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[0139] 靶蛋白的产生
[0140] 含Fe靶蛋白可以通过标准表达方法，例如，用悬浮培养中生长的重组哺乳动物细 胞系产生。包含所感兴趣的含Fc蛋白的条件培养基在生产用生物反应器中产生。收集所得 产物，并用任何适当的澄清步骤，例如，微滤和0. 22 μ m膜过滤或离心，衬垫过滤和0. 22 μ m 膜过滤使之澄清。
[0141] 靶蛋白的纯化
[0142] 这里所例示的靶单克隆抗体（AAB，12A11和IMA)的纯化由A蛋白亲和色谱上靶分 子的俘获组成。这可以由rmp A蛋白Sepharose?快速流色谱，A蛋白Sepharose ?快速流 色谱或MabSelect A蛋白色谱组成。然后如各实验所述洗涤树脂，洗脱产物并测试杂质水 平。
[0143] 靶蛋白的分析
[0144] 用反相HPLC(RP-HPLC)测定AAB单克隆抗体样品中存在的IRT的量，用Pro A HPLC 法测定IMA单克隆抗体的IRT水平。用分子排阻色谱法（SEC-HPLC)测定单体蛋白（单体 IgG)，高分子量（HMW)和低分子量（LMW)类的百分比。进行变性SEC-HPLC分析，以确定样品 中二硫键缺失（M)B)类的相对量。供试样品中的HCP水平用酶联免疫吸附测定法（ELISA) 测定。
[0145] 分析测定：IRT和UDB
[0146] 反相 HPLC (AAB IRT 分析）
[0147] 如下法进行RP-HPLC。各样品在40°C于2. 5mM DTT存在下孵育60min，使二硫化物 还原。在室温于5. 5mM碘乙酸存在下孵育，完成烷基化。还原和烷基化之后，所有样品均用 5μ1 IM的DTT淬灭。该测定法的定量限是0.5%。将约40yg的各还原，烷基化后的样品 注入P0R0S Rl/H RP-HPLC柱，在下列条件下运行70min:
[0148] 柱：Poros Rl/H RP-HPLC
[0149] 柱温：50°C
[0150] 流动相A :0· 1 % (w/v) TFA的水溶液
[0151] 流动相B :0· 1 % (w/v) TFA的95 %乙腈溶液
[0152] 流速：1. OmT ,/mi η
[0153] 检测波长：217nm
[0154] 运行时间：70minutes
[0155] 进样：重复3次，每次40 μ g
[0156] 梯度时间表列于表1中。
[0157] 表1 !RP-HPLC法的梯度时间表
[0158]
[0159] A 蛋白 HPLC(IMA IRT 分析）
[0160] A蛋白-HPLC如下法进行。每次在POROS Pro A柱上的进样总量为100 μ g，在下 列条件下室温运行35min :
[0161] 柱：Poros Pro A 4. 6 X 50mm
[0162] 柱温：室温
[0163] 流动相A :50mM甲酸铵，pH 6. 0
[0164] 流动相B :IOmM甲酸铵，0.8%甲酸
[0165] 流速：2. OmT ,/mi η
[0166] 检测波长：280nm
[0167] 运行时间：35minutes
[0168] 进样：重复3次，每次IOOyg
[0169] 梯度时间表列于表2中。
[0170] 表2 :Pro A柱的梯度时间表
[0171]
[0172] dSEC-HPLC (AAB UDB 分析）
[0173] 变性SEC-HPLC如下法进行。用于变性SEC测定的样品的预处理涉及最终浓度为 200 μ g/mL蛋白，3M胍盐酸盐和IOOmM pH 7. 4的Tris的试剂/样品混合物。样品在80°C 加热20min，同时在整个转化过程中混合。对于本试验，采用了 2个对照来确定UDB水平。 用具有低和高水平Μ)Β的内标作为对照。
[0174] 色谱/分析条件如下：
[0175] 柱：Tosoh BioS印 G3000SWxl
[0176] 柱温：室温
[0177] 流动相：3M 胍盐酸盐，25mM NaPO4, pH 6. 8
[0178] 梯度：等梯度
[0179] 流速：0· 5mT ,/mi η
[0180] 检测波长：280nm
[0181] 运行时间：50min
[0182] 进样：50 μ L (IOyg)，重复 3 次
[0183] 实施例1 :用于去除IRT的洗涤缓冲液的对比（AAB)
[0184] 在本实施例中，含有单克隆抗体AAB的不纯溶液通过吸附到A蛋白柱上，然后用含 有CaCl2, MgCl2, NaCl或丙二醇的洗涤缓冲液进行第一次洗涤而得到纯化。
[0185] 含有单克隆抗体的培养物用与GE Healthcare AKTA FPLC色谱系统相连的 rmp A蛋白Sepharose? FF柱（8. 9mL)进行小规模纯化。试验1中所述所有rmp A蛋白 Sepharose? FF色谱步骤均采用下列条件（例外情况在单独的实验说明中指出）。
