如下的DNA，其包含处于调节元件（例如启动子）控制之下或者与 之可操作连接的基因。表达载体可以含有一个或多个这样可操作连接的基因/调节元件组 合。载体可以处于质粒的形式，并可单独使用或者与其它质粒组合使用，从而提供使用如本 文所述的转化方法转化的细胞，将转基因整合到植物细胞的遗传材料中。
[0122] 植物表达载体可以包括至少一个遗传标记，至少一个遗传标记与调节元件（例如 启动子）可操作连接，调节元件允许通过负选择（即，抑制不含可选择标记基因的细胞的生 长）或者正选择（即，筛选由该遗传标记编码的产物）回收含有该标记的转化细胞。许多 适合于植物转化的可选择标记基因是转化领域中众所周知的，例如，有的基因编码的酶可 以将选择性化学剂如抗生素或除草剂代谢解毒，有的基因编码对抑制剂不敏感的改变的靶 物。有正选择方法也是本领域已知的。在一些实施方案中，适合用于植物转化的可选择标记 基因可以包括：处于植物调节信号控制之下的新霉素磷酸转移酶II (nptn)基因，其赋予 卡那霉素抗性（参见，例如，Fraley et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803); 潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性（参见，例如，Van den Elzen et al. (1985)Plant Mol.Biol.，5:299);细菌来源的赋予对抗生素的抗性的标记基因，包括 庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3' -腺苷酸转移酶，和博来霉素抗性 决定子（参见 Hayford et al. (1988)Plant Physiol. 86:1216 ;Jones et al. (1987)Μο1· Gen. Genet. 210:86 ；Svab et al. (1990)Plant Mol. Biol. 14:197 ；and Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171);赋予对除草剂如草甘膦、草按膦或溴苯腈抗性的标记基因 （Comai et al. (1985)Nature 317:741-744 ；Gordon-Kamm et al. (1990)Plant Cell 2:603-618； and Stalker et al. (1988) Science 242:419-423);和非细菌来源的标记基因，包括例如 小鼠二氢叶酸还原酶，植物5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶，和植物乙酰乳酸合酶（参见 Eichholtz et al. (1987)Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 ；Shah et al. (1986)Science 233:478 ；and Charest et al. (1990)Plant Cell Rep. 8:643)〇
[0123] 适合于植物转化的另一类标记基因需要对推测的转化植物细胞进行筛选，而非 直接遗传选择对毒性物质（例如抗生素）具有抗性的转化细胞。这些基因可能特别有 用于定量或可视化基因在特定组织中表达的空间模式，并且它们常被称作报告基因，因 为它们能够与基因或基因调节序列融合，用于研宄基因表达。普遍用于筛选转化细胞的 基因包括β-葡糖醛酸糖苷酶（⑶S)，β-半乳糖苷酶，萤光素酶，和氯霉素乙酰转移酶。 见 Jefferson(1987)Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 ;Teeri et al. (1989)EMBO J. 8:343; Koncz et al.(1987)Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A. 84:131;和 DeBlock et al. (1984)EMBO J. 3:1681。可以获得用于在体内观察⑶S活性而无需破坏植物组织的方法。Molecular Probes publication 2908 (1993) IMAGENEGREEN?，第 1-4 页；和 Naleway et al. (1991) J.Cell Biol. 115:151。编码荧光蛋白（例如GFP，EGFP，EBFP，ECFP，和YFP)的基因也被用 作原核生物和真核生物中基因表达的标记。见Chalfie et al.(1994)Science 263:802。 因此，荧光蛋白和荧光蛋白的突变体可以用作可筛选标记。
[0124] 植物表达载体中包含的编码序列的表达可以被包含调节元件（例如启动子）的核 苷酸序列驱动。可用于植物细胞的多种类型的启动子当前在转化领域中是众所周知的，其 它可以单独使用或者与这些启动子组合使用的调节元件亦是如此。
[0125] 术语"启动子"是指可以位于转录起始的上游并可以参与RNA聚合酶和其它引发 转录的蛋白质的识别和结合的DNA区域。"植物启动子"可以是能够在植物细胞中引发转 录的启动子。处于发育控制之下的启动子的实例包括优先在某些组织中，例如在叶、根、种 子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织中引发转录的启动子。这样的启动子被称为"组织 优选的"。仅在某些组织中引发转录的启动子被称为"组织特异的"。"细胞类型特异的"启 动子主要在一个或多个器官的某些细胞类型中，例如根或叶中的脉管细胞中驱动表达。"可 诱导的"启动子是可以处于环境控制之下的启动子。可能影响可诱导启动子的转录的环境 条件的实例包括，但不仅限于，厌氧条件或光的存在。组织特异的、组织优选的、细胞类型特 异的、和可诱导的启动子构成了"非组成型"启动子类别。"组成型"启动子是在大多数环境 条件下和在大多数组织和细胞类型中均活跃的启动子。
