白柱用 5 倍柱体积的 pH 7. 5,含 150mM NaCl 的 20mM Tris 平衡。 然后该柱以约45mg产物/mL树脂的量上样。随后用5倍柱体积的pH 7. 5,含1.0 M NaCl的 20mM Tris洗涤该柱，对于运行2,额外用5倍柱体积的pH 5. 0,含0. 6M CaClJ^ 50mM乙酸 钠进行洗涤。在洗脱之前，接着用5倍柱体积的pH 7. 5,含5mM NaCl的50mM Tris和5倍 柱体积的pH 7. 5,含5mM NaCl的IOmM Tris洗涤该柱。用pH 3. 0,含5mM NaCl的50mM甘 氨酸将产物从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8. 0的2M Tris中和至 7.7。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表6,其提供了对照运行和用CaCl2洗涤的运行中 存在的HCP类的水平。
[0258] 表6 :用或不用CaCl2洗涤的HCP去除的结果
[0259]
[0260] 结果显示，与对照运行相比，CaCl2洗绦使HCP去除量增大了 3倍。
[0261] 实施例5 :DNA的去除（AAB)
[0262] 检验本实施例检验了 CaCl2洗涤从含有AAB单克隆抗体的制品中除去宿主细胞 DNA的能力。
[0263] 含有所述单克隆抗体的培养物用与GE Healthcare ΑΚΤΑ FPLC色谱系统相连的 MabSelect A蛋白柱（19mL)进行小规模纯化。如下文所述完成三次MabSelect运行。
[0264] 柱尺寸-I. IcmX2Ocm
[0265] 操作流速 _300cm/hr
[0266] 平衡 l-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0267] 冲洗-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7· 5 (2 倍柱体积）
[0268] 洗涤 l-50mM Tris，2. OM CaCl2, pH 7· 5 (5 倍柱体积）（仅用于运行 2 和 3)
[0269] 洗涤 2-20mM Tris，1.0 M NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）（仅用于运行 1 和 3)
[0270] 洗涤 3-10mM Tris，75mM NaCl，pH 7. 5 (7 倍柱体积）
[0271] 洗脱-50mM 甘氨酸，75mM NaCl，pH 3· 0 (6 倍柱体积）
[0272] 净化 _50mM 甘氨酸，0· 5Μ NaCl，pH 2· 7 (5 倍柱体积）
[0273] 净化洗涤-2〇mM Tris，I5OmM NaCl，pH 7· 5 (5 倍柱体积）
[0274] 保存-16 %乙醇（5倍柱体积）
[0275] 运行温度：18-24 °C
[0276] MabSelect A 蛋白柱用 5 倍柱体积的 pH 7. 5,含 150mM NaCl 的 20mM Tris 平衡。 然后该柱以约40mg产物/mL树脂的上样量上样。随后用2倍体积的平衡缓冲液冲洗。对 于运行2和3,该步骤后接着用5倍柱体积的洗涤1的溶液洗涤。对于运行1和3,用5倍 柱体积的洗涤2的溶液洗涤。所有3次运行均用7倍柱体积的洗涤3的溶液洗涤。用pH 3.0,含75mM NaCl的50mM甘氨酸将所述单克隆抗体从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然 后产物池用pH 8. 5的2M Tris中和至7. 5-8. 0。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表7。
[0277] 表7 :用氯化钙洗涤去除DNA
[0278]
[0279] 结果显示，与在洗涤液中使用NaCl相比，pH 7. 5,含2. OM氯化钙的50mM Tris的 加入使DNA的减少量增大了 10倍。
[0280] 实施例6 :宿主细胞蛋白（HCP)的去除（12A11)
