纯化含Fc区蛋白的方法_2

区"，"轻链可变结构 域"，"VL"区或"VL"结构域。重链上的"可变"结构域可以互换地称为"重链可变区"，"重 链可变结构域"，"VH"区或"VH"结构域。
[0046] 术语"片段"是指抗体或抗体链的一部分，其包括比完整或完全抗体或抗体链少的 氨基酸残基。片段可以通过化学或酶处理完整或完全抗体或抗体链而获得。片段也可以通 过重组方法获得。例示性片段包括？&13，？&13'，？(&13'）2，？ &1^和/或？￥片段。术语"抗原 结合片段"是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原，或与其衍生自的完整抗体竞争 特异性抗原结合。
[0047] 术语"抗体融合蛋白"和"抗体融合"是指融合蛋白，其包括与至少一种非抗体蛋白 部分或多肽融合的抗体的全部或一部分。融合通常通过编码所述蛋白的基因的基因工程化 而完成。其它例示性抗体融合蛋白包括结合与另一可溶或细胞生物蛋白的全部或一部分， 例如，受体（细胞受体或可溶受体）或其部分，细胞因子或其部分，酶或其部分等融合的抗 体的一部分（包括Fc区）的细胞受体。这种包括与另一蛋白融合的抗体的Fc区的抗体融 合蛋白在本领域中也被称为Fc融合蛋白。
[0048] 术语"Fc结合剂"是指能与抗体（例如，IgG抗体）的Fc区结合的分子，其包括但 不限于补体蛋白，Fc受体或由细菌衍生的对抗体的Fc区具有高亲和力的蛋白，如A蛋白或 G蛋白。
[0049] 术语"Fc区"是指IgG抗体的C末端区，尤其指所述IgG抗体的重链的C末端区。 尽管IgG重链的Fc区的边界可以细微地变化，但Fc区通常被定义为约从IgG重链的氨基 酸残基Cys226跨越到羧基端。
[0050] 色谱相关定义
[0051] 本文所用术语"源液"是指包含至少一种希望从其它同样存在的物质中纯化出来 的靶物质的液体。源液可以是，例如，水溶液，有机溶剂系统或水/有机溶剂混合物或溶液。 源液常常为含有许多生物分子（如蛋白，抗体，激素和病毒），小分子（如盐，糖，脂质等）甚 至颗粒物质的复杂混合物或溶液。虽然生物起源的典型源液以水溶液或悬浮液开始，但其 也可以含有在例如溶剂沉淀，提取等早期分离步骤中所使用的有机溶剂。包含能通过本发 明的多种实施方案纯化的有价值的生物物质的源液的例子包括但不限于来自生物反应器 的培养上清液，匀化的细胞悬液，血浆，血浆组分和牛乳。
[0052] 本文中，术语"靶物质"或"靶蛋白"是指期望从源液中纯化出来的一种或多种含 Fc区蛋白。靶物质可以存在于为悬浮液的源液或溶液中。
[0053] 术语"杂质"是指源液中的不同于靶物质，并且希望从最终的靶物质产品中除去的 物质。典型的杂质包括核酸，蛋白（包括内含子连读类，低分子量种类和二硫键缺失类）， 肽，内毒素，病毒和小分子。
[0054] 本文所用术语"固相"是指在纯化过程中与靶物质相互作用，或Fc结合剂可以 附着其上的非水基质。适宜的固相材料包括但不限于玻璃，二氧化硅（例如，硅胶），多 糖（例如，多糖基质），如琼脂糖和纤维素，有机聚合物，如聚丙烯酰胺，甲基丙烯酸甲酯 和聚苯乙稀-二乙烯基苯共聚物，例如，Amberlite?树脂（可购自Rohm&Haas Chemical Co.，Philadelphia, Pa.)。固相可以选自通常被描述为亲和树脂，离子交换树脂和离子俘获 树脂的树脂中的任何一种。固相可以是，例如，纯化柱，离散颗粒的非连续相或其组合。固 相可以具有多孔或无孔特性，并且可以是可压缩或不可压缩的。在多种实施方案中，固相是 聚合物基质或琼脂糖颗粒或珠。在多种实施方案中，固相可以涂覆有试剂（如甘油），以防 止例如杂质在固相上的非特异性附着。Fc结合固相只需要具有允许Fc结合剂附着到所述 固相表面的化学物或结合的配体。优选固相材料对纯化过程，包括抽滤和错流过滤中所采 用的条件和所用液体的温度，PH以及其它方面将具有物理和化学可恢复性。
