为"轻链恒定区"，"轻链恒定结构域"，"CL"区或"CL" 结构域。重链上的"恒定"结构域可以互换地称为"重链恒定区"，"重链恒定结构域"，"CH" 区或"CH"结构域。轻链上的"可变"结构域可以互换地称为"轻链可变