[0281] 本实施例在纯化运行中使用了第三种单克隆抗体12A11，并测试了不同洗涤条件 去除HCP的能力。
[0282] 以96孔滤板格式进行高通量筛选（HTS)，以鉴定MabSelect步骤的去除杂质，如 HCP的最佳洗涤条件。该筛选改变洗涤用辅料，辅料浓度和pH，以确定其对过程相关杂质， 如HCP的影响。
[0283] MabSelect树脂用pH 7. 3,含IOmM NaCl的5mM Tris平衡，并在柱中将产物上样。 然后取出树脂，混合，向96孔滤板的各孔中分配50 μ L树脂。各孔中的树脂用pH为7. 3， 含有5mM Tris和IOmM NaCl的溶液平衡，然后用各自含有不同辅料的洗涤液分3个阶段进 行洗涤，每阶段使用300 μ L洗涤缓冲液。辅料洗涤之后，用pH 7. 3,含有5mM Tris和IOmM NaCl的缓冲液分4个阶段进行第二次洗涤，每阶段300 μ L。然后产物分3个阶段，每阶段 300 μ L从树脂上洗脱下来。合并第1和第2阶段的洗脱液，测试HCP水平。
[0284] 树脂体积-50 μ L
[0285] 洗涤用辅料-氯化钠，氯化钙，氯化镁
[0286] 辅料浓度-100, 250, 500,1000,1500 和 2000mM
[0287] 辅料 pH-6· 0 和 7. 5
[0288] 洗脱缓冲液-25mM H印es，IOmM NaCl，pH 3. 0,25mM H印es，IOOmM NaCl，pH 3. 0， 50mM 甘氨酸，IOmM NaCl，pH 3.0, 50mM 甘氨酸，IOOmM NaCl，pH 3.0 和 IOOmM 精氨酸，IOmM NaCl，pH 3· 0, IOOmM 精氨酸，IOOmM NaCl，pH 3· 0
[0289] 运行温度：18-24 °C
[0290] 结果见表8和9。
[0291] 表8 :用pH 6. 0的氯化钠，氯化钙或氯化镁洗涤MabSelect树脂时的HCP值
[0292]
[0293] 表9 :用pH 7. 5的氯化钠，氯化钙或氯化镁洗涤MabSelect树脂时的HCP值
[0294]
[0295] 结果显示，与所有辅料浓度下pH 6. 0 (表8)和pH 7. 5 (表9)的氯化钠相比，氯化 钙和氯化镁都降低了 MabSelect峰池中HCP的水平。
[0296] 实施例7 :二硫键缺失类（UDB)的去除
[0297] 本实施例中检验了 0&(：12洗涤去除二硫键缺失类（UDB)的能力。
[0298] 基本上按实施例1中所述完成两次rmp A蛋白Sepharose? FF运行。
[0299] 柱尺寸-1.0 cmX 11. 4cm
[0300] 操作流速-150cm/hr
[0301] 平衡 l-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0302] 冲洗-2〇mM Tris，I5OmM NaCl，pH 7· 5 (I 倍柱体积）
[0303] 洗涤I-对于运行1，50mM醋酸盐，2. OM CaCl2, pH 5. 0 ;运行2无洗涤I
[0304] 洗涤 2-20mM Tris，1.0 M NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0305] 洗涤 3-10mM Tris，75mM NaCl，pH 7· 5 (7 倍柱体积）
[0306] 洗脱-50mM 甘氨酸，75mM NaCl，pH 3. I (6 倍柱体积）
[0307] 净化l_20mM柠檬酸钠 ，pH 2. 7 (5倍柱体积）
[0308] 净化2-6M胍盐酸盐（2倍柱体积）
[0309] 净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0310] 保存-16 %乙醇（5倍柱体积）
[0311] 运行温度：2_8°C