[0055] "亲和配体"是指通过与源液组分的结合位点的特异性相互作用而与所述组分选 择性或优先结合的分子。在本发明中，亲和配体（例如，Fc结合剂）通常被固定在固定相，如 树脂上。可以结合至树脂载体上，以提供可用于本发明的过程的色谱用树脂的亲和配体的 例子包括但不限于A蛋白，G蛋白及其选择性结合蛋白Fc区的类似物。使亲和配体与固体 载体材料结合的方法是纯化技术领域公知的。参见，例如，参考书Affinity Separations:A Practical Approach(Practical Approach Series), Paul Matejtschuk(Editor)，Irl Pr: 1997 ;和Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, New York:1997。
[0056] "亲和色谱用树脂"或"亲和树脂"是指包括具有结合在固相或底物表面的亲和配 体的固相或底物的色谱用树脂。
[0057] "离子交换色谱用树脂"或"离子交换树脂"是指与带有正或负电荷的配体共价结 合，因而具有可用于与所述离子交换树脂所接触的溶液中的离子进行交换的游离平衡离子 的固体载体。
[0058] "阳离子交换树脂"是指与带负电荷的配体共价结合，因而具有用于与所述树脂所 接触的溶液中的阳离子进行交换的游离阳离子的离子交换树脂。本领域已知有很多种阳离 子交换树脂，例如，其中共价结合基团是羧酸盐或磺酸盐的阳离子交换树脂。市场上可以买 到的阳离子交换树脂包括CMC-纤维素，SP-Sephadex?和Fast S-Sepharose ?(后两者可购 自 Pharmacia)〇
[0059] "阴离子交换树脂"是指与带正电荷的基团，如季铵基共价结合的离子交换树脂。 市场上可以买到的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素，TME，QAE Sephadex?和Fast Q Sepharose?(后两者可购自 Pharmacia)。
[0060] 本文所用术语"离液序列高的盐"是指包括一种或多种感胶离子序列低，能渗透 蛋白水化层，并与其表面直接结合的离子组分的盐。这破坏了共水合缔合（cohydrative association)，从而有利于蛋白的增溶。离液序列高的盐的例子包括但不限于II族元素的 卤化盐（例如，氯化钙，氯化镁，氯化钡，溴化钙，溴化镁，溴化钡，碘化钙，碘化镁，碘化钡）。
[0061] 适宜二价阳离子盐的例子包括但不限于Mn2+，Ni2+或Cu 2+，Mg2+，Ca2+和Ba 2+与硫氰 酸根（SCN0，高氯酸根（CKV)，硝酸根（NCV)，氯离子（CD和溴离子（BiO的盐及其组合 物。
[0062] 在某些实施方案中，二价阳离子盐包括二价阳离子（例如，Mg2+，Ca2+，Ni 2+或Ba2+)。 优选用于特征过程的离液序列高的盐有MgCl2,附(：12和CaCl2。在二价阳离子盐洗涤步骤之 后，靶蛋白从亲和色谱基质上洗脱下来。
[0063] "缓冲剂"是其存在于溶液中时增加导致pH的单位变化所必须加入的酸或碱的量 的物质。缓冲液通过其酸-碱轭合物组分的作用而抵抗PH的变化。与生物试剂一起使用的 缓冲液通常能维持恒定浓度的氢离子，以使溶液的pH在生理范围内。术语"生理pH"是指 哺乳动物血液的pH(即，7. 38或约7. 4)。因此，生理pH范围是约7. 2-7. 6。传统缓冲剂组 分包括但不限于有机和无机盐，酸和碱。用于生物分子（例如，蛋白分子）纯化的例示性缓 冲剂包括两性离子或"Good"缓冲剂，参见，例如，Good et al. (1966)Biochemistry 5:467 和 Good and Izawa(1972)Methods Enzymol. 24:62。例不性缓冲剂包括但不限于 TES，MES， PIPES，HEPES，MOPS，M0PS0, TRICINE 和 BICINE。
[0064] 本文中的"平衡缓冲液"是用来制备Fe结合试剂，固相或此两者，用于含有靶蛋白 的源液的上样的缓冲液。平衡缓冲液优选是等渗的，并且pH通常在约6至约8的范围内。 "上样缓冲液"是用来将含有含Fc区蛋白和杂质的源液上样到Fc结合剂被固定于其上的 固相上的缓冲液。通常，平衡和上样缓冲液是相同的。"洗脱缓冲液"是用来从被固定的Fc 结合剂上洗脱含Fc区蛋白的缓冲液。优选洗脱缓冲液具有较低的pH，从而破坏Fc结合剂 与感兴趣的蛋白间的相互作用。优选低PH的洗脱缓冲液的pH在约2至约5,更优选在约3 至约4的范围内。将pH控制在该范围内的缓冲液的例子包括甘氨酸，磷酸盐，醋酸盐，柠檬 酸盐和铵缓冲液及其组合物。优选的这类缓冲液是柠檬酸盐和醋酸盐缓冲液，最优选的是 柠檬酸钠或醋酸钠缓冲液。涵盖的其它洗脱缓冲液包括用于洗脱感兴趣的蛋白的高PH缓 冲液（例如，pH为9或9以上的缓冲液）或包括例如MgCl2 (2mM)的化合物或组合物的缓冲 液。