[0186] 柱尺寸-1.0 cmX 11. 4cm
[0187] 操作流速 _150cm/hr
[0188] 平衡 l-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0189] 冲洗 _2〇mM Tris，I5OmM NaCl，pH 7· 5 (I 倍柱体积）
[0190] 洗涤I-可变（见表3)，但I号运行除外，其未进行洗涤I
[0191] 洗涤 2-20mM Tris，1.0 M NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0192] 洗涤 3-10mM Tris，75mM NaCl，pH 7· 5 (7 倍柱体积）
[0193] 洗脱-50mM 甘氨酸，75mM NaCl，pH 3. I (6 倍柱体积）
[0194] 净化l-20mM枸橼酸钠 ，pH 2. 7 (5倍柱体积）
[0195] 净化2-6M胍盐酸盐（2倍柱体积）
[0196] 净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0197] 保存-16 %乙醇（5倍柱体积）
[0198] 运行温度：2_8°C
[0199] rmp A 蛋白 S印ahrose? FF 柱用 5 倍体积的 pH 7. 5,含 150mM NaCl 的 20mM Tris 平衡。以约IOmg产物/mL树脂的量向该柱上样。上样后，用1倍体积的平衡缓冲液冲洗和 5倍体积的洗涤1的溶液洗涤。所测试的所有洗涤1的溶液都在表3中概述。除1号运行 外，所有运行都包括洗涤1。洗涤1之后，用5倍体积的pH 7. 5,含1.0 M NaCl的20mM Tris 和 7 倍体积的 pH 7. 5,含 75mM NaCl 的 IOmM Tris 洗涤。用 pH 3. 1，含 75mM NaCl 的 50mM 甘氨酸将单克隆抗体从柱中洗脱出来。然后产物池用pH 8. 5的2M Tris中和至7. 9-8. 1。 然后将柱净化，洗涤和保存。表3列出了由不同运行得到的产物池中所存在的IRT类和LMW 的水平。
[0200] 表3 :不同洗涤1的缓冲液的IRT和LMW值
[0201]
[0202] 结果显示，氯化镁和氯化钙洗涤降低了 IRT和LMW类的水平，而氯化钠和丙二醇洗 涤未减少IRT或LMW类。
[0203] 实施例2 :用A蛋白色谱结合0&(：12洗涤去除IRT
[0204] 在本实施例中，用A蛋白色谱和0&(：12洗涤进行了大规模的抗体纯化，以除去IRT 类。
[0205] 含有单克隆抗体的培养物用与Millipore K-Prime 400色谱系统相连的 MabSelect A蛋白柱（2. 4L)进行中试规模的纯化。如下文所述完成两次MabSelect运行。
[0206] 柱尺寸-13cmX 18cm
[0207] 操作流速-150cm/hr，300cm/hr
[0208] 平衡 l-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7· 5 (5 倍柱体积）
[0209] 冲洗-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7· 5 (2 倍柱体积）
[0210] 洗涤 1-1 号运行，50mM Tris，2M CaCl2, pH 7· 5 ;2 号运行无洗涤 I
[0211] 洗涤 2-20mM Tris，1.0 M NaCl，pH 7· 5 (5 倍柱体积）
[0212] 洗涤 3-10mM Tris，75mM NaCl，pH 7· 5 (5 倍柱体积）
[0213] 洗脱-50mM 甘氨酸，25mM NaCl，pH 3. I (6 倍柱体积）
[0214] 净化 l-50mM 甘氨酸，0· 5M NaCl，pH 2· 7 (5 倍柱体积）
[0215] 净化2-6Μ胍盐酸盐（2倍柱体积）
[0216] 净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5 倍柱体积）
[0217] 保存-16 %乙醇（5倍柱体积）
[0218] 运行温度：2_8°C
[0219] MabSelect A 蛋白柱用 5 倍柱体积的 pH 7. 5,含 150mM NaCl 的 20mM Tris 平衡。 然后该柱以约IOmg产物/mL树脂的量上样。然后用2倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，5倍柱 体积的洗涤1的溶液洗涤。对于运行1，该洗涤1的溶液由50mM Tris，2. OM CaCl2组成， pH为7. 5,对于运行2,则将此步完全删去。洗涤1之后，用5倍柱体积的pH 7. 5,含1.0 M NaCl 的 50mM Tris 和 5 倍柱体积的 pH 7· 5,含 75mM NaCl 的 IOmM Tris 洗涤。用 pH 3· 1， 含25mM NaCl的50mM甘氨酸将单克隆抗体从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然后产物 池用pH 8. 5的2M Tris中和至7. 8-8. 2。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表4。