[0312] rmp A 蛋白 S印ahrose FF 柱用 5 倍体积的 pH 7. 5,含 150mM NaCl 的 20mM Tris 平衡。然后以约IOmg产物/mL树脂的上样量向该柱上样。然后用1倍体积的平衡缓冲液 冲洗，接着用5倍体积的洗涤1的溶液洗涤。对于运行1，该洗涤1的溶液由50mM醋酸盐， 2. OM CaCl2组成，pH为5. 0,而对于运行2,则将此步完全删去。洗涤1后，接着用5倍体积 的 pH 7. 5,含 1.0 M NaCl 的 20mM Tris 和 7 倍体积的 pH 7. 5,含 75mM NaCl 的 IOmM Tris 洗绦。用pH 3. 1，含75mM NaCl的50mM甘氨酸将单克隆抗体从rmp A蛋白Sepharose? FF 柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8. 5的2M Tris中和至7. 8-8. 2。然后将柱净化，洗涤和 保存。结果见表10。
[0313] 表10 :用或未用钙洗涤过的样品的％ UDB
[0314]
[0315] 观察到额外用pH 5. 0,含2. OM CaClJ^ 50mM醋酸盐洗涤过的样品中UDB水平减 少了两倍。
[0316] 实施例8 :用其它二价阳离子盐洗涤除去HCP和IRT(AAB)
[0317] 本实施例检验了含有此(：12或NiCl 2的洗涤液从含有AAB单克隆抗体的制品中去 除杂质的能力。
[0318] 进行两次运行，以评价含有其它二价阳离子盐，如此(：12或附(：12的洗涤液的作用。 同样完成两次对照运行--一次用pH 7. 5,含1.0 MNaCl的50mM Tris洗涤（期望无 IRT或 HCP 被去除），另一次用 pH 7. 5,含 2. OM CaClJ^ 50mM Tris 洗涤。
[0319] 含有所述单克隆抗体的培养物用与GE Healthcare AKTA FPLC色谱系统相连的 MabSelect A蛋白柱（9mL)进行小规模纯化。按下文所述进行MabSelect运行。如下文所 描述的那样，4次运行的所有操作参数除了洗涤1是可变的外，其余都相同（表11)。
[0320] 柱尺寸-1.0 cmX 11. 5cm(9mL)
[0321] 操作流速-300cm/hr (平衡，洗涤2,洗脱，再生，保存）
[0322] 操作流速_230cm/hr (上样，冲洗，洗绦1)
[0323] 平衡 l-50mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5. 0 倍柱体积）
[0324] 洗涤I -可变（见表11的比较）
[0325] 洗涤 2-50mM Tris，IOmM NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0326] 洗脱-50mM 甘氨酸，IOmM NaCl，pH 3· 0 (3 倍柱体积）
[0327] 再生-50mM NaOH，0· 5Μ Na2SO4 (5 倍柱体积）
[0328] 保存-16% 乙醇，50mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0329] 运行温度：18_24°C
[0330] MabSelect A蛋白柱用5倍柱体积的pH 7. 5,含150mM NaCl的50mM Tris平衡。将 该柱以约40mg产物/mL树脂的量上样。柱上多余的样品用5倍柱体积的pH 7. 5,含150mM NaCl的50mM Tris冲洗出去。然后用表11所述溶液中的一种洗涤该柱。洗脱该柱之前，用 5 倍柱体积的 pH 7. 5,含 IOmM NaCl 的 50mM Tris 洗涤。用 pH 3. 0,含 IOmM NaCl 的 50mM 甘氨酸将产物从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然后产物池用pH 9.0的2M Tris中和至 pH 8. 0。将柱用5倍柱体积的50mM NaOH，0. 5M Na2SO4净化，然后用5倍柱体积的pH 7. 5的 16%乙醇，50mM Tris，150mM NaCl保存。结果见表11(HCP的去除）和表12(IRT的去除）。
[0331] 表11 :用不同洗涤液去除HCP
[0332]
[0333] *基于MnClJP NiCl 2的溶解性选择ρΗ5· 0