[0065] 本文用到的"洗涤液"或"洗涤缓冲液"在本文中都是指用来将杂质从结合了靶物 质的色谱用树脂上带走的液体。可以相继使用一种以上的洗涤液，例如，设计依次用具有不 同特性，如pH，导电率，溶剂浓度等的洗涤液离解和除去与所述色谱用树脂非特异性缔合的 不同类型的杂质。
[0066] 本文中的"洗脱液"或"洗脱缓冲液"是指用来从已经一种或多种洗涤液洗涤过的 色谱用树脂上离解靶物质的液体。洗脱液在不使靶物质不可逆变性的条件下将其离解。典 型的洗脱液是色谱技术领域公知的，其可以具有较高浓度的盐，游离亲和配体或类似物，或 其它促进所述靶物质从所述色谱用树脂离解的物质。"洗脱条件"是指加在被靶物质结合的 色谱用树脂上的，从所述色谱用树脂上离解所述靶物质的处理条件，例如，使被所述靶物质 结合的色谱用树脂与洗脱液或洗脱缓冲液接触，以产生这种离解。
[0067] 本文中的"清洗液"或"清洗缓冲液"是指用来在纯化过程完成之后洗涤色谱用树 脂的液体。清洗液可以含有洗涤剂，病毒灭活剂或相对高浓度的盐，其PH可以比纯化过程 中所使用的液体高或低。其目的是净化色谱用树脂，以使其随时可以再使用。典型的清洗 液是色谱技术领域公知的。
[0068] 本文中的"保存液"或"保存缓冲液"是指色谱用树脂在两次使用之间悬浮于其中 的液体。除了缓冲离子外，保存液还含有杀微生物剂或其它防腐剂。这类保存液在色谱技 术领域是公知的。
[0069] 在多个方面，本发明的特征在于通过将具有Fc区的蛋白吸附到Fc结合剂上，然后 用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fc结合剂，以去除一种或多种杂质，随后从所述 Fc结合剂回收所述蛋白的过程，从包括所述蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化具有Fc 区蛋白的方法。适宜的Fc结合剂包括但不限于A蛋白和G蛋白。
[0070] 本发明的特征在于纯化含Fc区蛋白，例如，抗体的过程。例示性纯化过程包括亲 和色谱步骤。所述亲和色谱步骤可以是连续的，不连续的，或为两者的组合。例如，亲和色谱 步骤可以不连续过程，例如，分批过程来进行。亲和色谱是靶化合物与固定配体发生生物选 择性吸附，随后从固定配体上回收的过程。该过程允许靶化合物的高度特异性和有效的纯 化。该过程需要使用具有适当选择性，在允许在温和条件下回收的条件下，通常以1〇_4-1〇_8的离解常数范围结合靶化合物（例如，含Fc区蛋白）的配体（例如，Fc结合剂）。所述配 体通常被固定在珠状和多孔基质上，所述基质可以是柱填料或分批吸附介质。
[0071] 优选结合剂是A蛋白。A蛋白结合免疫球蛋白的Fc区。A蛋白由6个区组成，其中 5个区结合IgG。其以高亲和力与人IgG1, IgGjP IgG4及小鼠 IgG2a，IgG2jP IgG3结合。A 蛋白以中等亲和力与人IgD，IgM，IgA和IgE及小鼠 IgG1结合。作为亲和配体，A蛋白被使 这些区可以自由结合的方始固定在基质上。一分子的固定化A蛋白可以结合至少两分子的 IgG。天然和重组形式的A蛋白对IgG的Fc区共有类似的特异性。重组A蛋白（rProtein A)可以被工程化成包括，例如，C末端半胱氨酸，并且可以通过硫酯偶联固定至固相基质 上。这种偶联导致A蛋白的结合容量增加。
[0072] 其它结合剂有G蛋白。G蛋白对IgG具有特异性，其以高亲和力与人IgG1, IgG2, IgG3和IgG 4及小鼠 IgG JP IgG 3结合。G蛋白PLUS对人IgG 4和小鼠 IgG 2a，IgGjP IgG 3具 有中度亲和力。重组G蛋白（rProtein G)可以工程化成缺失天然蛋白的白蛋白结合区。重 组G蛋白含有2个Fc结合区。