[0220] 表4 :有或无氯化钙洗涤的中试规模运行的％ IRT水平
[0221]
[0222] 结果显示，在中试规模下，氯化钙洗涤从产物池中去除了 IRT。
[0223] 实施例3 : IRT的去除（IMA)
[0224] 本实施例中对与实施例1中所用不同的单克隆抗体（IM)进行了采用CaCl2洗涤 的小规模纯化。
[0225] 含有不同单克隆抗体（IMA)的培养物用与GE Healthcare AKTA Explorer色谱 系统相连的MabSelect A蛋白柱（17. 3mL)进行小规模纯化。如下文所述完成运行。
[0226] 柱尺寸-I. IcmX 18. 2cm(17. 3mL)
[0227] 操作流速 _300cm/hr
[0228] 平衡 l-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5. 1 倍柱体积）
[0229] 洗涤 l-20mM Tris，IM NaCl，pH 7· 5 (5 倍柱体积）
[0230] 洗涤 2-50mM 乙酸钠，0· 6M CaCl2, pH 5· 0 (5 倍柱体积）
[0231] 洗涤 3-50mM Tris，5mM NaCl，pH 7· 5 (3 倍柱体积）
[0232] 洗涤 4-10mM Tris，5mM NaCl，pH 7· 5 (5 倍柱体积）
[0233] 洗脱-50mM 甘氨酸，5mM NaCl，pH 3· 0 (5 倍柱体积）
[0234] 净化-6Μ胍盐酸盐（5倍柱体积）
[0235] 净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (6 倍柱体积）
[0236] 保存-16 %乙醇（5倍柱体积）
[0237] 运行温度：18_24°C
[0238] MabSelect A蛋白柱用5倍柱体积的pH 7. 5,含IM NaCl的20mM Tris平衡。然后 该柱以约45mg产物/mL树脂的量上样。然后如下洗涤该柱：5倍柱体积的pH 7. 5,含1.0 M NaCl的20mM Tris，5倍柱体积的pH 5. 0,含(λ 6M CaClJ^ 50mM乙酸钠，3倍柱体积的pH 7. 5,含 5mM NaCl 的 50mM Tris 和 5 倍柱体积的 pH 7. 5,含 5mM NaCl 的 IOmM Tris。用 pH 3.0,含5mM NaCl的50mM甘氨酸将产物从MabSelect A蛋白柱中洗脱出来。然后产物池用 pH 8. 0的2M Tris中和至7. 7。然后将柱净化，洗涤和保存。结果见表5,其提供了上样样 品和峰样品中IRT类的水平。
[0239] 表5 :有CaCl2洗涤的运行中上样样品和峰样品的％ IRT
[0240]
[0241] 结果显示，(λ 6M的CaCl2洗涤使IRT减少了 5倍。
[0242] 实施例4 :宿主细胞蛋白的去除（IMA)
[0243] 本实施例中，检验了 CaCl2洗涤从含有IMA单克隆抗体的制品中除去宿主细胞蛋 白（HCP)的能力。
[0244] 含有所述单克隆抗体的培养物用与GE HealthcareAKTA FPLC色谱系统相连的 MabSelect A蛋白柱（19mL)进行小规模纯化。如下文所述完成两次MabSelect运行。
[0245] 柱尺寸-I. IcmX 20.0 cm(19mL)
[0246] 操作流速 _300cm/hr
[0247] 平衡 l-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (5. 0 倍柱体积）
[0248] 洗涤 l-20mM Tris，IM NaCl，pH 7· 5 (5 倍柱体积）
[0249] 洗涤2-50mM乙酸钠，(λ 6M CaCl2, pH 5· 0 (5倍柱体积；只用于运行2)
[0250] 洗涤 3-50mM Tris，5mM NaCl，pH 7. 5 (2 倍柱体积）
[0251] 洗涤 4-10mM Tris，5mM NaCl，pH 7· 5 (5 倍柱体积）
[0252] 洗脱-50mM 甘氨酸，5mM NaCl，pH 3· 0 (5 倍柱体积）
[0253] 净化-6Μ胍盐酸盐（5倍柱体积）
[0254] 净化洗涤-20mM Tris，150mM NaCl，pH 7. 5 (6 倍柱体积）
[0255] 保存-16 %乙醇（5倍柱体积）
[0256] 运行温度：18-24 °C
[0257] MabSelect A 蛋