[0334] 表12 :用不同洗涤液去除IRT
[0335]
[0336] *基于MnClJP NiCl 2的溶解性选择pH 5. 0
[0337] 表11显示，用含有二价阳离子的溶液洗涤的运行中存在的HCP类的水平比对照 (1.0 mM NaCl洗涤）小1. 5-3. 5倍。表12显示，与含有1.0 mM NaCl的洗涤液相比，包含用 二价阳离子盐溶液洗涤的步骤的运行也提供了大于3. 5倍的IRT去除量。因此，这些结果 证明了用其它不同于CaCl2的二价阳离子（例如，用MnCl 2或NiCl 2)进行盐洗涤也能有效 去除杂质。
[0338] 等同体通过不超出常规的实验，本领域技术人员将认识到，或能确定本文所述本 发明的具体实施方案的许多等同体。这些等同体希望为所附权利要求书所涵盖。
【主权项】
1. 从包括具有Fe区的蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化所述具有Fe区的蛋白的方 法，其包括步骤： 将所述蛋白吸附在Fe结合剂上； 用含有浓度〇. 5M至3M的CaCl2的缓冲溶液洗涤与所述蛋白结合的Fe结合剂以减少 一种或多种杂质，其中所述一种或多种杂质选自：内含子连读变异体类，二硫键缺失变异体 类，低分子量种类，宿主细胞蛋白，或宿主细胞DNA;以及 使用PH范围为2. 0至4. 0的洗脱缓冲液从所述Fe结合剂洗脱所述蛋白， 其中具有Fe区的蛋白是从源液纯化的。2. 从包括具有Fe区的蛋白和一种或多种内含子连读变异体类的源液中纯化所述具有 Fe区的蛋白的方法，所述方法包括下述步骤： 将所述具有Fe区的蛋白吸附在作为Fe结合剂的亲和配体上； 用含有浓度〇. 5M至3M的CaCl2的缓冲溶液洗涤亲和配体以减少内含子连读变异体类； 以及 使用pH范围为2. 0至4. 0的洗脱缓冲液从所述亲和配体洗脱具有Fe区的蛋白， 其中具有Fe区的蛋白是从源液纯化的。3. 从包括具有Fe区的蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化所述具有Fe区的蛋白的方 法，其中所述具有Fe区的蛋白是抗体，所述方法包括下述步骤： 将所述具有Fe区的蛋白吸附在作为Fe结合剂的亲和配体上； 用含有浓度〇. 5M至3M的CaCl2的缓冲溶液洗涤亲和配体以减少一种或多种杂质，其 中所述一种或多种杂质选自：内含子连读变异体类，二硫键缺失变异体类，低分子量种类， 宿主细胞蛋白，或宿主细胞DNA;以及 使用pH范围为2. 0至4. 0的洗脱缓冲液从所述亲和配体洗脱具有Fe区的蛋白， 其中具有Fe区的蛋白是从源液纯化的。
【专利摘要】本申请涉及纯化含Fc区蛋白的方法。具体地，本申请提供了通过将具有Fc区的多肽，例如，抗体或抗体融合吸附到Fc结合剂，例如，A蛋白或G蛋白上，然后用二价阳离子盐缓冲液洗涤，以除去杂质，随后回收被吸附的多肽来纯化所述具有Fc区的多肽的方法。本申请的特征还在于洗脱被纯化多肽的方法及纯化系列中该方法的并入。本申请还提供了包括执行该方法的组分和使用说明书的试剂盒。
【IPC分类】C07K16/00, C07K16/18, C07K1/22
【公开号】CN104926938
【申请号】CN201510211982
【发明人】兰加纳坦·戈达瓦蒂, 蒂莫西·伊斯克拉
【申请人】惠氏有限责任公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2006年6月16日
【公告号】CA2611815A1, CA2611816A1, CA2611816C, CN101213211A, CN101365722A, EP1896504A2, EP1896504B1, EP1896506A2, EP1896506B1, EP2388274A1, US7820799, US7825223, US8440799, US20070072307, US20070082367, US20110160437, WO2006138553A2, WO2006138553A3, WO2006138737A2, WO2006138737A3, WO2006138737A8