[0073] 其它结合剂有A/G蛋白。A/G蛋白是兼备A蛋白和G蛋白的IgG结合特性的基因 工程蛋白。A/G蛋白是由非病原形式的芽胞杆菌分泌的基因融合产物。A/G蛋白含有4个 来自A蛋白和2个来自G蛋白的Fe结合域。A/G蛋白并不象A蛋白一样具有pH依赖性，然 而在别的方面却具有A蛋白和G蛋白的累加特性。
[0074] A/G蛋白与所有人IgG亚类结合，尤其适合亚类未确定的多克隆或单克隆IgG抗 体的纯化。另外，A/G蛋白还与IgA，IgE，IgM和（在较小程度上）IgD结合。A/G蛋白还与 所有小鼠 IgG亚类结合良好，尤其适合IgG亚类小鼠单克隆抗体的纯化，而不受到IgA，IgM 和鼠血清白蛋白的干扰（参见，例如，Sikkema. (1989)Amer. Biotech. Lab 7,42.)。个别小 鼠单克隆抗体亚类对嵌合A/G蛋白的亲和力大于对A蛋白或G蛋白的亲和力（参见，例如， Eliasson et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 4323-4327.) 〇
[0075] 在本发明中，固定化Fc结合剂（例如，A蛋白）用二价阳离子盐溶液洗涤，以除去 杂质。尤其是，我们发现，作为重组抗体表达技术的结果产生的非预期杂质可以通过二价阳 离子盐洗涤步骤除去。
[0076] 本发明的方法在亲和色谱和二价阳离子洗涤步骤之后可以任选地包括纯化步骤。 随后的纯化步骤可以包括离子交换色谱步骤和/或疏水相互作用色谱（HIC)步骤。随后的 色谱步骤可以是连续的，不连续的（例如，分批过程），或者为两者的组合。离子交换色谱根 据蛋白总电荷的不同而分离分子。为了结合，靶蛋白必须带有与树脂上所连官能团相反的 电荷。例如，通常带有总正电荷的抗体将与含有带负电荷官能团的阳离子交换剂结合良好。 由于这种相互作用是离子性的，因此结合必须在低离子强度条件下进行。洗脱通过增加离 子强度以破坏所述离子相互作用，或通过改变所述蛋白的PH而完成。
[0077] 离子交换色谱依靠蛋白的电荷而将其分离，而疏水相互作用色谱则利用了一些蛋 白的疏水特性。蛋白上的疏水基团与柱上的疏水基团结合。蛋白的疏水性越强，其与柱的 结合就越强。HIC步骤除去了，例如，由宿主细胞衍生的杂质（例如，DNA及其它高和低分子 量产物相关种类）。如本文所述，进一步的纯化步骤可以包括病毒去除步骤及超滤和/或渗 滤步骤。
[0078] 在多种实施方案中，含Fc区蛋白是具有与Fc结合剂的Fc受体结合的Fc区的抗 体或抗体融合蛋白。用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤Fc结合剂使得杂质，例如，感兴 趣的蛋白（例如，源液中的靶物质）的连读变异体和含有恒定区的片段（包括LMW和UDB 类）被大量去除。
[0079] 本发明的方法包括一个或多个色谱分离步骤，另外，还可以包括一个或多个过滤 步骤，用于从源液的杂质中分离具有Fc区的蛋白（"靶蛋白"）。例如，在源液与Fc结合剂 接触前，可以将所述源液过滤，离心或以其它方式处理，以除去颗粒碎肩等。例如，采用重组 技术，蛋白可以在细胞内，壁膜间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。如果蛋白在细胞内 产生，则可以通过例如，离心或超滤除去颗粒碎肩，即，宿主细胞或溶解的碎片。在蛋白分泌 入培养基的情况下，重组宿主细胞可以通过例如，切向流过滤从细胞培养基中分离。
[0080] 在多种实施方案中，含有靶蛋白的源液与Fc结合剂（优选固定在固相上，并用适 宜缓冲液平衡）接触以使得所述靶蛋白吸附到所述Fc结合剂（例如，固定化Fc结合剂） 上。源液与Fc结合剂（例如，固定化Fc结合剂）在上样缓冲液中接触，所述上样缓冲液可 以与平衡缓冲液相同。当含有杂质的源液流过固相时，靶蛋白被吸附到Fc结合剂上，而其 它多种杂质（如所述靶蛋白在重组宿主细胞内产生时的宿主细胞蛋白，或由其它过程衍生 的杂质）则流过或非特异性地结合在固相上。在多种实施方案中，Fc结合剂是A蛋白，并 且平衡缓冲液可以是含0. 15M NaCl的20mM Tris (pH 7. 5