[0126] 可诱导启动子可以与本发明的用于细胞内表达的优化核苷酸序列可操作连 接。任选地，可诱导启动子可以与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，后者可以与 本发明的用于细胞内表达的核苷酸序列操作连接。与可诱导启动子可操作连接的核 苷酸序列的转录速度可能响应于诱导剂而增加。任何可诱导启动子均可用在本发明 中。见 Ward et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。示例性的可诱导启动子包 括，但不仅限于：来自响应于铜的ACEI系统的启动子^6?6七&1.(1993)?1'〇(：.似七1· Acad. Sci. U. S. A. 90:4567-71);来自响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米In2基因 (Hershey et al. (1991)Mol. Gen Genetics 227:229-37 ;和 Gatz et al. (1994)Mol. Gen. Genetics 243:32-8);和来自 TnlO 的 Tet 抑制子（Gatz et al. (1991)Mol. Gen- Genetics 227:229-37)。 特别有用的可诱导启动子可以是对植物通常不响应的诱导剂产 生响应的启动子。示例性的可诱导启动子可以是来自类固醇激素基因的可诱导启动子， 其转录活性受到糖皮质类固醇激素的诱导。Schena et al.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:10421-5。
[0127] 或者，组成型启动子可以与本发明的用于细胞内表达的优化核苷酸序列可操 作连接，或者组成型启动子可以与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，后者可以与 本发明的用于细胞内表达的核苷酸序列可操作连接。不同的组成型启动子可用于本发 明。示例性的组成型启动子包括，但不仅限于：来自植物病毒的启动子，例如来自CaMV 的35S启动子（Odell et al.(1985)Nature313:810-2);来自水稻肌动蛋白基因的启动 子（McElroy et al. (1990)Plant Cell2:163-71);泛素 （Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-32;和Christensen et al. (1992)Plant Mol. Biol. 18:675-89); pEMU(Last et al. (1991)Theor. Appl. Genet. 81:581-8) ；MAS(Velten et al. (1984)EMBO J.3:2723-30);和玉米 H3 组蛋白（Lepetit et al. (1992)Mol. Gen. Genetics 231:276-85; 和 Atanassova et al. (1992)Plant Journal 2(3) :291-300)。ALS 启动子，欧洲油菜 ALS3 结构基因5'的Xbal/Ncol片段（或与Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列），是特别有用的 组成型启动子的代表。见国际PCT公开No. WO 96/30530。
[0128] 作为替代，组织特异性启动子可以与本发明用于在细胞内表达的优化核苷酸序 列可操作连接。任选地，组织特异性启动子可以与编码信号序列的核苷酸序列可操作连 接，后者可以与本发明的用于细胞内表达的核苷酸序列可操作连接。用与组织特异性启 动子可操作连接的本发明优化核苷酸序列转化的植物可以仅在、或者优先在特定的组织 中产生该核苷酸序列的蛋白产物。任何组织特异的或组织优选的启动子均可用于本发 明。示例性组织特异的或组织优选的启动子包括，但不仅限于：种子优选的启动子，例如 来自菜豆蛋白（phaseolin)基因的启动子（Murai et al. (1983)Science 23:476-82; 和 Sengupta-Gopalan et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 82:3320-4);叶特异 性和光诱导的启动子，例如来自cab或rubisco的启动子（Simpson et al.(1985)EMB0 J. 4(11) :2723-9;和 Timko et al.(1985)Nature 318:579-82);花药（anther)特异性启 动子，例如来自 LAT52 的启动子（Twell et al. (1989)Mol.Gen.Genetics217:240-5);花 粉特异性启动子，例如来自Zml3的启动子（Guerrero et al. (1993)Mol.Gen.Genetics 244:161-168);和小孢子（microspore)特异性启动子，例如来自apg的启动子（Twell et al. (1993)Sex. Plant Reprod. 6:217-224)〇
[0129] 从本发明的优化核苷酸序列表达的多肽向亚细胞区室，例如叶绿体、液泡、过氧化 物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁、或线粒体的转移，或者转移以供分泌到质外体（apoplast) 中，可以通过将编码信号序列的核苷酸序列与编码该多肽的序列的5'和/或3'区可操 作连接来实现。结构基因5'和/或3'端的靶定序列可以在蛋白合成和加工过程中决定 所编码的蛋白质可能最终被区室化（compartmentalized)在何处。或者，亚细胞区室革巴 定蛋白可以直接与纳米微粒连接，从而指导用感兴趣分子包被的纳米颗粒进入期望的亚 细胞区室。许多信号序列是本领域已知的。参见例如Becker et al. (1992)Plant Mol. Biol. 20:49 ;Close，P. S. (1993)Master' s Thesis, Iowa State University ;Knoxet al. (1987)Plant Mol. Biol. 9:3-17 ；Lerner et al. (1989)Plant Physiol. 91:124-129 ； Fontes et al. (1991)Plant Cell 3:483-496 ；Matsuoka et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A. 88:834 ；Gould et al. (1989) J. Cell. Biol. 108:1657 ；Creissen et al. (1991) Plant J.2:129;Kalderonet al. (1984)Cell 39:499-509;和 Steifelet al. (1990)Plant Cell2:785-793〇
[0130] 鉴于上述情况，应当理解，适用于本发明实施方案中的表达宿主可以是单细胞原 核生物或真核生物，但也可以是多细胞生物。表达宿主可以，例如，选自下组：细菌；藻类； 真菌（例如，酵母）；昆虫细胞；植物细胞（例如，玉米、大豆和欧洲油菜）；动物细胞；杆状 病毒；哺乳动物组织培养物；植物组织培养物；和全植物（例如，欧洲油菜）。在表达宿主是 多细胞生物（例如，植物）的实施方案中，可以将载体或DNA构建体导入到多细胞生物的一 个或多个细胞内，并在其中表达。在一些实例中，可以从包含导入的载体或DNA构建体的多 细胞生物的一个或多个细胞产生整个生物。例如，从用感兴趣的核酸分子转化的植物细胞 再生整个植物并随后选择基因组中整合有该核苷酸分子的植物的方法，是本领域已知的。
[0131] 包含导入的载体或DNA构建体的表达宿主细胞可以在合适的培养基中生长（例如 发酵）。在细胞生长到合适密度之后，可以收获细胞、裂解，并可以根据物理和化学特性对表 达产物进行分离。在一些实施方案中，表达产物可能在含水培养基中在中等温度下是不溶 的，并可以在略微提高的温度下通过去污剂提取进行纯化。参见美国专利5, 235, 041。视情 况，随后可使用粗表达产物或纯化的表达产物以实现预期的目的。
[0132] 本发明的实施方案允许表达任何感兴趣多肽。在一些实例中，感兴趣多肽本身可 能适合应用（例如聚合物）。在其它实例中，在宿主内表达感兴趣多肽可能是为了产生其 他期望的多肽、小分子或其他物质（例如酶），或者在宿主内导入期望的表型。在特定的 实例中，感兴趣多肽可以是：通常不在表达宿主的细胞中出现的蛋白；农艺基因产物；赋予 对害虫或疾病抗性的多肽；苏云金杆菌蛋白；凝集素；维生素结合蛋白（例如，抗生物素蛋 白）；酶抑制剂；昆虫特异性激素或信息素；对特定生物特异的肽或神经肽；毒液；负责单 萜、倍半萜烯、类固醇、羟肟酸、苯丙衍生物或其他非蛋白分子的超积累的酶；参与生物活性 分子（例如参与ω-3脂肪酸合成的酶）的修饰，包括翻译后修饰的酶；信号转导分子或促 进信号转导的分子（例如，钙调蛋白）；疏水运动肽；膜通透酶，转运子、或通道；通道构成 剂（channel former)或通道阻断剂；病毒侵入蛋白或由其衍生的复杂毒素；抗体或免疫毒 素（例如，病毒特异性抗体）；发育阻滞（arrestive)蛋白；赋予对除草剂、杀真菌剂或其它 有害小分子的抗性的多肽；支架蛋白；以及被设计为具有特定功能（例如可归因于氨基酸 重复区的功能，例如结合特性或物理特性）的人造多肽。在一些实施方案中，感兴趣多肽可 以来自自然界。在其他实施方案中，感兴趣多肽可以是通常不会出现在自然界中的多肽。
[0133] 在一些实施方案中，可以产生两个或多个通过使用不同参数进行序列优化产生的 不同候选序列（例如，其密码子用法不同的序列），并测试以确定它们是否具有所期望的性 质。可以评估候选序列，以便例如搜索调节元件如沉默子或增强子的存在，或者搜索在编码 序列中可以通过改变密码子用法而转变成这类调节元件的区域的存在。额外的标准可以包 括：特定的核苷酸（例如A，C，G或U，对特定氨基酸的密码子偏好）的富集或减少，或者特 定mRNA二级或三级结构的存在或不存在。可以根据这些标准调整候选序列用于进一步的 表达。
[0134] 可以实验性地构建并评估有希望的候选序列。可以彼此独立地评估多个候选物； 或者该过程可以是迭代性的，通过使用最有希望的候选物作为新起点，或者将两个或多个 候选物的区域合并，从而产生新的杂交体。后续轮次的修饰和评估可能是理想的。
[0135] VI.包含趋异、密码子优化的核酸序列的遗传修饰生物
[0136] 本公开还提供了包含趋异、密码子优化的核酸序列的遗传修饰生物。在一些实施 方案中，这样的生物可以包括编码包含氨基酸重复区的感兴趣多肽的人造优化核酸序列。 编码包含氨基酸重复区的感兴趣多肽的人造优化核酸序列可以和对生物而言适当的调节 序列（例如启动子）可操作连接，如前文提出的。在特定的实施方案中，生物可以表达所述 感兴趣多肽。在某些实施方案中，所述感兴趣多肽可以从本发明的优化核酸序列表达，其表 达水平可以是由编码相同多肽但没有被优化的核酸序列表达的至少105%，110%，150%，2 00%，500%，1，000%，5, 000%或者甚至 10, 000%。
[0137] 在一些实施方案中，包含趋异的、密码子优化的核酸序列的遗传修饰生物是经过 遗传修饰的植物，其中该遗传修饰植物的至少一些细胞包含一个或多个本发明的人造优化 核酸。